基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接探討濕潤燒傷膏促進糖尿病潰瘍愈合的作用機制

楊雅量，葛星月，李文武，竺仕林，姚明哲，唐乾利

（右江民族醫(yī)學院研究生院，廣西 百色 533000）

隨著社會發(fā)展和生活水平的提高，糖尿病已成為全球十大死亡原因之一，而糖尿病潰瘍是糖尿病最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，大約四分之一的糖尿病患 者 會 發(fā) 生 難 愈 合 的 糖 尿 病 潰 瘍［1，2］，2022 年研究報道，全球糖尿病潰瘍患者5 年生存率僅為50.9%，10 年生存率僅為23.1%［3］，目前國際上的治療措施主要是在控制血糖基礎上通過傷口換藥、清創(chuàng)治療、傷口敷料、高壓氧等方法但療效不佳，許多糖尿病潰瘍患者最終被迫截肢治療［4］，可見糖尿病潰瘍?nèi)匀皇侵委熧M用昂貴、周期長、高截肢風險的臨床棘手問題［5］，因此，迫切需要有效的治療藥物來恢復潰瘍正常愈合過程。

近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)應用濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍、燒傷等難愈性創(chuàng)面時，能顯著縮短創(chuàng)面愈合的時間、改善創(chuàng)面形態(tài)學的改變，減少瘢痕的形成，進而提高患者的生活質(zhì)量［6-8］，但其作用機制仍不明確。網(wǎng)絡藥理學是一門新興學科，通過“疾病-基因-蛋白質(zhì)-藥物”的相互作用，可以系統(tǒng)、全面地觀察藥物對疾病的作用，從而揭示中醫(yī)藥與疾病之間的復雜關系［9］。這種研究方法具有整體性和系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)的整體理論相一致，是目前中藥復方藥理作用機制研究的主要方法之一［10］。分子對接是一種基于受體與藥物分子間相互作用的藥物研究方法，可以預測分子相互作用的結合模式和親和力大小，已成為計算機輔助藥物研究領域的一項重要技術［11］。本研究聯(lián)合利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，探索濕潤燒傷膏促進糖尿病潰瘍愈合的作用機制，以期為濕潤燒傷膏的開發(fā)與利用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

本研究所應用的數(shù)據(jù)庫、軟件具體信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫與軟件Tab 1 Database and Software

1.2 濕潤燒傷膏活性成分及作用靶點獲取及篩選

濕潤燒傷膏由黃連、罌粟殼、黃芩、黃柏、地龍等五種藥材組成，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索黃連、罌粟殼、黃芩、黃柏的活性成分及作用靶點信息，以藥代動力學參數(shù)（ADME）［12］為依據(jù)篩選，由于濕潤燒傷膏為外用藥物，參照同類研究文獻［13，14］，不將口服利用度（OB）列為篩選條件，依據(jù)類藥性（DL）≥0.18 進行篩選；數(shù)據(jù)庫中無地龍成分和靶點記錄，通過查閱與地龍研究相關的文獻［15-19］匯總地龍活性成分和靶點信息，最后使用UniProt 數(shù)據(jù)庫將查詢所得靶點名稱標準化成geneSymbol。

1.3 糖尿病潰瘍靶點獲取

運用DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb五大疾病數(shù)據(jù)庫，以“diabetic ulcer”為關鍵詞搜索疾病靶點，經(jīng)合并去重后得到糖尿病潰瘍疾病相關靶點。

1.4 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點的篩選

將1.2 中篩選得到的藥物活性成分靶點與1.3中篩選得到的疾病靶點輸入生物信息學和進化基因組學分析平臺進行匹配映射，并繪制韋恩圖，取其交集，獲得濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍潛在靶點。

1.5 構建濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點PPI網(wǎng)絡

將濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍相關靶點輸入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，構建治療靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡（protein-protein interaction，PPI），設置蛋白種類為人類，最低相互作用閾值為中等，其他參數(shù)保持默認設置，將結果保存為TSV 格式，應用R語言軟件繪制靶點互作頻次柱狀圖。

