豆醬的風(fēng)味物質(zhì)及微生物多樣性的研究進(jìn)展

金曼芹，羅 丹，薛文通*

（ 1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河北天順醬業(yè)有限公司，河北 滄州 062563）

豆醬又名黃豆醬、大醬，是以大豆、面粉為原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵釀制而成的一種半流動(dòng)狀態(tài)的調(diào)味品[1]，與腐乳、醬油、豆豉并稱為我國(guó)四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品[2]。發(fā)酵過(guò)程中，微生物的代謝作用不僅會(huì)分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，提高大豆蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和異黃酮的生物利用率[3]，還產(chǎn)生了新的活性成分，如類黑精素、纖溶酶等[4]，使豆醬具有獨(dú)特的生理功能，如降血脂、降血糖、降血壓、抗癌、抗氧化和抗炎等[5]。同時(shí)，發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的食物保藏技術(shù)，通過(guò)微生物的作用來(lái)降解生物胺[6]，從而保持豆醬的食用安全性。

豆醬的食用歷史悠久，各地依據(jù)環(huán)境條件和飲食文化形成了具有當(dāng)?shù)靥厣亩贯u種類，如我國(guó)的東北大醬[7]、郫縣豆瓣醬[8]，韓國(guó)的Doenjang[9]，日本的Miso[10]等。不同種類的豆醬風(fēng)味特征各異，主要與含有的風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)，包括氨基酸、單糖和寡糖、有機(jī)酸等滋味成分及酯類、醇類、酸類、醛酮類等氣味成分。豆醬特征風(fēng)味的形成與微生物菌群利用原料進(jìn)行的復(fù)雜代謝密切相關(guān)。微生物通過(guò)分泌不同種類和活性的酶來(lái)控制自身的代謝活動(dòng)，原料中的大分子物質(zhì)在微生物豐富的酶系催化下生成了各種初級(jí)代謝產(chǎn)物（氨基酸、單糖、有機(jī)酸等）和次級(jí)代謝產(chǎn)物（揮發(fā)性物質(zhì)、異黃酮、生育酚、皂苷等）[11]。其次，微生物通過(guò)代謝活動(dòng)改變了發(fā)酵體系的理化因子，而發(fā)酵體系的變化反過(guò)來(lái)會(huì)改變微生物的多樣性，因此發(fā)酵系統(tǒng)中菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演替是風(fēng)味代謝物變化的主要原因[12]，影響不同發(fā)酵階段風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，從而決定了豆醬的風(fēng)味特征。此外，合理的優(yōu)勢(shì)菌群還影響著豆醬的理化特性和食用安全[13-14]，是防止產(chǎn)品品質(zhì)下降甚至是釀造失敗的重要控制點(diǎn)。

目前，隨著人們對(duì)食物“色香味”要求的提高，探討豆醬風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理和影響因素尤為重要。為了解析微生物對(duì)豆醬風(fēng)味物質(zhì)形成的重要性，保證豆醬生產(chǎn)的質(zhì)量，本文綜述了豆醬的風(fēng)味物質(zhì)、微生物的多樣性、風(fēng)味物質(zhì)與微生物多樣性的相關(guān)性及影響微生物多樣性的因素，以期為高品質(zhì)豆醬的發(fā)展提供理論參考。

1 豆醬的風(fēng)味物質(zhì)

1.1 風(fēng)味物質(zhì)成分

1.1.1 滋味成分

豆醬發(fā)酵的原料有大豆和淀粉，可為微生物的代謝提供蛋白質(zhì)、淀粉、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)被分解過(guò)程中產(chǎn)生了各種小分子物質(zhì)，隨后被微生物轉(zhuǎn)化成適合自身生長(zhǎng)繁殖的中間代謝物。當(dāng)原料充足和條件適宜時(shí)，小分子物質(zhì)可大量積累，構(gòu)成了豆醬咸甜可口，味道鮮美的滋味特征，主要包括氨基酸、核苷酸、單糖和寡糖、有機(jī)酸等，每一種物質(zhì)對(duì)豆醬整體的風(fēng)味特征的影響見(jiàn)表1。

