抗鐮孢菌根腐類病害復合微生物菌劑培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝優(yōu)化

馬佳勇，李雪萍*，李建軍，漆永紅，許世洋

（1.甘肅省農業(yè)科學院 植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學 草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020）

復合微生物菌劑是一種具有多種功能的生物活菌制劑，其不僅可以分泌抑菌物質防治植物病害，還可以通過溶磷、固氮、解鉀等特性，提升土壤養(yǎng)分，提高作物產量[1-2]。由于農田環(huán)境復雜、氣候多變，單一菌劑的促生功能難以發(fā)揮理想效果[3]，而多菌株構建的復合菌劑種類多樣、功能齊全、效果良好[4-5]。耐鹽堿菌劑可以有效調節(jié)細胞生理和分子機制，緩解鹽堿對植物的脅迫，改善土壤結構和保水能力，提升土壤有機質，促進植物根系生長[6]。王海霞等[7]研究表明，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）制劑對燕麥炭疽病的田間防治效果高達75.27%，同時促進燕麥株高增加22%，鮮質量增加47%。DENG L等[8]研究表明，采用微生物菌劑和植被聯(lián)合改良的手段，可以顯著提高有機質、堿解氮、速效磷及速效鉀含量，促進了紫花苜蓿和黑麥草的生長。因此，耐鹽堿、防病、促生菌劑的開發(fā)具有廣泛的應用價值。

微生物菌劑大面積推廣需要具備活性高、儲存久的特點，優(yōu)化發(fā)酵條件及培養(yǎng)基成分可以提高菌劑的生物量和活性，降低生產成本[9-10]。不同環(huán)境中分離篩選到的微生物對營養(yǎng)成分及生長條件的要求不同，將菌株混合時難以控制培養(yǎng)條件、碳源、氮源等因素。而正交試驗將多因素多水平的復雜問題簡單化，從而高效篩選出最優(yōu)條件[11]。李彩聯(lián)等[12]通過正交試驗優(yōu)化得到高產漆酶菌株的發(fā)酵條件為5%接種量、15%通氧量、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間120 h，菌株漆酶活性達9 522 U/g，是優(yōu)化前的2.06倍。黎燕珊等[13]對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HC-8發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明，在pH 6.0、轉速180 r/min、裝液量20 mL/300 mL的條件下，菌株HC-8對白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用顯著提升。CHEN Z M等[14]研究表明，改良培養(yǎng)基成分為16.18 g/L玉米浸膏、17.53 g/L大豆粉、8.14 g/L酵母浸膏時，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）孢子數(shù)顯著提升。

我國鹽堿土面積廣泛，土壤鹽堿化問題日益加劇[15]。同時由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）引起的根腐病等土傳病害導致番茄[16]、辣椒[17]、枸杞[18]等經濟作物嚴重減產。因此，本研究針對前期分離、組合、優(yōu)化的具有耐鹽堿、防病、促生的復合微生物菌劑A8（4%枯草芽孢桿菌F14、6%高地芽孢桿菌MX27、8%高地芽孢桿菌MX38、2%枯草芽孢桿菌MX50、2%解淀粉芽孢桿菌MX66、2%解淀粉芽孢桿菌MX69）為研究對象，采用單因素試驗和正交試驗對復合微生物菌劑培養(yǎng)基成分及發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以復合菌劑生物量、固氮量、解鉀量、溶有機磷量、溶無機磷量和抑菌率為考察指標，采用Topsis綜合評價法確定最佳培養(yǎng)條件，以期為新型復合微生物菌劑的生產實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

復合菌劑A8（4%枯草芽孢桿菌、6%高地芽孢桿菌、8%高地芽孢桿菌、2%枯草芽孢桿菌、2%解淀粉芽孢桿菌、2%解淀粉芽孢桿菌）、腐皮鐮孢菌3-4、尖孢鐮刀菌45-3：本實驗室保藏。供試菌株特性見表1。

表1 供試菌株特性Table 1 Characteristics of the tested strain

表2 種子培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for seed medium compositions optimization

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation medium compositions optimization

1.1.2 試劑

Ca3（PO4）2、NaCl、KCl和MnSO4·4H2O：上海啟仁化工有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、CaCO3、（NH4）2SO4、MnSO4、KH2PO4和KNO3：浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaMoO4·2H2O、NaH2PO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·7H2O：武漢卡洛斯科技有限公司；瓊脂、蔗糖、酵母粉、鉀長石、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨：阿勒山生物科技有限公司；生物素、溴百里酚藍、孟加拉紅、可溶性淀粉、硝酸鉀、卵磷脂、鏈霉素和蘋果酸：上海源葉生物科技有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 供試培養(yǎng)基[19]

