酶在液體洗滌劑中的應(yīng)用研究

李伏益 史立文 鐘 凱 洪 鄭 劉煒康 雷小英 洪玉倩

1.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州，311300；

2.浙江省贊宇表面活性劑重點(diǎn)企業(yè)研究院，浙江杭州，311300

隨著人們對(duì)美好生活需求的日益增長(zhǎng)，消費(fèi)者對(duì)洗滌劑的要求已不滿足于簡(jiǎn)單的去除污漬，更加注重洗滌劑溫和、安全、綠色環(huán)保、可再生等特性，同時(shí)，洗滌劑的功能化需求不斷凸顯。表面活性劑是洗滌劑的主要有效成分，但對(duì)奶漬、汗?jié)n等頑固的大分子污漬清除不干凈，而酶制劑可以有效分解這些污漬，且作用溫和、安全、專一、高效，具有對(duì)人體無毒無害、易降解、不會(huì)污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。洗滌劑中常用的4種酶[1]包括：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶，其中蛋白酶能夠?qū)⒛虧n等蛋白質(zhì)污垢降解成易溶于水的肽鏈，脂肪酶能將油脂水解成易被水沖洗的甘油二酯、甘油單酯和脂肪酸，淀粉酶則能夠針對(duì)性地分解和去除淀粉污漬（如飯漬），至于纖維素酶，雖然其本身不能去除污垢，但能減少植物纖維“起球”傾向和提高織物清潔度。

本文選用蛋白酶、纖維素酶為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉(AES)、十二烷基苯磺酸鈉(LAS)、α-烯烴磺酸鹽（AOS）、脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO7）分別與蛋白酶、纖維素酶的相互作用影響，同時(shí)優(yōu)化出加酶洗衣液的基礎(chǔ)配方。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；移液槍，德國(guó)VITLAB公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司。

溢倍凈P-L001，溢倍凈C-L001，廣州溢多利生物科技股份有限公司；纖維素酶，堿性蛋白酶，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；Carezyme Premium 5000L，Progress UNO 100L，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；REVITALENZ?200，PREFERENZ?P300，IFF國(guó)際香料香精公司；脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES）、十二烷基苯磺酸（LAS）、α-烯基磺酸鈉（AOS），贊宇科技集團(tuán)股份有限公司；脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO7），三江化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟與測(cè)試方法

（1）探究單一表面活性劑與酶制劑的相互作用：分別配制AES、AEO7、LAS、AOS的10%水溶液，pH值統(tǒng)一調(diào)節(jié)至8.5，加入1%的酶制劑，攪拌均勻后在37 ℃下靜置，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)試酶活力。

（2）探究不同復(fù)配表面活性劑與酶制劑的相互作用：將AES、AOS、LAS分別與AEO7按照質(zhì)量比1∶1配制成10%的AES/AEO7、AOS/AEO7、LAS/AEO7溶液，再分別加入1%酶制劑，攪拌均勻后在37 ℃下靜置，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)試酶活力。

（3）液體洗滌劑應(yīng)用研究：按照以下兩個(gè)基礎(chǔ)配方體系（配方1：磺酸體系；配方2：無磺酸體系），分別加入0.1%纖維素酶、0.1%蛋白酶，對(duì)體系進(jìn)行酶活力和去污力的研究。

表1 洗衣液基礎(chǔ)配方

（4）按照QB 2583-2003中羧甲基纖維素（還原糖法）酶活力（CMCA-DNS）測(cè)定方法對(duì)纖維素酶制劑進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

（5）按照GB/T 23527-2009中福林法對(duì)蛋白酶制劑進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定。

（6）按照GB/T 13174-2021對(duì)國(guó)標(biāo)污布JB-01、JB-02、JB-03進(jìn)行洗滌，經(jīng)洗滌的污布自然晾干后測(cè)其白度值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶、蛋白酶與表面活性劑的相互作用

2.1.1 纖維素酶與表面活性劑的相互作用

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：由圖1可見，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖BAS濃度與吸光度OD值具有良好的線性關(guān)系。得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.27851x+0.00174，R2＝0.9996。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）不同市售纖維素酶與表面活性劑的相互影響：分別配制質(zhì)量濃度為10%的表面活性劑AEO7、AES、AOS、LAS的溶液，研究該濃度的表面活性劑對(duì)質(zhì)量濃度為1%的不同市售纖維素酶活力的影響。將纖維素酶和表面活性劑溶液放在37 ℃的水浴鍋中保溫，在0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h取樣測(cè)試酶活力。

