基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討濕潤燒傷膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的作用機(jī)制

楊雅量，葛星月，李文武，竺仕林，姚明哲，唐乾利

（右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000）

隨著社會發(fā)展和生活水平的提高，糖尿病已成為全球十大死亡原因之一，而糖尿病潰瘍是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，大約四分之一的糖尿病患 者 會 發(fā) 生 難 愈 合 的 糖 尿 病 潰 瘍［1，2］，2022 年研究報道，全球糖尿病潰瘍患者5 年生存率僅為50.9%，10 年生存率僅為23.1%［3］，目前國際上的治療措施主要是在控制血糖基礎(chǔ)上通過傷口換藥、清創(chuàng)治療、傷口敷料、高壓氧等方法但療效不佳，許多糖尿病潰瘍患者最終被迫截肢治療［4］，可見糖尿病潰瘍?nèi)匀皇侵委熧M(fèi)用昂貴、周期長、高截肢風(fēng)險的臨床棘手問題［5］，因此，迫切需要有效的治療藥物來恢復(fù)潰瘍正常愈合過程。

近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍、燒傷等難愈性創(chuàng)面時，能顯著縮短創(chuàng)面愈合的時間、改善創(chuàng)面形態(tài)學(xué)的改變，減少瘢痕的形成，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量［6-8］，但其作用機(jī)制仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，通過“疾病-基因-蛋白質(zhì)-藥物”的相互作用，可以系統(tǒng)、全面地觀察藥物對疾病的作用，從而揭示中醫(yī)藥與疾病之間的復(fù)雜關(guān)系［9］。這種研究方法具有整體性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)的整體理論相一致，是目前中藥復(fù)方藥理作用機(jī)制研究的主要方法之一［10］。分子對接是一種基于受體與藥物分子間相互作用的藥物研究方法，可以預(yù)測分子相互作用的結(jié)合模式和親和力大小，已成為計算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)［11］。本研究聯(lián)合利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探索濕潤燒傷膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的作用機(jī)制，以期為濕潤燒傷膏的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

本研究所應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫、軟件具體信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫與軟件Tab 1 Database and Software

1.2 濕潤燒傷膏活性成分及作用靶點(diǎn)獲取及篩選

濕潤燒傷膏由黃連、罌粟殼、黃芩、黃柏、地龍等五種藥材組成，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索黃連、罌粟殼、黃芩、黃柏的活性成分及作用靶點(diǎn)信息，以藥代動力學(xué)參數(shù)（ADME）［12］為依據(jù)篩選，由于濕潤燒傷膏為外用藥物，參照同類研究文獻(xiàn)［13，14］，不將口服利用度（OB）列為篩選條件，依據(jù)類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)行篩選；數(shù)據(jù)庫中無地龍成分和靶點(diǎn)記錄，通過查閱與地龍研究相關(guān)的文獻(xiàn)［15-19］匯總地龍活性成分和靶點(diǎn)信息，最后使用UniProt 數(shù)據(jù)庫將查詢所得靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化成geneSymbol。

1.3 糖尿病潰瘍靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb五大疾病數(shù)據(jù)庫，以“diabetic ulcer”為關(guān)鍵詞搜索疾病靶點(diǎn)，經(jīng)合并去重后得到糖尿病潰瘍疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)的篩選

將1.2 中篩選得到的藥物活性成分靶點(diǎn)與1.3中篩選得到的疾病靶點(diǎn)輸入生物信息學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)分析平臺進(jìn)行匹配映射，并繪制韋恩圖，取其交集，獲得濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍潛在靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)輸入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建治療靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），設(shè)置蛋白種類為人類，最低相互作用閾值為中等，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，將結(jié)果保存為TSV 格式，應(yīng)用R語言軟件繪制靶點(diǎn)互作頻次柱狀圖。

1.6 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“濕潤燒傷膏-靶點(diǎn)-糖尿病潰瘍”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，利用cyto-NCA 插件對網(wǎng)絡(luò)做拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析，并根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選核心成分以及靶點(diǎn)。

1.7 GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析

應(yīng)用R 語言軟件對所獲濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，結(jié)果以柱狀圖和氣泡圖輸出。

1.8 關(guān)鍵化合物和核心蛋白分子對接

從PubChem 數(shù)據(jù)庫將PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前4 的活性成分的3D 結(jié)構(gòu)下載下來，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中找到靶點(diǎn)蛋白的PDBID，保存為pdb 格式，使用PyMOL 軟件對pdb 文件進(jìn)行去除水和原配體處理，Autodock Tolls 軟件為靶蛋白分子去水、加氫、分離配體與受體等操作，最后應(yīng)用Autodock vina 進(jìn)行對接，通過結(jié)合能大小評價對接活性，并通過PyMOL可視化對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 濕潤燒傷膏活性成分、靶點(diǎn)獲取及篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及所設(shè)定的條件篩選共獲得濕潤燒傷膏活性成分195 個，其中黃柏70 個，黃連31 個，黃芩72 個，罌粟殼18 個，地龍4 個；再將活性成分輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化名稱，刪除重復(fù)項和UniProt 數(shù)據(jù)庫找不到名稱的活性成分，最終獲得37 個潛在活性成分，選取12 個潛在活性成分展示見表2。再提取“RelatedTargets”模塊獲得100個濕潤燒傷膏活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。

