L-酪氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

杜麗紅，呂思琪，戰(zhàn)俊杰，2，馬志鵬，馬麗媛，馬 雪，范恒軍，孟天星

（1.綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152000；2.象嶼金谷生化科技有限公司，黑龍江 綏化 152000）

作為芳香族氨基酸之一，L-酪氨酸在人類及動(dòng)物新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，L-酪氨酸缺乏會(huì)使人體在代謝和智力等方面出現(xiàn)異常，同時(shí)以L-酪氨酸為前體物質(zhì)合成的多種衍生物對(duì)帕金森、精神分裂等疾病有著很好的療效[1-2]，此外，L-酪氨酸在食品、化工、飼料等行業(yè)也有著廣泛應(yīng)用[3]。

目前，L-酪氨酸主要依靠提取法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，提取法以干酪素等含蛋白質(zhì)豐富的物質(zhì)為原料，經(jīng)水解、脫色、結(jié)晶等工藝得到L-酪氨酸，但是提取工藝一直存在著原料成本較高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、提取收率低、對(duì)環(huán)境污染較重等問題[4]，近幾年酶法催化制備L-酪氨酸雖然也得到研究[5]，但成本相對(duì)較高，而具有成本低、原料廣泛、環(huán)境污染相對(duì)較小等優(yōu)勢(shì)的微生物發(fā)酵法是目前最具前景的氨基酸生產(chǎn)方式[6-9]。目前，隨著生物技術(shù)和代謝工程的快速發(fā)展，通過合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化微生物的代謝途徑獲得可實(shí)現(xiàn)氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)的高效菌株成為了研究熱點(diǎn)[10-11]。雖然相關(guān)研究不斷取得突破性進(jìn)展，但發(fā)酵周期較長(zhǎng)、發(fā)酵工藝復(fù)雜等問題仍未得到有效解決，目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸的最高產(chǎn)量為55 g/L，但發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)為48 h[12]。在L-酪氨酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建過程中，實(shí)現(xiàn)L-酪氨酸綠色高效生產(chǎn)的關(guān)鍵是對(duì)代謝途徑理性設(shè)計(jì)和調(diào)控機(jī)制的優(yōu)化[13-14]，通過分子生物學(xué)手段獲得具有高效生產(chǎn)L-酪氨酸能力且性狀穩(wěn)定的細(xì)胞工廠[15]。目前，多數(shù)研究將編碼L-酪氨酸合成影響關(guān)鍵酶分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫氫酶（chorismate mutase/prephenate dehydrogenase，TyrA）編碼基因tyrA作為重點(diǎn)研究靶點(diǎn)，tyrA基因解反饋和上調(diào)表達(dá)一直被認(rèn)為是獲得L-酪氨酸生產(chǎn)菌株的必備條件[16-20]，而關(guān)于基因tyrR敲除對(duì)L-酪氨酸積累影響的研究鮮見報(bào)道。

本研究以大腸桿菌（Escherichia coli）TRP1為出發(fā)菌株，通過上調(diào)表達(dá)解除反饋抑制的基因aroGfbr，強(qiáng)化莽草酸途徑，同時(shí)敲除基因tyrR，解除TyrR對(duì)aroG、tyrB、aroF、tyrA、aroL、aroP、tyrP多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄抑制，得到高產(chǎn)L-酪氨酸的重組工程菌株，并以L-酪氨酸產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，充分挖掘菌株生產(chǎn)潛力，進(jìn)一步提高L-酪氨酸產(chǎn)量，為該菌株實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及引物

