聚羥基脂肪酸酯在組織工程中的應(yīng)用

陳國強(qiáng)， 劉心怡， 劉 絮

（1. 清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2. 清華大學(xué) 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心，北京 100084；3. 清華大學(xué) 化工系，北京 100084；4.北京微構(gòu)工廠生物技術(shù)有限公司，北京 101309）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是一系列微生物在過量碳源和有限的氮/磷源存在的不利生長條件下，作為碳源、能量和還原力的存儲物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成和積累的微生物線性聚酯［1］。從100 余年前首次發(fā)現(xiàn)PHA開始，目前已有超過150種不同單體、種類多樣的PHA 被發(fā)現(xiàn)［2］。 如聚3 - 羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate， PHB）、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯（poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate）， PHBV）、聚3-羥基丁酸-3-羥基己 酸 共 聚 酯（poly （3-hydroxybutyrate-3-hydroxyhexanoate）， PHBHHx）、聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯（poly （3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate）， P34HB）等都是常見的PHA 材料。同時，合成生物學(xué)、基因編輯、代謝工程等技術(shù)的快速發(fā)展，進(jìn)一步擴(kuò)大了PHA的大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用前景［3］。近年來，通過基因工程改造微生物已經(jīng)可以獲得不同單體結(jié)構(gòu)、聚合模式以及相對分子質(zhì)量的定制PHA［4］。

PHA材料表現(xiàn)出十分優(yōu)越的材料性能，包括優(yōu)良的熱塑加工性、可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能，以及在組織工程領(lǐng)域最值得關(guān)注的生物相容性和生物可降解性［5］。通過不同的物理、化學(xué)、生物修飾，如將PHA與其他生物基可降解高分子（如聚乳酸、透明質(zhì)酸、殼聚糖等）進(jìn)行共混，引入不同官能團(tuán)或新的功能性單體，都可以賦予PHA 新的性能，滿足不同的應(yīng)用場景［6-8］。PHA和聚乳酸（PLA）共混后，對其制備纖維材料的可紡性有較大的提升，便于加工成纖維狀的制品，用于醫(yī)療領(lǐng)域，如手術(shù)縫線等［5］。通過與透明質(zhì)酸的接枝，可以增強(qiáng)化合物的親水性，擴(kuò)展其在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用可能性［7］。與殼聚糖等其他材料的共混，可以獲得不同形貌和孔洞的支架，為細(xì)胞培養(yǎng)的研究提供了更多的選擇空間［8］。

最常見也是研究最廣泛的PHA——聚3-羥基丁酸酯（PHB）以及其他含有3-羥基丁酸（3HB）單元的共聚物還具有另一個突出優(yōu)點(diǎn)：該類聚合物的降解產(chǎn)物3HB 具有多種生物活性功能。3HB 是哺乳動物酮體的重要組成部分，能夠在極端條件下（如長時間運(yùn)動、饑餓等）為機(jī)體提供能量［9］。更重要的是，許多研究表明3HB 對多種疾病具有潛在的治療作用。3HB 具有抑制脂質(zhì)分解的能力［10］，從而可以通過提高心肌線粒體解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)和降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)來抑制延長心肌損傷的游離脂肪酸的產(chǎn)生，起到保護(hù)心肌的作用［11］。3HB 還可以通過不同的機(jī)制改善阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)退行性疾?。?2-13］，而以3HB 為主要作用成分的生酮飲食對人乳腺癌［14］、神經(jīng)性母細(xì)胞瘤［15］、結(jié)腸癌［16］、前列腺癌［17］和胃癌［18］等腫瘤也具有明顯的治療效果。

基于以上優(yōu)勢，PHA材料已被廣泛用于組織工程、植入材料、藥物緩釋、醫(yī)療保健等多個領(lǐng)域中［19］。2007 年，以聚4-羥基丁酸酯（P4HB）為原料的可吸收縫合線 （TephaFLEX?） 獲美國食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，成為首個商品化的PHA醫(yī)療產(chǎn)品，進(jìn)一步打開了PHA 在組織工程中的應(yīng)用前景［20］。

本文將針對PHA 材料在骨、皮膚、神經(jīng)等組織工程中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，并簡述PHA作為藥物載體的應(yīng)用前景（表1）。