1.6 構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

運用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“濕潤燒傷膏-靶點-糖尿病潰瘍”的關系網(wǎng)絡，利用cyto-NCA 插件對網(wǎng)絡做拓撲學結構分析，并根據(jù)拓撲學參數(shù)篩選核心成分以及靶點。

1.7 GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析

應用R 語言軟件對所獲濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點進行GO 和KEGG 富集分析，結果以柱狀圖和氣泡圖輸出。

1.8 關鍵化合物和核心蛋白分子對接

從PubChem 數(shù)據(jù)庫將PPI 網(wǎng)絡中排名前4 的活性成分的3D 結構下載下來，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中找到靶點蛋白的PDBID，保存為pdb 格式，使用PyMOL 軟件對pdb 文件進行去除水和原配體處理，Autodock Tolls 軟件為靶蛋白分子去水、加氫、分離配體與受體等操作，最后應用Autodock vina 進行對接，通過結合能大小評價對接活性，并通過PyMOL可視化對接結果。

2 結果

2.1 濕潤燒傷膏活性成分、靶點獲取及篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及所設定的條件篩選共獲得濕潤燒傷膏活性成分195 個，其中黃柏70 個，黃連31 個，黃芩72 個，罌粟殼18 個，地龍4 個；再將活性成分輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫標準化名稱，刪除重復項和UniProt 數(shù)據(jù)庫找不到名稱的活性成分，最終獲得37 個潛在活性成分，選取12 個潛在活性成分展示見表2。再提取“RelatedTargets”模塊獲得100個濕潤燒傷膏活性成分對應的靶點。

表2 濕潤燒傷膏潛在活性成分基本信息Tab 2 Information of potential active ingredients of moist exposed burn ointment

2.2 糖尿病潰瘍靶點篩選

通 過 DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb 五大數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“diabetic ulcer”，分別獲得12、5 383、163、20、8 個疾病靶點，共5 586個疾病靶點，去重后剩余5 527 個疾病靶點。

2.3 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點篩選

將100 個濕潤燒傷膏靶點與5 527 個糖尿病潰瘍的靶點輸入生物信息學和進化基因組學分析平臺進行匹配映射，并繪制韋恩圖，見圖1，兩者取其交集，獲得濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍潛在靶點77 個。

圖1 藥物與糖尿病潰瘍交集靶點Venn 圖Fig 1 Venn diagram of drug-DU intersected targets

2.4 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點PPI網(wǎng)絡構建

應用STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫構建治療靶點PPI網(wǎng)絡，共形成節(jié)點77 個，邊數(shù)424 條，見圖2。應用R 語言軟件繪制靶點互作頻次柱狀圖，見圖3，將STRING 數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.8.2 軟件對網(wǎng)絡進行可視化分析，借助cytoNCA 插件進行拓撲屬性分析獲得核心富集靶點：主要涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、TP53 基 因（tumor protein p53， TP53）、髓細胞增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene， MYC）、熱休克蛋白（heat shock protein， HSP）90AA1，表明這些靶點可能是濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的關鍵靶點，見圖4（節(jié)點顏色深度、節(jié)點大小與度值大小成正比）。

圖2 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點PPI 網(wǎng)絡Fig 2 PPI network of potential targets of MEBO in treatment of DU

圖3 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點互作頻次圖Fig 3 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

圖4 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的關鍵靶點網(wǎng)絡Fig 4 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

2.5 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建及分析

在Cytoscape3.8.2 軟件中輸入濕潤燒傷膏活性成分名稱和濕潤燒傷膏潛在治療糖尿病潰瘍靶點名稱，繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病”互作網(wǎng)絡圖，見圖5；結果顯示，濕潤燒傷膏中的刺槐素（acacetin、MOL001689）、漢黃芩素（wogonin、MOL000173）、槲皮素（quercetin、MOL000098），吳茱萸次堿（rutaecarpine、MOL002662）這幾種活性成分可能在糖尿病潰瘍的治療上發(fā)揮主要作用。