本研究所用菌株及質(zhì)粒見表1，所用引物及序列見表2。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體LB培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基[21]：葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4·H2O 2mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，VB10.5 mg/L，VH0.5 mg/L。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[21]：葡萄糖20 g/L，酵母粉4 g/L，（NH4）2SO45g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·H2O 20 mg/L，VB14 mg/L，VH8 mg/L，苯酚紅2%。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖（分析純）：西王藥業(yè)有限公司；（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、MnSO4（均為分析純）：天津光復(fù)科技有限公司；VB1、VH（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋氨酸、氨芐青霉素、奇霉素（均為分析純）：上海阿拉丁生物科技有限公司；酵母粉（生化試劑）：英國(guó)OXOID公司；阿拉伯糖（分析純）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；5 L離位滅菌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；BL-75A立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；722可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學(xué)院研究所；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Thermo Scientific公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌TRP1中基因aroGfbr整合至yjiv位點(diǎn)[22]

gRNA-yjiv表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建：兩條單鏈DNA（gRNA-yjivup、gRNA-yjiv-down）經(jīng)退火形成雙鏈DNA，雙鏈DNA包括靶基因的gRNA spacer序列和質(zhì)粒pGRB的同源序列，經(jīng)同源重組酶的作用，將雙鏈DNA與線性化質(zhì)粒pGRB同源重組得到gRNA-yjiv表達(dá)質(zhì)粒。

Ptrc-aroGfbr整合片段構(gòu)建：用于整合的目的基因片段包括上下游同源臂和目的基因三個(gè)片段。以大腸桿菌TRP1的基因組DNA為模板，采用引物對(duì)上游同源臂-aroG-up和上游同源臂-aroG-down、下游同源臂-aroG-up和下游同源臂-aroG-down分別PCR擴(kuò)增得到整合aroG需要的上游同源臂和下游同源臂。以pTrcTAS質(zhì)粒為模板，采用引物對(duì)目的片段-aroG-up和目的片段-aroG-down PCR得到Ptrc-aroGfbr目的基因片段，采用引物對(duì)上游同源臂-aroG-up和下游同源臂-aroG-down對(duì)上游同源臂、Ptrc-aroGfbr目的基因片段和下游同源臂和進(jìn)行重疊PCR，得到Ptrc-aroGfbr整合于yjiv位點(diǎn)的片段。

電轉(zhuǎn)化：將包括200 ng Ptrc-aroGfbr整合片段和100 ng gRNA-yjiv表達(dá)質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化體系電轉(zhuǎn)至細(xì)胞TRP2，經(jīng)電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)入1 mL LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃復(fù)蘇2 h。取100 μL培養(yǎng)液涂布于含有50 μg/mL氨芐青霉素（Ampr）和100 μg/mL奇霉素（Sper）的LB固體培養(yǎng)基平板中，32 ℃培養(yǎng)12 h。

陽性克隆子的篩選：挑選LB固體培養(yǎng)基平板中的單菌落采用引物對(duì)上游同源臂-aroG-up和下游同源臂-aroGdown進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，同時(shí)以出發(fā)菌株E.coliTRP1基因組作為對(duì)照，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因條帶大小，篩選陽性克隆子。

gRNA-yjiv質(zhì)粒的消除：將陽性克隆子接種于含有0.2%阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)12 h，取少量菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，32 ℃培養(yǎng)12 h。將同一個(gè)單菌落先后分別劃線接種于含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板和含有100 μg/mL奇霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，32 ℃培養(yǎng)12 h，挑選表型正確的單菌落，將成功消除gRNA-yjiv質(zhì)粒的菌株命名為TY01。

pREDCas9質(zhì)粒的消除：將成功消除質(zhì)粒gRNA的陽性克隆子接種于LB液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)12 h。取少量菌液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板中，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑選單菌落，并將同一個(gè)單菌落先后劃線接種于含有100 μg/mL奇霉素的LB固體培養(yǎng)基平板和LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑選表型正確的單菌落，得到重組菌株TY02（TRP1，Ptrc-aroGfbr：：yjiv）。

1.3.2 重組菌株TY02基因tyrR的敲除[22]

gRNA-tyrR表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建：兩條單鏈DNA（gRNA-tyrRup、gRNA-tyrR-down）經(jīng)退火形成雙鏈DNA，雙鏈DNA包括靶基因的gRNA spacer序列和質(zhì)粒pGRB的同源序列，經(jīng)同源重組酶的作用，將雙鏈DNA與線性化pGRB同源重組得到gRNA-tyrR表達(dá)質(zhì)粒。