表1 豆醬中常見(jiàn)的滋味成分Table 1 Common flavor components in soybean paste

大豆蛋白在微生物及其酶的作用下被分解為肽和氨基酸，其種類和含量影響豆醬整體風(fēng)味的變化，其中天冬氨酸和谷氨酸含量普遍都比較高，對(duì)產(chǎn)品的鮮味貢獻(xiàn)起著重要作用。除了鮮味氨基酸外，呈味核苷酸也是鮮味的重要來(lái)源，是發(fā)酵過(guò)程中酵母、霉菌等微生物自溶后核酸在核酸酶水解下的產(chǎn)物，主要有肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸和尿苷酸。小分子糖主要來(lái)源于原料中多糖的分解或轉(zhuǎn)化。淀粉和大豆中的糖類被微生物分泌的淀粉酶降解為糊精、麥芽糖和葡萄糖等，從而呈現(xiàn)出甜味[19]。有機(jī)酸是豆醬酸味的主要來(lái)源，形成途徑包括脂肪的水解、氨基酸的降解和糖代謝。豆醬中的酸主要是檸檬酸、蘋果酸和乳酸，其中檸檬酸酸味溫和清爽，蘋果酸的酸味圓潤(rùn)，乳酸的酸味較為柔和。大豆中含有0.3%的異黃酮，在豆醬中常見(jiàn)的種類是以苷元形式存在的大豆黃酮苷元和染料木素苷元，它們是重要的營(yíng)養(yǎng)成分，但也是苦味的主要來(lái)源[23-24]。豆醬中的咸味主要來(lái)源于鹽類，含量一般為10%～12%，過(guò)高的鹽含量會(huì)抑制一些微生物的生長(zhǎng)及大豆中生物活性物質(zhì)異黃酮含量的降低[22]；而過(guò)低的鹽含量會(huì)使咸味和鮮味的不足，導(dǎo)致豆醬口感變差[25]。

1.1.2 氣味成分

豆醬風(fēng)味特征不同主要是由于其揮發(fā)性風(fēng)味化合物的組成差別很大。趙建新等[26]使用頂空固相微萃?。╤eadspace solidphasemicroextraction，HS-SPME）和氣質(zhì)聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法鑒定了傳統(tǒng)豆醬中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，共檢出136種，包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、酚類、呋喃、吡嗪、含硫化合物等。蒲靜等[27]采用GC-MS技術(shù)檢測(cè)了自然發(fā)酵、枯草芽孢桿菌和異常威克漢姆酵母菌純種制曲發(fā)酵豆醬中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，分別共檢出了73種、50種和64種，主要風(fēng)味物質(zhì)分別為醇類、酸類和烯烴類?？偟膩?lái)說(shuō)，酯類、醇類、酸類、醛酮類、酚類、雜環(huán)類等化合物是豆醬中最常檢出的重要揮發(fā)性物質(zhì)，不同種類風(fēng)味物質(zhì)具有不同的風(fēng)味特征，一起決定了豆醬的香氣品質(zhì)，如表2所示。

表2 豆醬中常見(jiàn)的氣味成分Table 2 Common odor components in soybean paste

在豆醬中酯類含量相對(duì)較高，主要是乙基酯，如乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、亞油酸乙酯等，其中乙酸乙酯幾乎存在于豆醬中，可能與豆醬中乙醇和乙酸的相對(duì)含量較高有一定的關(guān)系，其香氣可描述為菠蘿和水果味[29]。