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15～20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

蒙金娜無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，NaCl 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO40.03 g/L，F(xiàn)eSO40.003 g/L，Ca3（PO4）25 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

蒙金娜有機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，KCl 0.3 g/L，NaCl 0.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）210 g/L，瓊脂粉15～18 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

無氮培養(yǎng)基：蘋果酸5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.02 g/L，NaCl 0.1 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.002 g/L，溴百里酚藍5 mL/L，KOH 4.5 g/L，生物素10 μg/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

鉀長石培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，鉀長石2.5 g/L，Na2HPO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaCO35.0 g/L，CaSO4·7H2O 0.1 g/L，瓊脂20.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

所有培養(yǎng)基均于115 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

5804R型離心機：德國Eppendorf公司；RXZ型智能人工氣候箱、CXZ型智能光照培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；LabTech型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HZQ-F100型全溫振蕩培養(yǎng)箱：蘇州培英實驗設備有限公司；SpectraMax Plus384 型單功能光吸收酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；Azure C300型化學發(fā)光成像系統(tǒng)：美國Azure公司；6400A型火焰光度計：上海精密儀器儀表有限公司；QSY-1型凱氏定氮儀：北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)基成分優(yōu)化

單因素試驗：將LB培養(yǎng)基中的酵母提取物替換成不同的碳源（0.5%乳糖、0.5%蔗糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%麥芽糖）、將胰蛋白胨替換成不同氮源（1%酵母浸出膏、1%NaNO3、1%（NH4）2SO4、1%NH4Cl）、將NaCl替換成不同無機鹽（1%CaCl2、1%MgSO4、1%MnSO4、1%CuSO4），每個處理3次重復。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下培養(yǎng)后，測定復合菌液的OD600nm值、固氮量、解鉀量、溶磷量和抑菌率，測定方法參考許世洋等[20]，進行Topsis綜合分析，根據(jù)綜合得分指數(shù)（composite score index，CI）確定種子培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源和無機鹽。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗結果，以綜合得分指數(shù)（CI）為考察指標，以酵母浸出膏添加量（A）、乳糖添加量（B）和MgSO4添加量（C）為考察因素，進行3因素4水平（L16（43））的正交試驗設計，確定最佳種子培養(yǎng)基組分。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

單因素試驗：將LB培養(yǎng)基中的酵母提取物替換成不同的碳源（0.5%土豆淀粉、0.5%玉米淀粉、0.5%豆餅粉、0.5%甘露醇）、將胰蛋白胨替換成不同氮源（1%酵母粉、1%玉米漿、1%尿素、1%花生餅粉）、將NaCl替換成不同無機鹽（1%CaCl2、1%MgSO4、1%MnSO4、1%CuSO4），每個處理3次重復。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下培養(yǎng)后，計算綜合得分指數(shù)（CI），確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和無機鹽。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗結果，以綜合得分指數(shù)（CI）為考察指標，以玉米漿添加量（A）、豆餅粉添加量（B）和CaCl2添加量（C）為考察因素，進行3因素4水平（L16（43））的正交試驗設計，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

在pH為7、接種量為1%、轉速160 r/min、溫度30 ℃、發(fā)酵時間36 h的基礎上[19-20]，以綜合得分指數(shù)（CI）為考察指標，以pH（A）、接種量（B）、轉速（C）、培養(yǎng)溫度（D）和培養(yǎng)時間（E）為考察因素，進行5因素4水平（L16（45））的正交試驗設計，確定最佳發(fā)酵工藝，試驗因素與水平見表4。

表4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.4 分析檢測

菌株生長特性：采用酶標儀測定培養(yǎng)液的OD600nm值[29]；固氮量：采用凱氏定氮法測定[20]；解鉀量：采用火焰光度計法測定[20]；溶磷量：采用鉬銻抗比色法[20]；抑菌率：采用牛津杯法[20]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進行原始數(shù)據(jù)整理，SPSS 24.0進行方差分析，DPS 15.10進行Topsis綜合評價分析。