敲除片段構(gòu)建：用于敲除的目的基因片段包括上下游同源臂兩個(gè)片段。以大腸桿菌TRP1的基因組DNA為模板，采用引物對(duì)上游同源臂-tyrR-up和下游同源臂-tyrR-down、上游同源臂-tyrR-up和下游同源臂-tyrR-down分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到tyrR的上游同源臂和下游同源臂，采用引物對(duì)上游同源臂-tyrR-up和下游同源臂-tyrR-down對(duì)兩個(gè)片段進(jìn)行重疊PCR，得到敲除基因tyrR的片段。

電轉(zhuǎn)化：將包括200 ngtyrR敲除片段和100 ng gRNAtyrR表達(dá)質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化體系電轉(zhuǎn)至細(xì)胞TY01，經(jīng)電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)入1 mL LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃復(fù)蘇2 h。取100 μL培養(yǎng)液涂布于含有50 μg/mL氨芐青霉素（Ampr）和100 μg/mL奇霉素（Sper）的LB固體培養(yǎng)基平板中，32 ℃培養(yǎng)12 h。

陽性克隆子的篩選：挑選LB固體培養(yǎng)基平板中的單菌落采用引物對(duì)上游同源臂-tyrR-up和下游同源臂-tyrR-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，同時(shí)以出發(fā)菌株E.coliTRP1基因組作為對(duì)照，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因條帶大小，篩選陽性克隆子。

gRNA質(zhì)粒的消除：將陽性克隆子接種于含有0.2%阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)12 h，取少量菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，32 ℃培養(yǎng)12 h。將同一個(gè)單菌落先后分別劃線接種于含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板和含有100 μg/mL奇霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，32 ℃培養(yǎng)12 h，挑選表型正確的單菌落。

pREDCas9質(zhì)粒的消除：將成功消除質(zhì)粒gRNA的陽性克隆子接種于LB液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)12 h。取少量菌液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板中，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑選單菌落，并將同一個(gè)單菌落先后劃線接種于含有100 μg/mL奇霉素的LB固體培養(yǎng)基平板和LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)12h。挑選表型正確的單菌落，得到菌株TY03（TY02ΔtyrR）。

1.3.3 高產(chǎn)L-酪氨酸重組菌株TY03的培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：采用接種環(huán)在活化斜面上劃取適量菌落轉(zhuǎn)接于裝液量為30 mL/500 mL的種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10～12 h作為種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：取3 mL種子液接種于含有26 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h。苯酚紅為酸堿指示劑，通過發(fā)酵液顏色變化補(bǔ)加氨水和葡萄糖，使pH維持在7.0～7.2，每次補(bǔ)加1 mL600 g/L葡萄糖。

1.3.4 高產(chǎn)L-酪氨酸重組菌株TY03發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化試驗(yàn)

（1）單因素試驗(yàn)

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別考察葡萄糖添加量（15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）、酵母粉添加量（2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L）、（NH4）2SO4添加量（4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L）、KH2PO4添加量（2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L）、MgSO4·7H2O添加量（2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L）、FeSO4·7H2O添加量（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L）、MnSO4添加量（10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L）、VB1添加量（2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6 mg/L）、VH添加量（6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、14 mg/L）對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)（OD600nm值）及產(chǎn)L-酪氨酸的影響。

（2）正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)重組菌株TY03產(chǎn)L-酪氨酸影響較大的因素酵母粉（A）、MgSO4·7H2O（B）、FeSO4·7H2O（C）、MnSO4（D）、VB1（E）及VH（F）添加量為考察因素，L-酪氨酸產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用SPSS 22.0軟件設(shè)計(jì)6因素3水平的L18（36）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表3。

表3 重組菌株TY03發(fā)酵產(chǎn)L-酪氨酸培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments for medium optimization of L-tyrosine production fermented by recombinant strain TY03

1.3.5 測(cè)定方法

OD600nm值的測(cè)定：采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值；L-酪氨酸含量的測(cè)定[16]：采用高效液相色譜法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理每一個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組工程菌株的構(gòu)建

