應(yīng)用Cephodex微載體培養(yǎng)DF-1細(xì)胞增殖水貂源犬瘟熱病毒的技術(shù)研究

梅建國(guó)，莊金秋*，任強(qiáng)，莫玲，王艷，李峰，郭時(shí)金，付石軍，趙蕾，王建軍

(1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2. 濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東 濱州 256600；3. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

犬瘟熱(canine distemper)是犬科動(dòng)物的一種急性高致死性傳染病，每年給全球毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖造成不小的損失[1]。目前該病尚無(wú)特效治療藥物，免疫接種仍是行之有效的防控手段[2]，因此，高質(zhì)量的疫苗產(chǎn)品顯得尤為重要。通常犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)在體外細(xì)胞上的增殖水平不高，從而影響抗原的免疫原性，使臨床免疫失敗時(shí)有發(fā)生[3]。近年來(lái)，人們采用了如細(xì)胞株篩選、細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)、培養(yǎng)技術(shù)工藝優(yōu)化等眾多技術(shù)方法，以提高CDV增殖效率和病毒滴度，也取得了一定的效果[4]。本研究著重分析了在微載體懸浮培養(yǎng)條件下，收毒時(shí)間等對(duì)CDV增殖滴度的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與病毒株

雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1細(xì)胞、水貂源犬瘟熱弱毒CDV3株由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清(FBS)為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DMEM干粉為無(wú)錫市美迪生物制品公司生產(chǎn)；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)葡萄糖為Sigma公司產(chǎn)品；Cephodex型細(xì)胞培養(yǎng)微載體為濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SBA-40E生物傳感分析儀購(gòu)自山東省科學(xué)院生物研究所；Minitron 細(xì)胞培養(yǎng)搖床購(gòu)自瑞士伊孚森生物公司。

細(xì)胞生長(zhǎng)液：DMEM培養(yǎng)液中加入6%(體積比)的FBS；細(xì)胞維持液：DMEM培養(yǎng)液中加入2%(體積比)的FBS。

1.3 DF-1細(xì)胞復(fù)蘇傳代、微載體準(zhǔn)備與懸浮培養(yǎng)

取DF-1種子細(xì)胞1支于37 ℃水浴解凍，常溫下1 000 r/min離心5 min后棄上清液。用生長(zhǎng)液重懸細(xì)胞后無(wú)菌轉(zhuǎn)入T75方瓶中，加入適量生長(zhǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至72 h。胰酶消化分散后，以1∶3的比率傳代擴(kuò)增。

稱(chēng)取4份0.1 g微載體Cephodex，分別加入4只50 mL三角搖瓶中，并將每瓶加入PBS 10 mL，用玻璃棒攪拌混懸微載體。將4只搖瓶121 ℃滅菌30 min，滅菌后待溫度降至80 ℃左右混懸微載體，以防載體結(jié)團(tuán)。更換搖瓶中無(wú)菌PBS，每瓶加入1～2 mL細(xì)胞生長(zhǎng)液，37 ℃孵育24 h～72 h做無(wú)菌檢驗(yàn)。

無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，棄上清液，保留微載體，備用。用胰酶-EDTA消化液作用T75瓶中DF-1細(xì)胞，吹打分散后無(wú)菌收集，并用臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞濃度[5]。按每瓶3×106個(gè)的細(xì)胞量接種，用細(xì)胞生長(zhǎng)液定容至10 mL，將細(xì)胞與微載體混勻后放入Minitron培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)。細(xì)胞接種后0～6 h為間歇振蕩[6]，間歇時(shí)間為30～60 min，振蕩時(shí)間為1～2 min。之后，進(jìn)入連續(xù)振蕩階段，DF-1細(xì)胞進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。搖床參數(shù)如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)階段搖床控制參數(shù)

1.4 CDV3接種與毒價(jià)測(cè)定

懸浮培養(yǎng)至72 h，DF-1長(zhǎng)成細(xì)胞單層，取樣觀察細(xì)胞-微載體復(fù)合物狀態(tài)，將接毒組其中1瓶細(xì)胞培養(yǎng)液更換成細(xì)胞維持液，并按感染復(fù)數(shù)(MOI)為2.06×10-3接種CDV3[7]，另3瓶做計(jì)數(shù)的細(xì)胞取其中1瓶作健康細(xì)胞對(duì)照。將接毒細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞置于35 ℃環(huán)境中連續(xù)振蕩培養(yǎng)，其他參數(shù)不變，這些培養(yǎng)條件均是建立在前期研究成果基礎(chǔ)之上的[8]，具體參數(shù)如表2所示。病毒接種后24 h開(kāi)始取樣，采用Reed-Meunch法[9]測(cè)半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)，每隔24 h測(cè)定1次。

表2 CDV3增殖階段搖床控制參數(shù)