醇類在揮發(fā)性物質(zhì)中含量較高，在豆醬中，由于醇類物質(zhì)閾值較高，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，主要作為合成酯類的底物而影響豆醬的香氣。許多人工接種發(fā)酵醬油或豆醬的研究中都會(huì)在醬醪中添加酵母增香，其機(jī)理之一就是增加乙醇，提高乙基酯等風(fēng)味化合物的含量，加強(qiáng)酒香、酯香[28，32]。酸類物質(zhì)在不同的豆醬中含量差異較大，大多種類的酸類對(duì)整體風(fēng)味有負(fù)面影響，如乙酸、丁酸，由于其刺激性酸味，會(huì)與酯類一起構(gòu)成豆醬香而微臭的獨(dú)特風(fēng)味。醛酮類物質(zhì)的閾值較低，具有堅(jiān)果香、果香的芳香味[26]，對(duì)豆醬整體香氣貢獻(xiàn)較大。苯甲醛（苦杏仁）、苯乙醛（風(fēng)信子花香和甜香）是醬類產(chǎn)品中常見(jiàn)的兩種醛類[30-31]。酮類物質(zhì)在豆醬中含量較低，但二氫-2（3H）-呋喃酮、3-辛酮在傳統(tǒng)豆醬的可揮發(fā)性化合物中占重要比例，影響其特征風(fēng)味[26]。大部分酚類化合物具有香氣明顯、活性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)豆醬的風(fēng)味有很大貢獻(xiàn)，如麥芽酚、愈創(chuàng)木酚、對(duì)乙基苯酚是發(fā)酵豆醬中最重要的酚類物質(zhì)，被認(rèn)為是形成香氣的重要組成部分，雖然其含量很少，但由于其氣味閾值較低，對(duì)香氣的影響非常明顯[34-35]。豆醬中含有的雜環(huán)類化合物種類多，在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期含量均不高，但這些化合物閾值較低，是豆醬中烘培香氣的主要組成主體，如4-羥基-2-乙基-5-甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3（2H）-furanone，HEMF）、2,6-二甲基吡嗪等具有焦糖、咖啡似的香氣，氣味較強(qiáng)烈，是豆醬主要的呈香物質(zhì)[28]。

大多數(shù)含硫化合物，如二甲基二硫化物，會(huì)產(chǎn)生令人不快的氣味，通常由含硫氨基酸降解產(chǎn)生的硫醇形成，通常具有較低的閾值，對(duì)某種豆醬風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大[38]。

1.2 風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生途徑

在豆醬發(fā)酵過(guò)程中，原料中的大分子經(jīng)過(guò)微生物的代謝形成了各種小分子，這些物質(zhì)都是風(fēng)味化合物的前體，在合適的環(huán)境條件下發(fā)生各種生化反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)、酯化反應(yīng)、脂肪酸氧化等，最終形成豐富的風(fēng)味化合物，這些風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生途徑如圖1所示。

圖1 豆醬發(fā)酵過(guò)程中常見(jiàn)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生途徑Fig.1 Production pathways of common flavor substances in soybean paste during fermentation process

酯類主要由酵母菌產(chǎn)酶的催化或有機(jī)酸和醇通過(guò)非酶催化的酯化反應(yīng)生成。豆醬中的各種醇類和酸類物質(zhì)可分別由酵母菌和乳酸菌利用糖類代謝產(chǎn)生[26，39]，如乙醇、乙酸。除此之外，原料中的脂質(zhì)可被真菌脂肪酶解出各種游離的高分子質(zhì)量脂肪酸，與乙醇酯化成各種乙基酯[40-41]；某些脂肪酸還可氧化形成醇類，如己醇和1-辛烯-3-醇產(chǎn)生于亞油酸和亞麻酸的酶氧化[42]。羰基化合物是豆醬發(fā)酵溫度上升時(shí)不飽和脂肪酸脫羧基或碳鏈氧化形成，如己醛由大豆中脂氧合酶催化脂質(zhì)氧化的長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生而來(lái)[43]；也可由相應(yīng)的醇、酚氧化生成[44]，包括糠醛、苯乙醛等。酚類化合物被普遍認(rèn)為是通過(guò)小麥中配糖體、木質(zhì)素等的降解物經(jīng)曲霉菌，球擬酵母的發(fā)酵作用生成的產(chǎn)物[26，45]，而揮發(fā)性酚如4-乙基愈創(chuàng)木酚也可通過(guò)過(guò)氧化物酶的反應(yīng)引起芳香族氨基酸的降解而形成[36]。雜環(huán)類化合物中主要的吡嗪類由還原糖與氨基酸的美拉德反應(yīng)形成，其含量可能會(huì)受大豆蒸煮條件、曲的比例、巴氏殺菌和豆醬陳化的影響[36，46]。含硫化合物則來(lái)源于含硫氨基酸的分解[38]，如二甲基二硫來(lái)源于半胱氨酸（cysteine，Cys）或蛋氨酸（methionine，Met）的轉(zhuǎn)化[36]?？偟膩?lái)說(shuō)，風(fēng)味物質(zhì)主要源自于微生物的代謝活動(dòng)和各個(gè)物質(zhì)之間的生化反應(yīng)，各個(gè)風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。