重組菌株TY02和TY03的PCR鑒定結(jié)果見圖1。由圖1a可知，Ptrc-aroGfbr整合前原基因片段大小為3 356 bp，整合成功后基因片段大小為2 103 bp，說明在Escherichia coliTRP1中成功將Ptrc-aroGfbr整合至假基因位點(diǎn)yjiv，得到菌株TY02。由圖1b可知，tyrR基因敲除前片段大小為2 399 bp，敲除成功后基因片段大小為797 bp，說明tyrR基因敲除成功，得到菌株TY03（TY02 ΔtyrR）。

圖1 重組菌株TY02（a）及TY03（b）的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Verified results of polymerase chain reaction for recombinant strain TY02 (a) and TY03 (b)

2.2 重組菌株的發(fā)酵

為探究基因aroGfbr的上調(diào)表達(dá)和基因tyrR的敲除對(duì)大腸桿菌積累L-酪氨酸的影響，以大腸桿菌TRP1為對(duì)照組，采用相同條件對(duì)得到的菌株TY02和TY03進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定OD600nm值及L-酪氨酸產(chǎn)量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，三株菌株的生長(zhǎng)情況基本一致，發(fā)酵24 h后，OD600nm值穩(wěn)定在33～35。大腸桿菌TRP1的L-酪氨酸產(chǎn)量為（0.2±0.02）g/L，重組菌株TY02的L-酪氨酸產(chǎn)量為（5.8±0.03）g/L，重組菌株TY03的L-酪氨酸產(chǎn)量為（17.4±0.15）g/L，說明兩個(gè)基因的定向修飾對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖影響較小，且細(xì)胞積累L-酪氨酸的能力顯著提升至86倍，因此強(qiáng)化表達(dá)aroGfbr和敲除tyrR的代謝途徑修飾策略具有廣泛應(yīng)用性，且具有深入研究的意義。

圖2 菌株TRP1、TY02及TY03的生長(zhǎng)情況及L-酪氨酸產(chǎn)量Fig.2 Growth and L-tyrosine production of strains TRP1, TY02 and TY03

2.3 重組菌株TY03發(fā)酵產(chǎn)L-酪氨酸培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同葡萄糖添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

碳源是微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)源，碳源利用效率直接影響著生物轉(zhuǎn)化能力[23-24]。因此，考察不同葡萄糖含量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，葡萄糖含量的改變對(duì)重組菌株TY03的生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量沒有造成明顯差異，最終OD600nm值為34～35，L-酪氨酸產(chǎn)量為17.2～17.4 g/L。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中未對(duì)該因素進(jìn)行深入研究。

圖3 不同葡萄糖添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different glucose addition on growth and L-tyrosine yield of strain TY03

2.3.2 不同酵母粉添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

氮源為細(xì)胞中蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)的合成提供氮元素，因此，氮源的供應(yīng)影響著細(xì)胞積累氨基酸能力[25]?？疾觳煌湍阜厶砑恿繉?duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著酵母粉添加量的升高，重組菌株TY03的OD600nm值及L-酪氨酸產(chǎn)量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是酵母粉添加量過低，無法滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求。當(dāng)酵母粉添加量為8 g/L，重組菌株TY03的OD600nm值最高達(dá)到38，L-酪氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到（18.9±0.12）g/L。因此，確定最佳酵母粉添加量為8 g/L。

圖4 不同酵母粉添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different yeast powder addition on growth and L-tyrosine yield of strain TY03

2.3.3 不同無機(jī)鹽添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

考察（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同無機(jī)鹽添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different inorganic salt addition on growth and L-tyrosine yield of strain TY03

由圖5a和圖5b可知，（NH4）2SO4及KH2PO4添加量的改變對(duì)重組菌株TY03的生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量沒有造成明顯差異，最終OD600nm值均維持在35，L-酪氨酸產(chǎn)量分別為（17.3±0.09）g/L、（17.5±0.09）g/L。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中未對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行深入研究。由圖5c～圖5e可知，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和產(chǎn)酸有較大影響。隨著MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O添加量的升高，重組菌株TY03的OD600nm值及L-酪氨酸產(chǎn)量均呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為5 g/L時(shí)，OD600nm值最高為36，L-酪氨酸產(chǎn)量最高為（18.1±0.21）g/L；當(dāng)FeSO4·7H2O添加量為30 mg/L時(shí)，OD600nm值最高為37，L-酪氨酸產(chǎn)量最高為（18.6±0.18）g/L；當(dāng)MnSO4·H2O添加量為30 mg/L時(shí)，OD600nm值最高為36，L-酪氨酸產(chǎn)量最高為（18.3±0.15）g/L；L-酪氨酸產(chǎn)量較初始發(fā)酵培養(yǎng)基下分別提高4.0%、6.8%和5.2%。因此，確定MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O的最佳添加量為5 g/L、30 mg/L、30 mg/L。