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)與日糖耗量測(cè)定

細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)階段，取其中3瓶搖瓶細(xì)胞每24 h做細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用生物傳感分析儀測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖含量。另外1瓶細(xì)胞只測(cè)糖含量，不做細(xì)胞計(jì)數(shù)，作為CDV3接種用。4只搖瓶培養(yǎng)液中葡萄糖的起始濃度為4.0 g/L，當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖含量低于2.0 g/L時(shí)，及時(shí)向培養(yǎng)液中流加200 g/L的葡萄糖溶液100 μL，以滿(mǎn)足細(xì)胞高密度生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。

根據(jù)培養(yǎng)液中葡萄糖初始濃度、向培養(yǎng)液中流加的葡萄糖量、以及每24 h所測(cè)得培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，計(jì)算細(xì)胞日糖耗量，觀察細(xì)胞在染毒前以及染毒后的日糖耗量變化[10]。

統(tǒng)計(jì)分析：試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 DF-1細(xì)胞的微載體培養(yǎng)

2.1.1 細(xì)胞在Cephodex上的生長(zhǎng)狀態(tài)

經(jīng)胰蛋白酶消化分散制備的DF-1細(xì)胞懸液與Cephodex微載體混合均勻，經(jīng)過(guò)6 h間歇振蕩培養(yǎng)，細(xì)胞能很好地粘附于載體表面。此時(shí)，載體表面的細(xì)胞還未鋪展，多數(shù)為圓形，少數(shù)鋪展的細(xì)胞呈梭形，如圖1A所示。圖1B可以看出，培養(yǎng)至24 h，細(xì)胞已在載體表面鋪展生長(zhǎng)，并與載體緊密貼附，且每個(gè)微球表面基本都有細(xì)胞生長(zhǎng)，幾乎沒(méi)有空球現(xiàn)象。圖1C表明，至48 h，載體微球表面80%以上區(qū)域都形成了細(xì)胞單層。在37 ℃條件下，由于DF-1細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，至72 h，微載體表面形成完整的細(xì)胞單層。一些載體微球表面，細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)成致密的復(fù)層或多層結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成明顯的突起形狀，如圖1D所示。

A. 6 h；B. 24 h；C. 48 h；D. 72 h。

在間歇振蕩階段，DF-1細(xì)胞在Cephodex微載體上黏附快、上球率高、形態(tài)良好。在連續(xù)振蕩階段，細(xì)胞在微載體表面活力高、生長(zhǎng)旺盛，形成致密的細(xì)胞單層和多層結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，Cephodex微載體與DF-1細(xì)胞的相容性好，非常適合該細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。

2.1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與糖耗水平

取其中3只搖瓶微載體培養(yǎng)的DF-1細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)72 h。從細(xì)胞接種開(kāi)始，每24 h取樣做細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)胞密度，結(jié)果如圖2所示。同時(shí)，所有4只搖瓶細(xì)胞每24 h取樣測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計(jì)算細(xì)胞日糖耗量，結(jié)果如圖3所示。

圖2 3只搖瓶生長(zhǎng)培養(yǎng)階段的DF-1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖3 4只搖瓶生長(zhǎng)培養(yǎng)階段的DF-1細(xì)胞的糖耗曲線

從圖2、圖3可以看出，37 ℃條件下，測(cè)細(xì)胞密度的3只搖瓶細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞密度上升快，培養(yǎng)48 h細(xì)胞數(shù)達(dá)2.0×106個(gè)/mL以上，且這一時(shí)間里的細(xì)胞糖耗量也呈快速上升趨勢(shì)。48 h后，細(xì)胞密度仍有增加，但增速明顯放緩。至72 h，細(xì)胞密度達(dá)峰值，約3.0×106個(gè)/mL以上，此時(shí)進(jìn)行病毒接種。細(xì)胞生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)曲線和糖耗曲線表明，細(xì)胞計(jì)數(shù)的3只搖瓶細(xì)胞生長(zhǎng)曲線差異小，且糖耗曲線也相近。因此，細(xì)胞糖耗與細(xì)胞密度之間存在高度的正相關(guān)性。為了減少對(duì)后續(xù)病毒增殖試驗(yàn)的影響，另外1瓶細(xì)胞未取樣做細(xì)胞計(jì)數(shù)。從圖3的4瓶細(xì)胞日糖耗量曲線來(lái)看，未計(jì)數(shù)搖瓶的細(xì)胞密度與計(jì)數(shù)的3瓶十分相近。