2 結果與分析

2.1 種子培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源的確定

碳源直接影響菌株生長和代謝產物的積累，是菌株生長所需的主要營養(yǎng)物質[21]。種子培養(yǎng)基碳源對各指標的影響見圖1。由圖1可知，乳糖作為單一碳源時，復合菌系生長濃度、固氮量、溶磷量及抑菌率顯著高于其他處理（P＜0.05）；可溶性淀粉作為單一碳源時，復合菌系解鉀量最高，組間差異顯著（P＜0.05）。由此可見，不同碳源下復合菌系各能力有所差異，究其原因可能與碳源的物理性質及微生物代謝途徑的多樣性有關[22]。通過Topsis綜合分析，乳糖作為單一碳源時，其綜合得分指數(shù)（CI）為0.92，綜合能力最強。因此，選用乳糖為種子培養(yǎng)基碳源。

圖1 種子培養(yǎng)基中碳源對各指標的影響Fig.1 Effect of carbon source of seed medium on each indexes

2.1.2 氮源的確定

不同的微生物對氮源的需求不同[23]，種子培養(yǎng)基氮源對各指標的影響見圖2。由圖2可知，以酵母浸出膏作為氮源時，復合菌系固氮量最高，組間差異顯著（P＜0.05）；以NaNO3作為氮源時，復合菌系抑菌率最高；以（NH4）2SO4作為氮源時，復合菌系溶無機磷量最高，但與酵母浸出膏、（NH4）2SO4、NH4Cl組間差異不顯著（P＞0.05）；以NH4Cl作為氮源時，復合菌系OD600nm值、解鉀量及溶有機磷量最高，且顯著高于其余處理（P＜0.05）。通過Topsis綜合分析，酵母浸出膏為氮源時，綜合得分指數(shù)（CI）最高，為0.81，其綜合能力最強。由此可見，復合菌系選用有機氮源的效果顯著優(yōu)于無機氮源[24]，因此，選用酵母浸出膏為種子培養(yǎng)基氮源。

圖2 種子培養(yǎng)基氮源對各指標的影響Fig.2 Effect of nitrogen source of seed medium on each indexes

2.1.3 無機鹽的確定

無機鹽可以影響孢子的形成，間接影響菌劑功能特性[25]，種子培養(yǎng)基氮源對各指標的影響見圖3。由圖3可知，當無機鹽選用MgSO4時，復合菌系OD600nm值、解鉀量、溶有機磷量及溶無機磷量高于其他處理；當無機鹽選用MnSO4時，復合菌系固氮量高于其他處理，組間差異顯著（P＜0.05）；當無機鹽選用CaCl2時，復合菌系抑菌率最高。通過Topsis綜合分析，種子培養(yǎng)基無機鹽為MgSO4時，綜合得分指數(shù)（CI）為0.73，其綜合能力最強。因此，選用MgSO4為種子培養(yǎng)基無機鹽。

圖3 種子培養(yǎng)基無機鹽對各指標的影響Fig.3 Effect of inorganic salot of seed medium on each indexes

2.1.4 種子培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結果

種子培養(yǎng)基各成分含量不同將直接影響發(fā)酵液的溶氧量及細胞滲透壓失衡，抑制細胞生長[26-27]。種子培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結果與分析見表5。由表5可知，B8處理溶有機磷能力最強，溶磷量高達517.30 μg/mL；B12處理溶無機磷能力最佳，溶磷量高達777.63 μg/mL；B15處理固氮能力最好，固氮量高達0.26 g/L，且解鉀能力最強，解鉀量高達122.24 mg/L；B16處理生長濃度最高，OD600nm值達到1.72，且抑菌能力最強，抑菌率高達63.54%。通過Topsis綜合分析，B15處理以0.79的綜合得分指數(shù)（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，種子培養(yǎng)基選用2%酵母浸出膏、1%乳糖、1%MgSO4。

表5 種子培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for seed medium compositions optimization

2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 碳源優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源對各指標的影響見圖4。由圖4可知，甘露醇作為單一碳源時，復合菌系生長濃度最好，組間差異顯著（P＜0.05）；豆餅粉作為單一碳源時，發(fā)酵復合菌系固氮、解鉀、溶有機磷、溶無機磷能力均優(yōu)于其他處理，組間差異顯著（P＜0.05）；玉米淀粉作為單一碳源時，發(fā)酵復合菌系抑菌特性最優(yōu)。通過Topsis綜合分析，豆餅粉以0.70的綜合得分指數(shù)（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，選用豆餅粉為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源對各指標的影響Fig.4 Effect of carbon source of fermentation medium on each indexes