2 豆醬的微生物多樣性

豆醬中微生物的組成是決定其品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵性因素。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物的各種代謝活動(dòng)產(chǎn)生了大量初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物，不僅提升了豆醬的風(fēng)味品質(zhì)，還影響了產(chǎn)品功能及抗氧化性能[11]。雖然不同種類豆醬的微生物多樣性因原料、產(chǎn)地、生產(chǎn)工藝等因素的影響而不同，但是不同發(fā)酵階段優(yōu)勢(shì)菌群主要由霉菌、酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌所構(gòu)成。這些微生物各具代謝功能，促進(jìn)了豆醬中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生和品質(zhì)的提升。不同種類豆醬不同階段的優(yōu)勢(shì)菌群見(jiàn)表3。

表3 不同種類豆醬發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢(shì)菌群Table 3 Predominant microbes of different kinds of soybean paste in different fermentation stages

2.1 霉菌

曲霉屬（Aspergillus）是豆醬中最常見(jiàn)的霉菌，特別是米曲霉，影響了原料的利用、發(fā)酵的快慢、顏色的變化和味道的鮮美[51]。在日本味噌和中式成熟豆醬中，米曲霉均是真菌的優(yōu)勢(shì)菌種[47]，可能是醬曲制作時(shí)使用了米曲霉作為發(fā)酵劑。采用相同原料、生產(chǎn)環(huán)境而制作工藝不同的韓式大醬和中式大醬中韓式大醬，霉菌種類更豐富，有根毛霉屬、青霉菌屬、毛霉屬、外瓶霉屬、曲霉屬等[48]，可能更適合環(huán)境中的霉菌生存。

2.2 酵母菌

酵母菌主要出現(xiàn)在發(fā)酵前期，中后期由于pH的降低而逐漸消失。主要的酵母菌種類包括接合酵母屬、威克漢姆酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利氏酵母菌屬（Debaryomyces）等。在市售的東北豆醬中，接合酵母屬（Zygosaccharomyces）比較豐富[52]。豆瓣醬中的魯氏接合酵母（Z.rouxii）有助于合成典型香味[49]。日本味噌發(fā)酵過(guò)程中通常會(huì)添加魯氏接合酵母，能夠促進(jìn)味噌的成熟[53]。工業(yè)化大豆醬的后期，揮發(fā)性成分顯著富集，醇酯類化合物高產(chǎn)，這可能與接合酵母屬是發(fā)酵中后期優(yōu)勢(shì)真菌有關(guān)[39]。

2.3 乳酸菌

乳酸菌是豆醬中最常見(jiàn)的細(xì)菌，是產(chǎn)生有機(jī)酸的主要微生物。工業(yè)化大豆醬發(fā)酵初期，可滴定酸度含量最高，這是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵代謝，促使大豆醬中的酸不斷積累[54]。乳酸菌代謝葡萄糖主要有兩種途徑：通過(guò)糖酵解途徑（embden-meyerhof-pathway，EMP）發(fā)酵只產(chǎn)生乳酸的同型乳酸發(fā)酵；通過(guò)磷酸戊糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）發(fā)酵后除主要產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙醇、乙酸等的異型乳酸發(fā)酵[55]。HAN D M等[17]利用Spearman相關(guān)分析韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物類群與代謝物之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)異乳酸發(fā)酵是大醬發(fā)酵的主要過(guò)程。