2.2 CDV3的感染增殖

2.2.1 CDV3感染DF-1產(chǎn)生的CPE

CDV3感染后不同增殖時(shí)間Cephodex表面的DF-1病變見(jiàn)圖4。在接毒組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h，未接毒的健康細(xì)胞仍保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，如圖4A。健康組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h，盡管在微載體上的密度不斷增大，形成致密的多層結(jié)構(gòu)，但很少?gòu)妮d體上脫落，如圖4B。健康細(xì)胞在培養(yǎng)至72 h后，細(xì)胞已明顯衰退，培養(yǎng)液中已開(kāi)始出現(xiàn)游離凋亡的DF-1細(xì)胞，如圖4C。繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，載體上的細(xì)胞進(jìn)一步脫落，一些載體表面開(kāi)始出現(xiàn)空球現(xiàn)象，如圖4D。

健康細(xì)胞：A. 24 h；B. 48 h；C. 72 h；D. 96 h；染毒細(xì)胞：E. 24 h；F. 48 h；G. 72 h；H. 96 h。

由圖4E可見(jiàn)，在CDV3接種后24 h，接毒組的DF-1細(xì)胞盡管有部分細(xì)胞從載體上脫落，但細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)并不明顯。圖4F表明，至48 h已有明顯的CPE現(xiàn)象，細(xì)胞開(kāi)始圓縮，并從微載體表面脫落。但細(xì)胞脫落相對(duì)較少。72 h病變已相當(dāng)嚴(yán)重，細(xì)胞大量脫落，如圖4G所示。至96 h幾乎所有細(xì)胞均完全病變，載體上基本沒(méi)有正常的DF-1細(xì)胞附著，見(jiàn)圖4H。

2.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間的病毒滴度、日糖耗量之間的差異

細(xì)胞接種病毒后，每24 h取樣測(cè)病毒滴度，同時(shí)測(cè)定同一培養(yǎng)時(shí)間的健康組與染毒組細(xì)胞培養(yǎng)基葡萄糖含量，計(jì)算細(xì)胞日糖耗量。病毒滴度測(cè)度結(jié)果如表3。

表3 接毒后不同培養(yǎng)時(shí)間的CDV3滴度

不同培養(yǎng)時(shí)間樣品的TCID50測(cè)定結(jié)果，經(jīng)IBM SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn)，搖瓶中Cephodex微載體培養(yǎng)的DF-1細(xì)胞接種CDV3后，培養(yǎng)0和24 h的病毒滴度與培養(yǎng)48、72、96 h的病毒滴度差異顯著(P<0.05)，培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)72 h和96 h、培養(yǎng)72 h與培養(yǎng)96 h的病毒滴度差異顯著(P<0.05)。細(xì)胞接毒72 h內(nèi)培養(yǎng)物中病毒滴度呈上升趨勢(shì)，表明這段時(shí)間內(nèi)病毒增殖水平較高。而培養(yǎng)72 h后病毒滴度開(kāi)始下降，至96 h下降達(dá)100.6TCID50/0.1 mL。這一結(jié)果按活病毒濃度計(jì)，則降至72 h的75%。結(jié)合圖4可以看出，72 h后大量細(xì)胞病變，并從載體表面脫落，至96 h載體上已基本沒(méi)有完整的細(xì)胞附著，表明病毒在這段時(shí)間已逐漸失去維持其增殖的活細(xì)胞基礎(chǔ)。因此，病毒滴度降低是必然的，而病毒接種后72 h則成為病毒收獲的最佳時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

日糖耗量曲線見(jiàn)圖5。在病毒增殖階段，細(xì)胞糖耗水平也呈現(xiàn)一定規(guī)律性變化。病毒接種后48 h內(nèi)，健康組細(xì)胞保持著較為穩(wěn)定的糖耗水平，而接毒組細(xì)胞糖耗則快速增加，這可能與病毒的大量增殖有關(guān)。至48 h，病毒接種組細(xì)胞日耗糖量達(dá)最高水平。48 h后，隨著病毒增殖和細(xì)胞病變的增加，載體表面的活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，接毒組細(xì)胞日糖耗量顯著下降。此時(shí)健康組細(xì)胞日糖耗量也開(kāi)始有所降低，這可能與細(xì)胞活力降低有關(guān)，但其下降幅度明顯小于病毒接種組。至72 h，接毒組與健康組細(xì)胞的日糖耗量十分相近，表明兩組細(xì)胞在活力上基本處于同一代謝水平。此時(shí)，接毒組細(xì)胞的日糖耗量幾乎降至其峰值水平的一半，而健康細(xì)胞的日糖耗量下降則非常小，僅降低10%左右。至接毒后96 h，接毒組細(xì)胞的日糖耗量已不足峰值水平的30%，而此時(shí)健康細(xì)胞的日糖耗量仍能維持在其峰值水平的70%以上。由此可見(jiàn)，能引起CPE的病毒，在病毒增殖初期可使細(xì)胞日糖耗量快速增加；而在病毒增殖的中后期，由于細(xì)胞的大量病變死亡，從而使得細(xì)胞日糖耗量呈急劇下降趨勢(shì)。