表1 PHA在組織工程中的應(yīng)用Tab. 1 Applications of PHA in tissue engineering

1 PHA在骨組織工程中的應(yīng)用

由于PHA 材料良好的力學(xué)性質(zhì)和生物相容性等，許多基于PHA（如PHB， PHBHHx，PHBV 和P34HB）的支架已被應(yīng)用于骨組織工程中［37］。將PHB與納米羥基磷灰石（nHA）共混后制備了PHB/nHA復(fù)合支架，其顯示出高度互連的多孔結(jié)構(gòu)，具有相對較高的孔隙率。體外實(shí)驗(yàn)中，該支架對成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞都具有較強(qiáng)的生物相容性，證明了其在骨組織工程中的應(yīng)用潛力［21］。Knowles 等人制備了 PHBV/磷酸鹽玻璃復(fù)合材料，并在大鼠皮下和非負(fù)重股骨作為種植體進(jìn)行骨修復(fù)評價。細(xì)胞的初始活性非常高；4 周后，大量細(xì)胞進(jìn)入由增溶玻璃形成的股骨種植體表面孔隙，種植體表面出現(xiàn)新骨，說明PHBV 作為骨修復(fù)材料可以促進(jìn)骨組織的修復(fù)和再生［22］。PHBHHx 具有適當(dāng)?shù)氖杷?，且相比PHB 和PHBV 具有更好的機(jī)械性能。將兔骨髓細(xì)胞分別接種到PHB、PLA 和PHBHHx 的3D 支架上，PHBHHx 表現(xiàn)出更好的成骨細(xì)胞附著和骨髓細(xì)胞增殖性能。結(jié)合其更好的彈性和加工性，PHBHHx 也可以用作骨重建的潛在生物材料［23］。通過靜電紡絲技術(shù)，Lin 等人使用P34HB 和氧化石墨烯合成了納米纖維支架。這種復(fù)合材料支架制備簡單，具有良好的多孔結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)的機(jī)械性能和快速成骨能力，在大鼠嚴(yán)重顱骨缺損的體內(nèi)骨再生中表現(xiàn)十分優(yōu)異［24］。綜上所述，多種不同種類的PHA 均可用于骨組織工程中作為支架材料，促進(jìn)骨組織的修復(fù)和再生。

2 PHA在皮膚組織工程中的應(yīng)用

PHA 材料在皮膚組織工程中的修復(fù)應(yīng)用也有較為廣泛的研究。Volova等人通過溶劑澆鑄和靜電紡絲技術(shù)分別制備了P34HB 膜和由超細(xì)纖維組成的無紡布靜電紡膜，作為傷口敷料，分別測試了兩者促進(jìn)皮膚修復(fù)和再生的能力。在磷酸鹽緩沖液中，兩種膜沒有顯著膨脹，也沒有快速水解，但P34HB本身的生物降解性保證了它們可以在血液中緩慢生物降解的同時保留其應(yīng)有的機(jī)械強(qiáng)度。相對于傳統(tǒng)的溶劑蒸發(fā)法得到的P34HB薄膜，靜電紡絲膜更有利于干細(xì)胞的增殖并向成纖維細(xì)胞進(jìn)行分化，而敷料上存在的成纖維細(xì)胞可同時促進(jìn)傷口愈合、血管形成和再生。同時，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白還可以在靜電紡絲膜表面形成一層基質(zhì)，促進(jìn)表皮細(xì)胞向傷口周圍的鄰近組織遷移［25］。

基于以上原理，具有細(xì)胞外基質(zhì)模擬結(jié)構(gòu)（ECM）的仿生支架已在傷口愈合應(yīng)用中得到廣泛研究，但它們不足的機(jī)械強(qiáng)度和有限的生物活性仍然是臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)。為解決這一缺陷，近期一項(xiàng)研究制備了一種微流控3D 打印仿生PHA 支架。該支架主要由P34HB和聚己內(nèi)酯（PCL）組成，具備優(yōu)異的拉伸強(qiáng)度（2.99 MPa）和降解性。它的ECM 模擬分層多孔結(jié)構(gòu)允許骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖并黏附在支架上。此外，負(fù)載BMSCs和HUVEC的各向異性復(fù)合支架可以顯著促進(jìn)大鼠傷口缺損中的再上皮化、膠原沉積和毛細(xì)血管形成，其表明具有令人滿意的體內(nèi)組織再生活性［26］。