表2 濕潤燒傷膏潛在活性成分基本信息Tab 2 Information of potential active ingredients of moist exposed burn ointment

2.2 糖尿病潰瘍靶點(diǎn)篩選

通 過 DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb 五大數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“diabetic ulcer”，分別獲得12、5 383、163、20、8 個疾病靶點(diǎn)，共5 586個疾病靶點(diǎn)，去重后剩余5 527 個疾病靶點(diǎn)。

2.3 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)篩選

將100 個濕潤燒傷膏靶點(diǎn)與5 527 個糖尿病潰瘍的靶點(diǎn)輸入生物信息學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)分析平臺進(jìn)行匹配映射，并繪制韋恩圖，見圖1，兩者取其交集，獲得濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍潛在靶點(diǎn)77 個。

圖1 藥物與糖尿病潰瘍交集靶點(diǎn)Venn 圖Fig 1 Venn diagram of drug-DU intersected targets

2.4 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建治療靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，共形成節(jié)點(diǎn)77 個，邊數(shù)424 條，見圖2。應(yīng)用R 語言軟件繪制靶點(diǎn)互作頻次柱狀圖，見圖3，將STRING 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，借助cytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治霁@得核心富集靶點(diǎn)：主要涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、TP53 基 因（tumor protein p53， TP53）、髓細(xì)胞增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene， MYC）、熱休克蛋白（heat shock protein， HSP）90AA1，表明這些靶點(diǎn)可能是濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖4（節(jié)點(diǎn)顏色深度、節(jié)點(diǎn)大小與度值大小成正比）。

圖2 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of potential targets of MEBO in treatment of DU

圖3 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)互作頻次圖Fig 3 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

圖4 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 4 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

2.5 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

在Cytoscape3.8.2 軟件中輸入濕潤燒傷膏活性成分名稱和濕潤燒傷膏潛在治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)名稱，繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5；結(jié)果顯示，濕潤燒傷膏中的刺槐素（acacetin、MOL001689）、漢黃芩素（wogonin、MOL000173）、槲皮素（quercetin、MOL000098），吳茱萸次堿（rutaecarpine、MOL002662）這幾種活性成分可能在糖尿病潰瘍的治療上發(fā)揮主要作用。

2.6 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析

應(yīng)用R 語言軟件對治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG富集分析。其中生物過程（biological process， BP）339 條、分子功能（molecular function， MF）54 條及細(xì)胞成分（cell component， CC）73 條，BP 主要包括離子轉(zhuǎn)運(yùn)、管徑調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管生成等生物學(xué)過程；MF 主要包括G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等功能；CC主要包括細(xì)胞周期蛋白、蛋白激酶復(fù)合物、突觸后膜內(nèi)在成分等，選取排名前24 位作柱狀圖（圖6）；KEGG 分析發(fā)現(xiàn)主要富集于丙型肝炎、動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K）-蛋 白 激 酶B（protein kinase B， PKB/Akt）、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of Advanced Glycation Endproducts， RAGE）等信號通路中，選取排名前30 位作氣泡圖（圖7），綜上顯示濕潤燒傷膏可能通過調(diào)控多個生物學(xué)過程、多條信號通路促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合。

圖7 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍交集靶點(diǎn)KEGG 富集通路氣泡圖Fig 7 KEGG enrichment bubble diagram of intersection target of MEBO in the treatment of DU

2.7 分子對接結(jié)果

通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫搜索核心靶點(diǎn)并下載其3D 結(jié)構(gòu)；通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫下載濕潤燒傷膏活性成分的3D 結(jié)構(gòu)，具體信息見表3。利用AutoDock Vina 和PyMOL 軟件進(jìn)行分子對接，一般認(rèn)為最低結(jié)合能低于-5.0 kJ/mol 則說明兩者結(jié)合活性良好［20］。本研究發(fā)現(xiàn)4 個活性成分與3 個靶點(diǎn)蛋白對接最低結(jié)合能均低于-5.0 kJ/mol，具體得分見圖8；并且分子對接示意圖（圖9）顯示：各靶點(diǎn)與各活性成分是通過氫鍵能分子間作用力相結(jié)合，進(jìn)一步說明活性成分與靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力，吳茱萸次堿與TNF 結(jié)合能最低，其可能是濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍最有效的活性成分。

圖8 分子對接最低結(jié)合能熱圖Fig 8 Heat map of molecular docking minimum binding energy

圖9 部分活性化合物與核心靶蛋白分子對接結(jié)果Fig 9 Molecular docking diagram of some active compounds with core target proteins