由圖2～圖5可知，4個(gè)市售纖維素酶與表面活性劑的相互影響趨勢(shì)一致，不同市售纖維素酶的酶活力大小順序?yàn)椋菏惺酃?樣品＞市售公司2樣品＞市售公司3樣品＞市售公司1樣品，對(duì)纖維素酶失活影響順序均是：LAS＞AOS＞AES＞AEO7。比起陰離子表面活性劑，AEO7對(duì)纖維素酶活力的影響并不大，5 h內(nèi)纖維素酶活力均保持在90%以上，因?yàn)樗谒芤褐兄挥惺杷?，沒有電荷的吸引（或斥力），所以對(duì)酶的構(gòu)象改變很小[2]。AES、AOS、LAS對(duì)纖維素酶活力都有較大影響，對(duì)纖維素酶失活影響順序是：LAS＞AOS＞AES，由于氧原子電負(fù)性大于碳和硫原子，氧硫鍵中成鍵電子對(duì)偏移向氧原子，所以AES在水溶液中電離度小于LAS和AOS，對(duì)酶位點(diǎn)中心電荷作用微弱[3]。

圖2 不同市售纖維素酶與AEO7的相互影響

圖5 不同市售纖維素酶與LAS的相互影響

（3）纖維素酶與復(fù)配的表面活性劑的相互影響：通常洗衣液中的主要成分是由表面活性劑及其助劑等組成。由以上實(shí)驗(yàn)可知，非離子表面活性劑AEO7對(duì)纖維素酶活力的影響較小，故進(jìn)一步考察AES/AEO7、AOS/AEO7、LAS/AEO7兩種表面活性劑復(fù)配后對(duì)纖維素酶活力的影響。在前面實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上可知市售公司4樣品酶活力最高，選用該纖維素酶作為參照，按照方法1.2探究不同復(fù)配表面活性劑與纖維素酶的相互作用。

由圖6可知，添加了非離子表面活性劑AEO7后，顯著提高AES、AOS、LAS與纖維素酶的兼容性，反應(yīng)5 h后，纖維素酶剩余酶活力為60%以上。由此可知，雖然LAS對(duì)纖維素酶活的影響較大，但與AEO7復(fù)配后，纖維素酶活力顯著提高，其原因是陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑復(fù)配后[4]，形成了混合膠束，非離子表面活性劑插入陰離子表面活性劑的膠束中，從而降低了相鄰分子間的電荷斥力[5]，因此形成更小的膠束，同時(shí)每個(gè)膠束的電荷密度下降，對(duì)酶活力的影響變小[6]。

圖6 纖維素酶與復(fù)配的表面活性劑的相互影響

2.1.2 蛋白酶與表面活性劑的相互作用

（1）L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：由圖7可見，標(biāo)準(zhǔn)L-酪氨酸BAS濃度與吸光度OD值具有良好的線性關(guān)系。得出L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.01026x-0.00365，R2＝0.9996。

圖7 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）不同市售蛋白酶與表面活性劑的相互影響：分別配制質(zhì)量濃度為10%的表面活性劑AEO7、AES、AOS、LAS的溶液，研究該濃度的表面活性劑對(duì)質(zhì)量濃度為1%的不同市售蛋白酶活力的影響。將蛋白酶和表面活性劑溶液放在37 ℃的水浴鍋中保溫，在0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h取樣測(cè)試酶活力。

由圖8～圖11可知，4個(gè)市售公司的蛋白酶與表面活性劑的相互影響趨勢(shì)一致，且不同市售的酶活力大小順序?yàn)椋菏惺酃?樣品＞市售公司2樣品＞市售公司3樣品＞市售公司1樣品，對(duì)蛋白酶失活影響順序均是：LAS＞AOS＞AES＞AEO7，LAS對(duì)蛋白酶活力影響最大，在100 min時(shí)蛋白酶幾乎失活。表面活性劑與蛋白酶的相互作用與纖維素酶影響是一致的，究其原因還是表面活性劑的疏水基進(jìn)入酶的活性中心[7]，兩者通過靜電引力和范德華力，與酶形成了復(fù)合物。這種復(fù)合物可誘導(dǎo)膠束的形成，引起蛋白酶的構(gòu)象和表面性質(zhì)的變化，從而抑制蛋白酶的活性。