通過濕法誘導(dǎo)相分離技術(shù)，Marcano 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種孔隙可調(diào)節(jié)的不對稱PHA 纖維支架。在抗菌實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)細(xì)菌與支架接觸時，高達(dá)33%的表皮葡萄球菌的生物膜形成受到抑制，而26%的已形成的生物膜會被破壞。這種抗菌性能對于解決皮膚組織修復(fù)愈合中的感染問題十分有效［27］。

以上結(jié)果均表明了基于PHA 的敷料或仿生支架用于皮膚修復(fù)和再生的可行性，為皮膚組織工程應(yīng)用提供了有效的治療策略和新的應(yīng)用前景。

3 PHA在神經(jīng)組織工程中的應(yīng)用

神經(jīng)組織損傷后的神經(jīng)再生是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重要難題，而PHA基生物材料有望為其提供解決方案［38］。Khorasani 等人通過固/液相分離方法制造了PHB 支架，并使用P19 小鼠胚胎細(xì)胞系作為體外評價的模型系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，該支架可以促進(jìn)細(xì)胞附著并分化到神經(jīng)細(xì)胞［28］。而在PHB 神經(jīng)導(dǎo)管中添加施萬細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能會達(dá)到更好的效果，進(jìn)一步增強(qiáng)神經(jīng)再生［29］。PHBV 微球具有降解速度慢和藥物釋放效率高等性能，對神經(jīng)組織工程具有重要意義。Chen 等人通過使用皮層神經(jīng)元（CN）和神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）來研究PHBV微球是否能夠支持神經(jīng)元生長，以檢測PHBV 微球作為神經(jīng)組織工程支架對于不同神經(jīng)元類型的適用性。結(jié)果表明，NPCs 可以在微球上分化為神經(jīng)元，PHBV微球作為神經(jīng)組織工程的支架可以支持多種神經(jīng)元細(xì)胞類型，并促進(jìn)了更大的軸突-樹突分離，可能有助于修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［30］。而作為PHA 家族的新成員，3-羥基丁酸、3-羥基戊酸和3-羥基己酸的三元共聚物（PHBVHHx）也可以使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSC）分化為神經(jīng)細(xì)胞［39］。

動物實(shí)驗(yàn)中，Young 等人研究了PHB 神經(jīng)導(dǎo)管在兔腓總神經(jīng)損傷模型中橋接長神經(jīng)間隙（高達(dá)4 cm）的潛力。術(shù)后第63 天，再生軸突在自體神經(jīng)移植組和PHB 導(dǎo)管組中已經(jīng)橋接了所有長度的神經(jīng)間隙，且PHB組的免疫染色再生纖維面積甚至大于自體神經(jīng)移植組。因此，PHB 導(dǎo)管支持周圍神經(jīng)再生的能力至少長達(dá)63天，并且適合于長間隙神經(jīng)損傷修復(fù)［40］。

而在一項(xiàng)具有前瞻性的臨床研究中，PHB 導(dǎo)管作為神經(jīng)外縫合的一種替代方法，用于治療手腕到前臂水平的周圍神經(jīng)損傷。12名有不同程度損傷的患者通過PHB 導(dǎo)管或顯微外科神經(jīng)外端縫合進(jìn)行治療。在經(jīng)過18 個月的臨床、神經(jīng)生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)評估后，大多數(shù)結(jié)果顯示PHB組患者與傳統(tǒng)治療組間不存在顯著差異，亦未報(bào)告與PHB相關(guān)的任何不良事件或并發(fā)癥。因此，PHB 導(dǎo)管可被視為顯微外科神經(jīng)外縫合的安全替代方案［41］。但這一研究涉及的患者數(shù)量有限，臨床上仍需要進(jìn)一步的探究確認(rèn)。