表3 靶點(diǎn)蛋白與活性成分信息Tab 3 Information of target protein and active ingredient

3 討論

糖尿病潰瘍歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“脫疽”范疇。《靈樞·癰疽》曰：“發(fā)于足趾，名脫癰，其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死。不衰，急斬之，不則死矣［21］?！贝瞬∮蓙硪丫茫壳叭院茈y找到有效的治療手段。近年來，中醫(yī)藥在治療糖尿病潰瘍方面體現(xiàn)出經(jīng)濟(jì)有效的獨(dú)特優(yōu)勢，典型代表藥物濕潤燒傷膏能明顯改變糖尿病潰瘍的病理炎癥反應(yīng)狀態(tài)，促進(jìn)血管新生，加快肉芽組織和上皮細(xì)胞的生成，明顯縮短愈合時間［22-26］，但其作用機(jī)制仍不明確。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的作用機(jī)制，通過構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型，分析發(fā)現(xiàn)濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的核心活性成分可能為刺槐素、漢黃芩素、槲皮素、吳茱萸次堿。研究表明刺槐素具有抗炎作用，可通過減少組織中的TNF-α 和IL-1β 的釋放，抑制活性氧的產(chǎn)生，減輕組織水腫，加快組織修復(fù)［27］。而漢黃芩素可通過IL-6/STAT3、PI3K/Akt通路發(fā)揮抗炎作用［28］，亦可通過減少胞內(nèi)活性氧水平，降低胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子κB 活性，進(jìn)而減弱巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［29］。槲皮素可增加白介素10、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2 表型極化來抑制炎癥反應(yīng)，從而加速糖尿病潰瘍的愈合［30，31］。吳茱萸次堿具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，吳茱萸次堿通過減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附，進(jìn)而改善縫隙連接細(xì)胞間通訊，保護(hù)血管內(nèi)皮［32］，促進(jìn)組織修復(fù)。

通過Cytoscape3.8.2 軟件中cytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治龊蚏 語言KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，交集基 因 主 要 涉 及 TNF、TP53、HSP90AA1 和PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號通路，提示濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍可能通過調(diào)控這些關(guān)鍵基因及信號通路發(fā)揮作用。TNF 是一種促炎因子，刺激單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-1β 和IL-6 等炎癥因子，此外TNF 可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶（NOS）的活性，導(dǎo)致NO 誘導(dǎo)的血管舒張減少，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，影響愈合過程［33］，已有研究證實(shí)濕潤燒傷膏能夠通過降低IL-6、TNF-α 等因子表達(dá)，從 而 改 善 創(chuàng) 面 炎 癥 反 應(yīng)，促 進(jìn) 愈 合［34，35］。PI3K-Akt 信號通路可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，研究證實(shí)濕潤燒傷膏可通過激活PI3K-Akt 信號通路，調(diào)控細(xì)胞自噬水平，抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖，從而加快大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合， 以上既往研究結(jié)果與本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測一致，表明TNF 和PI3K-Akt 信號通路是濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的主要作用靶點(diǎn)［36，37］。目前已知TP53 能抑制糖酵解并參與氧化應(yīng)激，TP53 基因多態(tài)性標(biāo)志物Pro72Arg 與多種糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)［38］，T2DM 患者的血清TP53 水平顯著升高［39］，結(jié)合本次分析結(jié)果推測TP53 可能在糖尿病等代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。AGE-RAGE 信號通路則是糖尿病潰瘍愈合過程的重要通路，在高血糖狀態(tài)下，組織基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)蓄積大量晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs），AGE 與其配體RAGE 結(jié)合后產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致組織持續(xù)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，延遲潰瘍愈合［40，41］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在AGE 修飾的牛血清白蛋白存在的情況下，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞會失去其增殖和遷移能力［42］，并且在傷口中發(fā)現(xiàn)AGE 及其配體RAGE 的表達(dá)水平增加及AGE-RAGE 結(jié)合會抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖［43］，表明AGE-RAGE 信號通路與糖尿病潰瘍愈合密切相關(guān)，另外分子對接結(jié)果也顯示：槲皮素、吳茱萸次堿等活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、TP53、HSP90AA1 的結(jié)合活性良好，表明濕潤燒傷膏可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等過程在糖尿病潰瘍中發(fā)揮治療作用。

綜上所述，濕潤燒傷膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路進(jìn)行作用的復(fù)雜過程，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接初步闡明了其治療過程可能涉及TNF、TP53、HSP90AA1 等核心靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號通路發(fā)揮促愈合作用，為濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的進(jìn)一步研究提供了思路，但其作用機(jī)制和療效還需在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說明：

楊雅量：文章的構(gòu)思、論文的撰寫；竺仕林：數(shù)據(jù)收集；姚明哲：數(shù)據(jù)整理；葛星月、李文武：論文的可行性分析、修訂；唐乾利：文章的質(zhì)量控制與審查，對文章整體負(fù)責(zé)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。