2.2.2 氮源優(yōu)化

如圖5所示，以玉米漿作為氮源時，發(fā)酵復合菌系OD600nm值最高，且溶無機磷能力及抑菌功能最優(yōu)，組間差異顯著（P＜0.05）；以酵母粉作為氮源時，發(fā)酵復合菌系固氮量及解鉀量最高，組間差異顯著（P＜0.05）；以尿素作為氮源時，發(fā)酵復合菌系溶有機磷能力最強，組間差異不顯著（P＜0.05）。通過Topsis綜合分析，玉米漿以0.72的綜合得分指數(shù)（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，選用玉米漿為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源對各指標的影響Fig.5 Effect of nitrogen source of fermentation medium on each indexes

2.2.3 無機鹽篩選

如圖6所示，當無機鹽選用MgSO4時，發(fā)酵復合菌系OD600nm值最高，組間差異顯著（P＜0.05）；當無機鹽選用CaCl2時，發(fā)酵復合菌系固氮、解鉀、溶磷及抑菌特性均最優(yōu)，組間差異顯著（P＜0.05）。通過Topsis綜合分析，CaCl2以0.95的綜合得分指數(shù)（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，選用CaCl2為發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽。

圖6 發(fā)酵培養(yǎng)基中無機鹽對各指標的影響Fig.6 Effect of inorganic salt of fermentation medium on each indexes

2.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

如表6所示，不同含量的玉米漿、豆餅粉、CaCl2對發(fā)酵復合菌系的特性均有影響，各處理之間差異顯著（P＜0.05）。C9處理固氮能力、溶有機磷、抑菌能力均最好，其固氮量為0.23 g/L，溶磷量為504.54 μg/mL，抑菌率達60.97%；C11處理解鉀能力最好，解鉀量達105.72 mg/L；C13處理溶無機磷能力最好，溶磷量達728.64 μg/mL；C16處理生長濃度最高，OD600nm值達到1.77。由此可見，不同含量的玉米漿、豆餅粉、CaCl2對復合菌系特性均有影響，通過Topsis綜合分析，C9處理以0.84的綜合得分指數(shù)（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基選用0.1%豆餅粉、1.5%玉米漿、1.5%CaCl2。

表6 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation medium compositions optimization

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

微生物發(fā)酵過程較為復雜，次級代謝物質的合成容易受溫度、pH、轉速、接菌量等因素的影響[28]。如表7所示，其中，D1處理溶有機磷能力最強，其溶磷量為553.74 μg/mL；D2處理生長濃度最高，其OD600nm值為1.06，且溶無機磷能力最強，其溶磷量為822.67 μg/mL；D3處理固氮能力最強，其固氮量為0.24 g/L；D8處理抑菌能力最強，其抑菌率為58.44%；D12處理解鉀能力最強，其解鉀量為121.45 mg/L。由此可見，復合菌系功能特性在不同的發(fā)酵條件下各不相同，究其原因可能與菌劑中各菌株的種屬及生存環(huán)境有關[29]。通過Topsis綜合分析，D3處理的綜合得分指數(shù)（CI）為0.89，綜合能力最強。因此，確定復合菌系的最佳發(fā)酵條件為pH 6、接種量9%、轉速180 r/min、溫度35 ℃、發(fā)酵時間35 h。

表7 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

3 結論

本研究以具有耐鹽堿、防病、促生的復合微生物菌劑為研究對象，通過單因素試驗和正交試驗對復合微生物菌劑發(fā)酵條件、培養(yǎng)基成分及含量進行優(yōu)化。結果表明，復合微生物菌劑最適種子培養(yǎng)基為2%酵母浸出膏、1%乳糖、1%MgSO4；最適發(fā)酵培養(yǎng)基為0.1%豆餅粉、1.5%玉米漿、1.5%CaCl2；最佳發(fā)酵條件為pH 6、接種量9%、轉速180 r/min、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間35 h。此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，復合菌系的OD600nm值為1.38、固氮量為0.23 g/L、解鉀量為101.00 mg/L、溶有機磷量為504.54 μg/mL、溶無機磷量為658.82 μg/mL、抑菌率為60.97%。本研究為復合菌系工業(yè)化生產及推廣提供理論和技術支撐。