2.6 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析

應用R 語言軟件對治療靶點進行GO 和KEGG富集分析。其中生物過程（biological process， BP）339 條、分子功能（molecular function， MF）54 條及細胞成分（cell component， CC）73 條，BP 主要包括離子轉(zhuǎn)運、管徑調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管生成等生物學過程；MF 主要包括G 蛋白偶聯(lián)受體結合、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合等功能；CC主要包括細胞周期蛋白、蛋白激酶復合物、突觸后膜內(nèi)在成分等，選取排名前24 位作柱狀圖（圖6）；KEGG 分析發(fā)現(xiàn)主要富集于丙型肝炎、動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K）-蛋 白 激 酶B（protein kinase B， PKB/Akt）、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of Advanced Glycation Endproducts， RAGE）等信號通路中，選取排名前30 位作氣泡圖（圖7），綜上顯示濕潤燒傷膏可能通過調(diào)控多個生物學過程、多條信號通路促進糖尿病潰瘍愈合。

圖7 濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍交集靶點KEGG 富集通路氣泡圖Fig 7 KEGG enrichment bubble diagram of intersection target of MEBO in the treatment of DU

2.7 分子對接結果

通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫搜索核心靶點并下載其3D 結構；通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫下載濕潤燒傷膏活性成分的3D 結構，具體信息見表3。利用AutoDock Vina 和PyMOL 軟件進行分子對接，一般認為最低結合能低于-5.0 kJ/mol 則說明兩者結合活性良好［20］。本研究發(fā)現(xiàn)4 個活性成分與3 個靶點蛋白對接最低結合能均低于-5.0 kJ/mol，具體得分見圖8；并且分子對接示意圖（圖9）顯示：各靶點與各活性成分是通過氫鍵能分子間作用力相結合，進一步說明活性成分與靶點具有良好的結合能力，吳茱萸次堿與TNF 結合能最低，其可能是濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍最有效的活性成分。

圖8 分子對接最低結合能熱圖Fig 8 Heat map of molecular docking minimum binding energy

圖9 部分活性化合物與核心靶蛋白分子對接結果Fig 9 Molecular docking diagram of some active compounds with core target proteins

表3 靶點蛋白與活性成分信息Tab 3 Information of target protein and active ingredient

3 討論

糖尿病潰瘍歸屬于中醫(yī)學“消渴”“脫疽”范疇?！鹅`樞·癰疽》曰：“發(fā)于足趾，名脫癰，其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死。不衰，急斬之，不則死矣［21］?！贝瞬∮蓙硪丫茫壳叭院茈y找到有效的治療手段。近年來，中醫(yī)藥在治療糖尿病潰瘍方面體現(xiàn)出經(jīng)濟有效的獨特優(yōu)勢，典型代表藥物濕潤燒傷膏能明顯改變糖尿病潰瘍的病理炎癥反應狀態(tài)，促進血管新生，加快肉芽組織和上皮細胞的生成，明顯縮短愈合時間［22-26］，但其作用機制仍不明確。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的作用機制，通過構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡模型，分析發(fā)現(xiàn)濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的核心活性成分可能為刺槐素、漢黃芩素、槲皮素、吳茱萸次堿。研究表明刺槐素具有抗炎作用，可通過減少組織中的TNF-α 和IL-1β 的釋放，抑制活性氧的產(chǎn)生，減輕組織水腫，加快組織修復［27］。而漢黃芩素可通過IL-6/STAT3、PI3K/Akt通路發(fā)揮抗炎作用［28］，亦可通過減少胞內(nèi)活性氧水平，降低胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子κB 活性，進而減弱巨噬細胞介導的炎癥反應［29］。槲皮素可增加白介素10、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）的表達，通過調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2 表型極化來抑制炎癥反應，從而加速糖尿病潰瘍的愈合［30，31］。吳茱萸次堿具有保護血管內(nèi)皮細胞損傷的作用，在內(nèi)皮細胞損傷模型中，吳茱萸次堿通過減輕內(nèi)皮細胞凋亡，同時抑制內(nèi)皮細胞與單核細胞的黏附，進而改善縫隙連接細胞間通訊，保護血管內(nèi)皮［32］，促進組織修復。