圖8 不同市售蛋白酶與AEO7的相互影響

圖9 不同市售蛋白酶與AES的相互影響

圖10 不同市售蛋白酶與LAS的相互影響

圖11 不同市售蛋白酶與AOS的相互影響

（3）不同市售蛋白酶與復(fù)配表面活性劑相互影響：通常洗衣液中的主要成分是由表面活性劑及其助劑等組成。由以上實(shí)驗(yàn)可知，非離子表面活性劑AEO7對(duì)蛋白酶活力的影響較小，故進(jìn)一步考察AES/AEO7、AOS/AEO7、LAS/AEO7兩種表面活性劑復(fù)配后對(duì)蛋白酶活力的影響。在前面實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上可知市售公司4樣品酶活力最高，選用該蛋白酶作為參照。按照方法1.2探究不同復(fù)配表面活性劑與蛋白酶的相互作用。

由圖12可知，蛋白酶與LAS復(fù)配2 h時(shí)，其酶活力喪失100%，在與AEO7復(fù)配后，其酶活力明顯提高，提高至80%；AES、AOS與AEO7復(fù)配后，其酶活力均有提高，大大增加了其在液體洗滌劑中的應(yīng)用范圍。

圖12 蛋白酶與復(fù)配的表面活性劑的相互影響

2.2 纖維素酶、蛋白酶在洗衣液中的應(yīng)用性能研究

2.2.1 纖維素酶、蛋白酶在洗衣液中的應(yīng)用

根據(jù)上述表面活性劑對(duì)纖維素酶和蛋白酶的結(jié)果，市售公司4樣品在表面活性劑中相對(duì)穩(wěn)定，市售公司2樣品最不穩(wěn)定，考慮到上述市售公司4蛋白酶可能本身就添加了穩(wěn)定劑，所以接下來將以市售公司2樣品為基礎(chǔ)，加入不同種類酶制劑的穩(wěn)定劑，考察其穩(wěn)定的效果。按照配方1、配方2分別加入0.1%纖維素酶（市售公司2樣品），分別放置在37 ℃下測(cè)試?yán)w維素酶的相對(duì)酶活力。

由圖13、圖14可知，配方2中纖維素酶、蛋白酶的酶活力均大于配方1中的酶活力，這是由于配方1中含有表面活性劑LAS，LAS對(duì)酶制劑的穩(wěn)定性影響較大，易使酶活力降低。

圖13 蛋白酶在洗衣液中的相對(duì)酶活力

圖14 纖維素酶在洗衣液中的相對(duì)酶活力

2.2.2 穩(wěn)定劑的篩選

由于配方1體系酶穩(wěn)定較差，故選用配方1分別加入0.1%纖維素酶和0.1%蛋白酶得到2個(gè)基礎(chǔ)配方，再分別加入不同的酶制劑穩(wěn)定劑，放置7 d后測(cè)試?yán)w維素酶的相對(duì)酶活力。

由圖15可以看出，檸檬酸鈣及氯化鈣對(duì)蛋白酶、纖維素酶的酶活保持率具有顯著的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)殁}離子作為大多數(shù)酶的輔基能夠與酶的活性中心結(jié)合[8]，使酶活性中的疏水結(jié)構(gòu)向內(nèi)部轉(zhuǎn)移，增加酶分子的剛性從而提高酶的穩(wěn)定性。但是檸檬酸鈣在水中溶解度低，穩(wěn)定能力有限。多元醇作為最常用的穩(wěn)定劑之一，能通過結(jié)合蛋白質(zhì)周圍的自由水，降低水活度來提高酶的穩(wěn)定性，但在實(shí)驗(yàn)中，山梨醇和甘油的穩(wěn)定作用并不明顯，可能是因?yàn)闈舛忍筒蛔阋孕纬伞八ぁ眮肀Ｗo(hù)蛋白酶，或者是洗衣液中大量的表面活性劑和助劑弱化了多元醇對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定作用。綜上所述，選用氯化鈣作為穩(wěn)定劑。