2.4 芽孢桿菌

芽孢桿菌屬（Bacillus）在醬曲和豆醬中廣泛存在，對(duì)大豆發(fā)酵過(guò)程游離氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)的形成均發(fā)揮著重要的作用，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等[48，56-58]，在發(fā)酵后期通常會(huì)因?yàn)轶w系總酸含量的上升，pH的下降而被抑制生長(zhǎng)[59]。枯草芽孢桿菌能夠降低或防止生物胺的生成[60]。地衣芽孢桿菌具有耐鹽性，可在豆醬發(fā)酵后期存活[61]。貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）可被用來(lái)制取醬曲，風(fēng)味物質(zhì)種類和含量都有所提升[62-63]。

3 豆醬的風(fēng)味物質(zhì)與微生物組成的相關(guān)性

3.1 微生物代謝的偏好性

在豆醬的生產(chǎn)中，微生物利用原料進(jìn)行代謝活動(dòng)，風(fēng)味物質(zhì)是代謝活動(dòng)的各種產(chǎn)物，因此微生物的組成結(jié)構(gòu)會(huì)影響風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。微生物的代謝較為復(fù)雜，相同的微生物可以產(chǎn)生不同的風(fēng)味代謝物質(zhì)，而相同的風(fēng)味物質(zhì)也可由不同的微生物產(chǎn)生。LEE S M等[64]比較了自然發(fā)酵和人工發(fā)酵產(chǎn)生的兩種豆醬代謝物譜，并將其與生產(chǎn)工藝中每一步的優(yōu)勢(shì)微生物群落相關(guān)聯(lián)，研究表明糖、脂肪酸和氨基酸的代謝主要分別與米曲霉、貝萊斯芽孢桿菌和魯氏接合酵母有關(guān)。此外，在郫縣豆瓣醬中魯氏接合酵母與10種均在深熟階段達(dá)到峰值的重要可揮發(fā)性化合物呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明了魯氏接合酵母在郫縣豆瓣醬的成熟期有助于合成典型氣味[49]。豆醬中的乳酸可以由各種各樣的產(chǎn)乳酸微生物通過(guò)生物途徑而產(chǎn)生，即乳酸菌通過(guò)同質(zhì)發(fā)酵途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，但SHULA S等[65]研究發(fā)現(xiàn)，韓國(guó)大醬中主要產(chǎn)乳酸的微生物是枯草芽孢桿菌。由此可以說(shuō)明，微生物對(duì)不同代謝途徑的偏好性決定了代謝產(chǎn)物的種類，而豆醬中的各種微生物對(duì)不同代謝物的產(chǎn)出組成了豐富的風(fēng)味物質(zhì)庫(kù)。

3.2 微生物的酶活性

微生物分泌的酶可以使風(fēng)味物質(zhì)的生物合成高效進(jìn)行，而不同酶的活性在菌種體內(nèi)表達(dá)程度的不同造成了風(fēng)味物質(zhì)特征的差異[66]。HYEON H等[67]比較米曲霉和枯草芽孢桿菌對(duì)相同大豆原料的發(fā)酵結(jié)果表明，使用米曲霉發(fā)酵的大豆中谷氨酸脫羧酶和谷氨酰胺合成酶活性提高，所得到的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酰胺含量也較高。而枯草芽孢桿菌發(fā)酵提高了大部分氨基酸和異黃酮的含量，表明蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性較高。KUM S等[43]分析了三種曲霉菌中不同酶（α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和酯酶）的活性，探討了它們對(duì)豆醬揮發(fā)性化合物形成的影響。α-淀粉酶活性在米曲霉發(fā)酵早期較高，影響了2-甲基吡嗪、麥芽酚和糠醛的形成。而醬油曲霉（A.sojae）和白曲霉菌（A.kawachii）的蛋白酶活性與豆醬發(fā)酵后期風(fēng)味形成密切相關(guān)。3-苯丙酸乙酯、2-乙酸苯乙酯、2-苯基-2-丁烯醛和苯乙醇等物質(zhì)可能受到蛋白酶活性的影響，其中3-苯丙酸乙酯和2-乙酸苯乙酯的形成可能同時(shí)受到蛋白酶和酯酶的作用。