通過Cytoscape3.8.2 軟件中cytoNCA 插件進行拓撲屬性分析和R 語言KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，交集基 因 主 要 涉 及 TNF、TP53、HSP90AA1 和PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號通路，提示濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍可能通過調(diào)控這些關鍵基因及信號通路發(fā)揮作用。TNF 是一種促炎因子，刺激單核細胞和內(nèi)皮細胞分泌IL-1β 和IL-6 等炎癥因子，此外TNF 可抑制血管內(nèi)皮細胞中一氧化氮合酶（NOS）的活性，導致NO 誘導的血管舒張減少，從而導致內(nèi)皮功能障礙，影響愈合過程［33］，已有研究證實濕潤燒傷膏能夠通過降低IL-6、TNF-α 等因子表達，從 而 改 善 創(chuàng) 面 炎 癥 反 應，促 進 愈 合［34，35］。PI3K-Akt 信號通路可參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能調(diào)節(jié)，研究證實濕潤燒傷膏可通過激活PI3K-Akt 信號通路，調(diào)控細胞自噬水平，抑制脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞增殖，從而加快大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合， 以上既往研究結果與本次網(wǎng)絡藥理學預測一致，表明TNF 和PI3K-Akt 信號通路是濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的主要作用靶點［36，37］。目前已知TP53 能抑制糖酵解并參與氧化應激，TP53 基因多態(tài)性標志物Pro72Arg 與多種糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機制相關［38］，T2DM 患者的血清TP53 水平顯著升高［39］，結合本次分析結果推測TP53 可能在糖尿病等代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。AGE-RAGE 信號通路則是糖尿病潰瘍愈合過程的重要通路，在高血糖狀態(tài)下，組織基質(zhì)和細胞內(nèi)蓄積大量晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs），AGE 與其配體RAGE 結合后產(chǎn)生多種細胞因子，導致組織持續(xù)的氧化應激和炎癥反應，延遲潰瘍愈合［40，41］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在AGE 修飾的牛血清白蛋白存在的情況下，表皮角質(zhì)形成細胞會失去其增殖和遷移能力［42］，并且在傷口中發(fā)現(xiàn)AGE 及其配體RAGE 的表達水平增加及AGE-RAGE 結合會抑制表皮角質(zhì)細胞增殖［43］，表明AGE-RAGE 信號通路與糖尿病潰瘍愈合密切相關，另外分子對接結果也顯示：槲皮素、吳茱萸次堿等活性成分與關鍵靶點TNF、TP53、HSP90AA1 的結合活性良好，表明濕潤燒傷膏可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡和增殖以及介導炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等過程在糖尿病潰瘍中發(fā)揮治療作用。

綜上所述，濕潤燒傷膏促進糖尿病潰瘍愈合是通過多成分、多靶點、多通路進行作用的復雜過程，通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接初步闡明了其治療過程可能涉及TNF、TP53、HSP90AA1 等核心靶點，調(diào)控PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號通路發(fā)揮促愈合作用，為濕潤燒傷膏治療糖尿病潰瘍的進一步研究提供了思路，但其作用機制和療效還需在體內(nèi)外實驗及臨床應用中進一步驗證。

作者貢獻度說明：

楊雅量：文章的構思、論文的撰寫；竺仕林：數(shù)據(jù)收集；姚明哲：數(shù)據(jù)整理；葛星月、李文武：論文的可行性分析、修訂；唐乾利：文章的質(zhì)量控制與審查，對文章整體負責。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。