圖15 不同種類的穩(wěn)定劑對(duì)纖維素酶、蛋白酶的影響

2.2.3 確定穩(wěn)定劑的加入量

按照配方1分別加入0.1%纖維素酶和0.1%蛋白酶配制成2個(gè)基礎(chǔ)配方，再分別加入不同量的氯化鈣，在37 ℃下放置30 d后測(cè)試?yán)w維素酶的相對(duì)酶活力。

由圖16可知，隨著氯化鈣的添加量增大，酶制劑的相對(duì)酶活力越高，但是當(dāng)氯化鈣的加入量達(dá)到0.02%時(shí)，酶的相對(duì)酶活力趨于平衡，故氯化鈣的添加量宜選用0.02%。

圖16 不同氯化鈣添加量對(duì)蛋白酶、纖維素酶的影響

2.2.4 纖維素酶、蛋白酶復(fù)配對(duì)污布污漬洗滌性能的研究

去污力是洗衣液最重要的一個(gè)指標(biāo)，由于去污力受表面活性劑比例以及酶制劑的影響，而表面活性劑比例又影響著酶制劑的酶活力，為保證蛋白酶和纖維素酶的高酶活力，本實(shí)驗(yàn)在配方2中進(jìn)行優(yōu)化，選用了無磺酸體系的基礎(chǔ)配方，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行分析。分別選擇蛋白酶、纖維素酶、AEO7/AOS（AES和AEO7的總量占配方6%）三種因素、三水平設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)表，以確定復(fù)合酶、表面活性劑最佳配比，實(shí)驗(yàn)因素如表2所示。

表2 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)

為了研究復(fù)合酶對(duì)洗衣液去污性能的影響，按照表2配方進(jìn)行投料，并按照 GB13174-2021國(guó)標(biāo)對(duì)污布JB-01、JB-02、JB-03進(jìn)行洗滌，經(jīng)洗滌的污布自然晾干后測(cè)其白度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，蛋白酶、纖維素酶、AEO7/AOS的最佳配比組合為C3A3B3，即AEO7/AOS、蛋白酶、纖維素酶分別為1∶2、0.06%、0.06%，由于纖維素酶加入量對(duì)綜合污布影響不大，且三個(gè)水平影響基本差不多，從實(shí)際應(yīng)用的角度看，纖維素酶制劑選用B1水平，即0.04%較為合適，綜上所述，最佳方案為AEO7/AOS、蛋白酶、纖維素酶分別為1∶2、0.06%、0.04%。AEO7/AOS的比例不同，不僅影響去污力，還影響酶制劑的酶活，從而影響的酶制劑對(duì)去污力產(chǎn)生影響。因此，AEO7/AOS對(duì)去污值的影響最大，AEO7/AOS的比值越大對(duì)酶制劑的酶活具有穩(wěn)定作用，這一點(diǎn)可從JB-02蛋白污布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看出，而AOS雖然對(duì)酶活影響較大，但本身的去污能力較強(qiáng)，所以相對(duì)而言較AEO7的總?cè)ノ郾戎涤绊戄^大。要提高體系總?cè)ノ坌Ч?，一方面要提高AOS的比例，以增強(qiáng)對(duì)碳黑和皮脂的洗滌效果；另一方面也要防止AOS比例升高對(duì)酶制劑酶活的負(fù)面影響。添加纖維素酶對(duì)三種污布去污能力均有提高，因?yàn)槔w維素酶作用于織物非結(jié)晶區(qū)[9-10]的特殊作用機(jī)制，能夠使織物結(jié)構(gòu)變得蓬松，使夾雜在織物纖維間的污漬更容易與其他酶接觸，從而達(dá)到去污效果。

3 結(jié)論

（1）對(duì)纖維素酶、蛋白酶失活影響順序均是：LAS＞AOS＞AES＞AEO7，相對(duì)于陰離子表面活性劑，AEO7對(duì)纖維素酶活力的影響并不大。

（2）AEO7與陰離子表面活性劑復(fù)配后，可以明顯提高酶制劑在陰離子表面活性劑中的酶活力；AES、AOS、LAS與AEO7復(fù)配后，其相對(duì)酶活力均有提高，大大增加了其在液體洗滌劑中的應(yīng)用范圍。

（3）氯化鈣可以提高酶制劑在洗衣液中的穩(wěn)定性，且最佳加入量為0.02%。

（4）在無磺酸體系的洗衣液中，洗衣液配方的最佳方案為AEO7/AOS、蛋白酶、纖維素酶分別為1∶2、0.06%、0.04%。