2.3.4 不同維生素添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

維生素B1和維生素H對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)及L-酪氨酸產(chǎn)量的影響見圖6。由圖6可知，重組菌株TY03的OD600nm值和L-酪氨酸產(chǎn)量隨著VB1、VH添加量的升高均呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)VB1添加量為5 mg/L時(shí)，重組菌株TY03的OD600nm值和L-酪氨酸產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為37、（18.5±0.15）g/L；當(dāng)VH添加量為10 mg/L時(shí)，重組菌株TY03的OD600nm值和L-酪氨酸產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為37、（18.2±0.14）g/L。因此，確定VB1和VH的最佳添加量為5 mg/L、10 mg/L。

圖6 不同維生素添加量對(duì)重組菌株TY03生長(zhǎng)和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different vitamin addition on growth and L-tyrosine yield of strain TY03

2.4 重組菌株TY03發(fā)酵產(chǎn)L-酪氨酸培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)結(jié)果影響較大的酵母粉（A）、MgSO4·7H2O（B）、FeSO4·7H2O（C）、MnSO4·H2O（D）、VB1（E）和VH（F）添加量為考察因素，以L-酪氨酸產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用SPSS 22.0軟件設(shè)計(jì)6因素3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 重組菌株TY03發(fā)酵產(chǎn)L-酪氨酸培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of orthogonal experiments for medium optimization of L-tyrosine production fermented by recombinant strain TY03

由表4可知，通過極差分析得出各因素對(duì)結(jié)果的影響主次順序是FeSO4·7H2O＞酵母粉＞MnSO4·H2O＞MgSO4·7H2O＞VH＞VB1，最佳試驗(yàn)組合為A2B1C2D3E2F1，在此條件下L-酪氨酸產(chǎn)量為（19.8±0.17）g/L，低于第8組（A2B1C3D3E2F1）試驗(yàn)結(jié)果（20.9±0.19）g/L，因此，確定最佳培養(yǎng)基配方組合為A2B1C3D3E2F1，即酵母粉8g/L，MgSO4·7H2O 4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 40 mg/L，MnSO4·H2O 40mg/L，VB15mg/L，VH8mg/L，在最佳培養(yǎng)基條件下L-酪氨酸產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了20%。

3 結(jié)論

本研究通過在大腸桿菌（Escherichia coli）TRP1中上調(diào)表達(dá)解除反饋抑制的基因aroG，強(qiáng)化莽草酸途徑，同時(shí)敲除基因tyrR，解除TyrR蛋白對(duì)aroG、tyrB、aroF、tyrA、aroL、aroP、tyrP多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄抑制，構(gòu)建得到高產(chǎn)L-酪氨酸的重組工程菌株TY03，L-酪氨酸產(chǎn)量為（17.4±0.15）g/L，是出發(fā)菌株大腸桿菌TRP1的86倍。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定重組菌株TY03產(chǎn)L-酪氨酸的最佳培養(yǎng)基組成為酵母粉8 g/L，MgSO4·7H2O 4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 40 mg/L，MnSO4·H2O 40 mg/L，VB15 mg/L，VH8 mg/L，（NH4）2SO45 g/L、KH2PO43 g/L，在此條件下，重組菌株TY03的L-酪氨酸產(chǎn)量為（20.9±0.19）g/L，比優(yōu)化前提高了20%。該L-酪氨酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建工作簡(jiǎn)單高效，打破了傳統(tǒng)L-酪氨酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路，為以后L-酪氨酸等氨基酸生產(chǎn)菌株定向構(gòu)建提供一種全新的思路。