3.3 微生物之間的相互作用

在豆醬發(fā)酵這一復(fù)雜系統(tǒng)中，不同種微生物群體之間存在各種相互作用，包括正相互作用和負(fù)相互作用。正相互作用使得微生物能更有效利用系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)快速增長(zhǎng)，群體密度增加，而負(fù)相互作用使得群體密度和代謝活動(dòng)受到限制。豆醬中各種微生物在不同階段進(jìn)行演替和代謝，微生物的多樣性使得群體之間的相互關(guān)系變得復(fù)雜，從而利用簡(jiǎn)單的原料成分能夠代謝產(chǎn)生了各種風(fēng)味物質(zhì)。

YANG M L等[21]研究發(fā)現(xiàn)，郫縣豆瓣醬的高鹽和辣椒素富集造成的極端環(huán)境中，微生物之間的相互作用非常簡(jiǎn)單，其中接合酵母屬與芽孢桿菌屬表現(xiàn)出了正相關(guān)關(guān)系，這種相互作用促進(jìn)了在高滲透壓環(huán)境中各種香氣化合物的形成。芽孢桿菌屬參與氨基酸的代謝，魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）能夠利用Maillard中間體作為前體生成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，因此氨基酸可能是兩種微生物相互作用的媒介。解夢(mèng)汐等[68]認(rèn)為，在遼寧省農(nóng)家自然發(fā)酵的豆醬中，四聯(lián)球菌屬與酵母菌的正相互作用可以通過(guò)提高產(chǎn)品中酯類物質(zhì)的含量來(lái)改善豆醬風(fēng)味。酵母菌參加代謝反應(yīng)的產(chǎn)物主要為醇類和醛類，四聯(lián)球菌屬代謝的產(chǎn)物則主要是以乳酸為主要酸的多種有機(jī)酸類，可以與酵母菌代謝產(chǎn)生的醇類結(jié)合生成各種酯類化合物。在豆醬發(fā)酵后期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏以及酸類物質(zhì)的積累，群落間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)或者拮抗作用，微生物的多樣性下降，只有一些耐高滲透壓和耐酸的種群存在并成為優(yōu)勢(shì)菌群。XIE M等[69]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大醬進(jìn)行細(xì)菌群落分析后發(fā)現(xiàn)，微生物的多樣性隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是大醬發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌種，可以通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素抑制其他菌種的生長(zhǎng)；同時(shí)，腸膜明串珠菌可以產(chǎn)酸，降低發(fā)酵環(huán)境pH，一些細(xì)菌難以適應(yīng)環(huán)境脅迫，在競(jìng)爭(zhēng)中處于不利地位而慢慢消失。

4 影響豆醬微生物多樣性的因素

豆醬的微生物多樣性由多種因素決定，由于風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量與微生物的代謝活動(dòng)密切相關(guān)，因此不同國(guó)家和地區(qū)的豆醬由于原料、加工工藝和環(huán)境的差異使得微生物組成結(jié)構(gòu)的不同，其口感和風(fēng)味也各不相同。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的物質(zhì)轉(zhuǎn)化是來(lái)自不同生態(tài)位的微生物代謝活動(dòng)的結(jié)果。內(nèi)在基質(zhì)特性（pH、水活度、原材料等）和外在參數(shù)（溫度、滲透壓、濕度、好氧/厭氧條件等）是影響大豆醬發(fā)酵微生物生態(tài)位的重要因素[3]。這些因素主要通過(guò)改變豆醬中微生物的多樣性來(lái)改變風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量[70]，進(jìn)而改變豆醬風(fēng)味，如圖2所示。