4 PHA用作藥物載體

除在上述組織工程中的應(yīng)用外，PHA還可以用作藥物載體搭載包括小分子藥物、蛋白質(zhì)、RNA 和細(xì)胞在內(nèi)的生物活性物質(zhì)（BAS）。基于PHA 的納米粒子已廣泛用于BAS遞送，尤其是用于腫瘤治療的藥物［42］。例如，將高毒性和低溶解度的模型抗癌藥物玫瑰樹堿封裝在PHBV納米粒中可以提高藥物的治療效果，使其對A549癌癥細(xì)胞系的抑制活性提高［31］?；赑HB 的納米載體還用于傳遞和控制多西紫杉醇（DTXL）的釋放，這是一種有效的抗癌藥物，與常用的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）相比，PHB 納米載體顯示出更高的載藥效率和更緩慢的釋放速率［32］。利用這一優(yōu)勢，Xiong等人還開發(fā)了使用混合PHA納米顆粒（PHB和PHBHHx）的羅丹明B 異硫氰酸鹽（RBITC）的細(xì)胞內(nèi)控制釋放，并實(shí)現(xiàn)了經(jīng)驗(yàn)證的治療效果［43］。更重要的是，紫杉醇負(fù)載的PHBV 納米顆粒表現(xiàn)出48 h 的毒性保護(hù)窗口，允許靶細(xì)胞充分內(nèi)吞藥物載體，這可以通過增強(qiáng)的滲透性和保留效應(yīng)保護(hù)抗癌劑免于過早降解［44］。

由于局部注射方便且無不良反應(yīng)，PHA微球在抗腫瘤治療和組織再生方面具有巨大潛力［45］。PHA微球中沉積的抗生素（如四環(huán)素和慶大霉素）的高包封效率和可持續(xù)釋放可以在相應(yīng)的疾病模型中獲得治療效果［33］。Zhang等人制備了直徑為5～10 μm的PHBHHx 微球，該微球攜帶了含有有綠色熒光蛋白GFP的基因的腺病毒。通過腹腔將微球注射到小鼠的胰腺中；手術(shù)后5天，胰腺中約40%的血管內(nèi)皮細(xì)胞被標(biāo)記。這種基于PHA 微球腺病毒復(fù)合物的高效胰腺毛細(xì)血管靶向植入物在未來毛細(xì)血管相關(guān)疾病治療中具有巨大潛力和價值［43］。

為了避免使用支架移植進(jìn)行大型開放手術(shù)，已經(jīng)開發(fā)出小型細(xì)胞載體并用于修復(fù)復(fù)雜的組織缺損。Wei 等人成功制造了直徑為300～360 μm 的PHA 高度開放多孔微球（OPMs），用作含有增殖干細(xì)胞的可注射載體［35］。與PLA 微球相比，PHA OPMs在小鼠同種異體骨形成和體外實(shí)驗(yàn)中顯示出更好的生物相容性，可以支持人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的增殖和分化。作為細(xì)胞的微型諾亞方舟，PHA微球有助于將體外增殖的細(xì)胞運(yùn)輸?shù)饺毕萁M織中進(jìn)行組織再生。近期，Chotchindakun 等人制備了負(fù)載有不同濃度肉桂醛（CIN）的PHBV基介孔生物活性玻璃納米顆粒（MBGN），證明了PHA顆粒作為無抗生素材料在骨缺損修復(fù)中的巨大潛力［36］。綜上所述，無論是納米顆粒、微球還是細(xì)胞載體，PHA都可以搭載不同的生物活性物質(zhì)，適配不同的應(yīng)用場景。

5 結(jié)語

本文系統(tǒng)性地總結(jié)了不同種類、不同材料形式的PHA在骨、皮膚和神經(jīng)修復(fù)及藥物遞送中的應(yīng)用和進(jìn)展，充分展示了PHA材料在組織工程中的能力和潛在價值。未來的研究將更多地集中在開發(fā)不同單聚或共聚的PHA，應(yīng)用不同的改性手段使它們適用于新的組織工程場景，并逐步走向臨床和市場。

作者貢獻(xiàn)聲明：

陳國強(qiáng)：制定選題，文章撰寫與修改。

劉心怡：文獻(xiàn)搜集及文章撰寫。

劉 絮：文章修改潤色。