圖5 細(xì)胞感染CDV3后與健康細(xì)胞的糖耗量變化曲線

3 討論

細(xì)胞狀態(tài)的優(yōu)劣、細(xì)胞數(shù)量的高低對(duì)病毒滴度的水平和病毒抗原穩(wěn)定性有著直接影響。為了讓DF-1細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)快速穩(wěn)定生長(zhǎng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)溫度為37 ℃，考察了其中3瓶細(xì)胞的細(xì)胞糖耗與細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)系[11]。前者與后兩者呈明顯的正相關(guān)性，并在顯微鏡下細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果中得到了驗(yàn)證。由于細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞密度和細(xì)胞日糖耗量均開(kāi)始下降，表明細(xì)胞生長(zhǎng)速度開(kāi)始放緩。至72 h，細(xì)胞密度達(dá)到峰值，而日糖耗量基本不增，此時(shí)進(jìn)行病毒接種最為理想。當(dāng)然，若要確定更準(zhǔn)確的接毒時(shí)間，可對(duì)培養(yǎng)時(shí)間做進(jìn)一步的細(xì)分研究。由于多次取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，也必然影響后續(xù)的病毒增殖結(jié)果。而對(duì)上清液取樣測(cè)葡萄糖含量，一般不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損失，對(duì)病毒增殖的影響也就不大。因此，取其中的3瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)糖耗量，研究二者的數(shù)量關(guān)系十分必要。并且取其中1瓶作為健康細(xì)胞對(duì)照，另1瓶接毒用細(xì)胞則僅測(cè)糖耗量，不做細(xì)胞計(jì)數(shù)。這樣，根據(jù)所有4瓶細(xì)胞日糖耗量和已測(cè)定的3瓶細(xì)胞密度，可以預(yù)測(cè)用于接毒的這瓶細(xì)胞與3瓶對(duì)照組細(xì)胞具有相近的細(xì)胞密度，因而增加了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。當(dāng)然，僅憑細(xì)胞糖耗來(lái)推算細(xì)胞密度，可能不夠準(zhǔn)確，但相比取樣帶來(lái)的細(xì)胞損失對(duì)病毒增殖的影響，前者的試驗(yàn)誤差會(huì)小得多。

細(xì)胞接種病毒后，48 h內(nèi)的病毒滴度上升較快，細(xì)胞日糖耗量也保持較快增長(zhǎng)。而48 h后，細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生CPE，細(xì)胞糖耗呈明顯下降趨勢(shì)，病毒滴度則快速增長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞接毒培養(yǎng)至72 h，大量CPE產(chǎn)生，病毒滴度達(dá)到峰值，而糖耗則大幅下降近一半。至96 h，病毒滴度下降達(dá)100.6TCID50/0.1 mL，即活病毒濃度下降至72 h的75%，而此時(shí)的細(xì)胞糖耗不足峰值水平的30%。通過(guò)與不接毒的健康細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析可知，病毒增殖72 h可達(dá)到滴度高峰，在實(shí)際生產(chǎn)中可作為病毒收獲的最佳時(shí)間。另外，在病毒增殖階段，隨著病毒的增殖和細(xì)胞的病變，細(xì)胞日糖耗水平呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化。TCID50的測(cè)定一般需要7 d以上，時(shí)間周期長(zhǎng)，存在嚴(yán)重的滯后性，這對(duì)疫苗等的大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)物病毒滴度難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而影響生產(chǎn)過(guò)程控制和生產(chǎn)效率提升。根據(jù)病毒增殖階段病毒滴度與細(xì)胞日糖耗量的相互關(guān)系，如果后者能代替TCID50測(cè)定作為指示病毒滴度的重要指標(biāo)，那么大規(guī)模生產(chǎn)中病毒培養(yǎng)物滴度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)難題便可迎刃而解。從本研究的數(shù)據(jù)來(lái)看，病毒增殖72 h滴度可達(dá)到高峰，而此時(shí)細(xì)胞日糖耗量下降為糖耗峰值的一半。那么接毒后細(xì)胞日糖耗量下降至糖耗峰值一半左右時(shí)，是否確實(shí)為整個(gè)病毒增殖階段的TCID50達(dá)峰時(shí)間，且是否可作為最佳收毒時(shí)間，這需要進(jìn)一步做大量的研究工作，需要更詳實(shí)可靠的數(shù)據(jù)支撐。

綜上，本研究應(yīng)用新型Cephodex微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，高密度培養(yǎng)DF-1細(xì)胞增殖CDV3，重點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)過(guò)程的接毒時(shí)間、收毒時(shí)間、葡萄糖消耗測(cè)定等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行探討分析，取得了一定的成果。由于僅對(duì)CDV3微載體培養(yǎng)工藝中的幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了研究，在工業(yè)化疫苗生產(chǎn)中，仍有更多的技術(shù)條件有待進(jìn)一步優(yōu)化和完善。