圖2 影響豆醬微生物多樣性的因素Fig.2 Factors affecting microbial diversity in soybean paste

4.1 原料選擇

制作豆醬的原料一般是豆類和淀粉，不同豆類和淀粉的品種不同，分解后的氨基酸、單糖、脂肪酸的含量和種類也明顯不同，在微生物代謝下會(huì)形成不同的風(fēng)味物質(zhì)，可直接影響豆醬風(fēng)味。除此之外，原料也會(huì)影響微生物的組成。ZHOU X Y等[71]通過(guò)添加以氨基酸為主要成分的酵母抽提物來(lái)建立核心發(fā)酵菌群，從而提高醬油的風(fēng)味。研究發(fā)現(xiàn)，堿性和中性氨基酸有利于產(chǎn)味菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，酸性氨基酸促進(jìn)發(fā)酵菌群的抗應(yīng)激能力，尤其是乳酸菌，豐度增加后成為優(yōu)勢(shì)菌群。XIAO L Q等[72]制備了分別以苦蕎粉和小麥粉為淀粉原料的豆醬，對(duì)兩組樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，兩組細(xì)菌群落相似，均有克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、unidentified_Chloroplast、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬。但兩組的真菌群落在醬醅發(fā)酵中有顯著差異，伊薩酵母屬（Issatchenkia）僅存在于蕎麥組，Stenocarpella和Gibberella是小麥粉組的特征真菌。生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化表明，兩類群微生物群落的演替模式不同。

4.2 制曲工藝

我國(guó)制作和食用豆醬的歷史悠久，最初的豆醬都是家庭依賴自然環(huán)境中微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，逐漸出現(xiàn)了利用人工接種生產(chǎn)的工業(yè)化豆醬。自然發(fā)酵豆醬和工業(yè)化豆醬的生產(chǎn)工藝流程如下：

兩種生產(chǎn)工藝主要的差別在于制曲階段。自然發(fā)酵的豆醬在制曲時(shí)完全依賴環(huán)境中的微生物，因此微生物比較豐富，酶系也比較復(fù)雜[73]。工業(yè)化生產(chǎn)的豆醬或味噌常常只接種了曲霉屬的菌種，酶系比較單一。兩種類型豆醬中風(fēng)味代謝物種類和含量有所不同，主要與芽孢桿菌、屎腸球菌、嗜鹽四鏈球菌、米曲霉、青霉和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等相關(guān)微生物有關(guān)[74]。研究表明，不同生產(chǎn)方式的豆醬發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的組成不同，自然發(fā)酵醬醅樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），工業(yè)發(fā)酵醬醅的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis），但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，四聯(lián)球菌含量上升成為優(yōu)勢(shì)菌，與自然發(fā)酵豆醬無(wú)明顯差異[59]。

4.3 生產(chǎn)周期

在豆醬發(fā)酵的不同階段，微生物的演替會(huì)伴隨著風(fēng)味物質(zhì)的變化。中國(guó)傳統(tǒng)豆瓣醬的制作分為三個(gè)階段——甜瓣子發(fā)酵、辣椒坯發(fā)酵和混合后發(fā)酵，每個(gè)階段的細(xì)菌種類有所不同。這三個(gè)階段除了共有的核心功能細(xì)菌（四鏈球菌屬、乳桿菌屬和假單胞菌屬）外，辣椒坯發(fā)酵和混合后發(fā)酵階段特有的核心功能菌屬分別是芽孢桿菌和芽孢桿菌、片球菌屬。不同階段的總酸度、pH和NaCl是促進(jìn)豆瓣醬細(xì)菌群落演替的重要內(nèi)源因子[75]。豆醬的成熟階段是風(fēng)味形成的重要階段，而不同的熟化時(shí)間代表著微生物組成和代謝產(chǎn)物的不同。YANG M L等[21]研究發(fā)現(xiàn)，郫縣豆瓣醬的菌群因熟化時(shí)間而略有不同。以X生產(chǎn)商為例，熟化1年的郫縣豆瓣醬以貪銅菌屬（Cupriavidus）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia為主要細(xì)菌群落，熟化2年后，貪銅菌屬的豐度下降，乳桿菌屬的豐度顯著上升；優(yōu)勢(shì)真菌由Issatchenkia轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍妇浚⊿accharomycetales）。

4.4 地區(qū)環(huán)境

豆醬的生產(chǎn)會(huì)經(jīng)歷一個(gè)在開(kāi)放的環(huán)境中發(fā)酵成熟的階段，因此，豆醬的微生物多樣性與環(huán)境條件密切相關(guān)。不同地區(qū)代表了溫度、濕度、光照等環(huán)境因子的差別，這些環(huán)境因素會(huì)影響著微生物的生長(zhǎng)和代謝。ZHAO S等[76]探討了陽(yáng)光、空氣和醬醅翻轉(zhuǎn)對(duì)豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌和真菌動(dòng)態(tài)的影響，密閉或黑暗條件下細(xì)菌和真菌的多樣性均較高，而醬醅翻轉(zhuǎn)對(duì)細(xì)菌豐富度無(wú)影響，說(shuō)明在光照和通風(fēng)環(huán)境下有利于保持穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。在發(fā)酵49 d后，光照且開(kāi)放環(huán)境的兩個(gè)樣品中曲霉屬的絕對(duì)豐度顯著高于黑暗和密閉組，這是因?yàn)榍箤偈切柩醯模渖L(zhǎng)受陽(yáng)光照射的調(diào)節(jié)，空氣或陽(yáng)光的阻隔會(huì)抑制曲霉菌的生長(zhǎng)。通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豆瓣醬中優(yōu)勢(shì)微生物之間的相互作用是由陽(yáng)光和通風(fēng)介導(dǎo)的，揭示了陽(yáng)光和通風(fēng)在調(diào)節(jié)豆瓣醬菌落結(jié)構(gòu)中的重要性[77]。

4.5 食鹽含量

食鹽含量可以直接或間接影響豆醬的風(fēng)味和安全。在風(fēng)味方面，食鹽含量會(huì)直接影響到豆醬的咸度。傳統(tǒng)自制的豆醬是人們根據(jù)生活經(jīng)驗(yàn)來(lái)添加食鹽，東北醬中鹽含量較高，因此口味偏咸[78]。鹽含量還可通過(guò)影響豆醬發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性來(lái)改變風(fēng)味代謝物的種類和含量[79]。低鹽（9%和12%）大醬在發(fā)酵前期微生物豐度增加的速度更快，揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，種類較多，與微生物生長(zhǎng)密切相關(guān)，而高鹽（15%和18%）大醬的微生物豐度顯著低于低鹽大醬，說(shuō)明微生物活性較低[80]，可能是由于高鹽環(huán)境下，大多數(shù)微生物的生存和代謝受到抑制。但是鹽度的降低會(huì)帶來(lái)食品安全的隱患，因?yàn)榘l(fā)酵食品的高鈉環(huán)境會(huì)抑制有害微生物的生長(zhǎng)，一些耐鹽性微生物如魯氏接合酵母、地衣芽孢桿菌等優(yōu)勢(shì)菌群的建立還可通過(guò)對(duì)其他雜菌的競(jìng)爭(zhēng)或拮抗作用來(lái)減少食物腐敗、致病菌和有害微生物產(chǎn)生有害代謝物污染的風(fēng)險(xiǎn)，如生物胺、亞硝胺、氨基甲酸乙酯和真菌毒素等[81]。

5 結(jié)論與展望

作為中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，豆醬具有鮮咸可口，醬香濃郁的特點(diǎn)。大豆、淀粉等原料在各種微生物的作用下生成了風(fēng)味物質(zhì)成分。微生物多樣性在豆醬發(fā)酵的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，但是由于微生物代謝的偏好性、分泌的酶活性及微生物之間的相互作用，不同發(fā)酵階段的核心功能微生物難以確定。未來(lái)的研究中，應(yīng)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中微生物的生態(tài)位及環(huán)境因子的變化以掌握整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)展進(jìn)程，確保豆醬生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可控性。此外，通過(guò)研究不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌群并嘗試人工接種，以此來(lái)模擬自然發(fā)酵微生物的演替進(jìn)程是豆醬工業(yè)化的重要途徑。同時(shí)，還要了解微生物多樣性與風(fēng)味物質(zhì)的聯(lián)系，通過(guò)控制或接種相關(guān)風(fēng)味微生物來(lái)生產(chǎn)出味道豐滿、圓潤(rùn)，入口、回味俱佳的高品質(zhì)豆醬。