基于減損采肉的纖維化重組魚糜及其凝膠品質(zhì)

葉偉建，焦熙棟，張文海，張娜娜1，，閆博文1，，黃建聯(lián)，趙建新，張灝，陳衛(wèi)，范大明1，*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)加工冷藏與調(diào)理重點實驗室，福建 廈門 361022；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.福建省冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點實驗室，福建 廈門 361022；4.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；5.安井食品集團股份有限公司，福建 廈門 361022）

冷凍魚糜是魚體組織經(jīng)預處理、采肉、漂洗、精濾、脫水、混合斬拌和速凍等工序制成的水產(chǎn)魚肉中間產(chǎn)品，可進一步加工成魚糜制品[1]。為提升冷凍魚糜的貯藏穩(wěn)定性，傳統(tǒng)魚糜加工過程中魚肉組織充分破碎，有利于內(nèi)源酶組分、脂質(zhì)及其它雜質(zhì)的分離，進而濃縮肌原纖維蛋白[2]。然而，魚肌肉纖維在加工過程中，經(jīng)過滾筒擠壓式采肉機、精濾機等高機械力工序加工，魚肉纖維組織遭到過度破壞、糜化，使魚糜制品膠質(zhì)化口感嚴重，缺乏纖維肉感，誤使消費者認為此類產(chǎn)品添加了大量的膠體類添加劑[3]。此外，傳統(tǒng)魚糜加工過程中多次漂洗會導致大量水溶性魚肉蛋白損失，主要包括漂洗水中的水溶性蛋白和回轉篩漂洗階段過濾回收的細小魚肉蛋白[4]。因此，研究魚糜的減損加工、適度漂洗及纖維化重組等加工技術是目前魚糜加工領域的研究重點之一。

目前，圍繞魚糜適度加工技術的研究已有部分報道，例如，探究不同魚肉破碎方式對魚肉蛋白理化和凝膠特性的影響[5-6]，研究發(fā)現(xiàn)高強度剪切對魚糜超微結構的破壞性更大，導致更嚴重的蛋白變性[7]，而溫和破碎加工方式也可以適度提高魚糜的凝膠特性[6]。一些關于適度漂洗的研究也表明通過減少漂洗次數(shù)[8-9]、改良漂洗工藝[10-11]、采用輔助漂洗[12]等方式也可以提高魚糜品質(zhì)，減少漂洗污水的排放等。近期，Yu 等[3]通過機器學習的方式，將纖維影像學與卷積神經(jīng)網(wǎng)絡結合，建立了針對魚肉纖維化程度的評價方法。

本研究以適度減損加工和魚糜纖維化重組再造為思路，通過制備小尺寸魚糜顆粒來模擬實際工業(yè)過程中流失的回收魚肉蛋白，并采用等電點沉降法回收漂洗水中流失的蛋白，探究剖片式采肉及內(nèi)外源組分對魚糜纖維化程度及凝膠特性的影響，從而實現(xiàn)冷凍魚糜加工中流失蛋白的高效利用和重組纖維化魚糜的加工生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白鰱魚、食鹽：市售；谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG 酶，10 000 U/g）：江蘇一鳴生物股份有限公司；無水乙醇、冰醋酸、甲醇、十二烷基硫酸鈉（均為分析純）、中性樹膠：國藥集團化學試劑有限公司；伊紅染液：福州飛凈生物科技有限公司；冷凍切片包埋劑：德國徠卡公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel elec trophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（5×）：上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；塑料腸衣：安井食品集團股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DRB-Y400 去皮機：上海達瑞寶食品機械有限公司；YC-12S 臺式絞肉機：鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)江新區(qū)巧廚娘食品機械有限公司；GY-JL-100 半自動魚肉精濾機：贛云食品機械廠；KMM040 廚師機：邑隆貿(mào)易（上海）有限公司；SZ200 手搖式灌腸機、SU504 U 型封口機：安井食品集團股份有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TW-20 精密水浴槽：無錫旭野科技有限公司；CM1950 冷凍切片機：德國徠卡公司；TA-XTplus 物性分析儀：英國Stable Micro System 公司；UltraScan Pro1166 高精度分光散色儀：美國HunterLab 公司；Bio-Rad 型凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂公司；T18 digital ULTRA-TURRAX 數(shù)顯分散機：德國IKA 公司；BA410E 正置顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；Precision7920 塔式工作站：戴爾（中國）有限公司；FE28 型pH 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 減損魚糜與回收魚肉蛋白的制備

將白鰱魚致暈后立即宰殺（去頭、去尾、去皮和內(nèi)臟），使用去皮機對魚體肌肉部分進行剖片式采肉，根據(jù)白鰱肌間刺距離魚體表層的深度，以不采到魚刺為參照，每次采肉厚度為1 mm，共采集3～6 次，之后進行1 次漂洗和壓榨脫水，控制魚糜最終水分含量在78%左右，稱為減損魚糜。剖片采肉后的魚體組織經(jīng)絞肉機破碎后（3 mm 孔徑），用5 倍體積的冰水進行2 次漂洗和1 次0.3 g/100 mL NaCl 溶液漂洗，之后紗布過濾脫水后進行精濾（2 mm），離心脫水控制水分含量在80%左右，制備小尺寸魚糜顆粒，來模擬實際生產(chǎn)過程中的回收魚肉蛋白。

1.3.2 纖維化魚糜的制備

稱取回收魚肉蛋白總質(zhì)量60%的純凈水，溶解0.1%或0.2%（質(zhì)量分數(shù)）的TG 酶，并與回收魚肉蛋白共混處理，分別靜置6、8 h 和10 h，之后離心脫水并控制魚糜最終水分含量在78%左右。將處理后的回收魚肉蛋白按照30%比例與1.3.1 中制備的減損魚糜攪拌混合，壓塊成型后制成纖維化魚糜，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 魚糜漂洗水中水溶性蛋白的回收

參考石柳等[13]的方法，利用等電點沉降法回收第1 次漂洗水中的水溶性蛋白，用1 mol/L 鹽酸將其pH值調(diào)至5.3 左右，靜置1 h 后，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心15 min，棄掉上清液得回收的水溶性蛋白（含水量為84.24%）。另外，向回收的水溶性蛋白中加入0.1%（質(zhì)量分數(shù)）的TG 酶，混勻后放置于4 ℃預處理6 h，按10%的添加量加入到減損魚糜中，用于探究水溶性內(nèi)源蛋白組分對減損魚糜凝膠特性的影響。

1.3.4 魚糜凝膠的制備

魚糜解凍后，稱取各類魚糜500 g 置于廚師機中采用K 字攪拌槳攪拌1 min，加入3%（質(zhì)量分數(shù)）食鹽并攪拌3 min。在攪拌的過程中每隔30 s 暫停1 次，期間加入冰水控制溫度和調(diào)節(jié)水分。攪拌均勻的漿料立即灌腸封裝，采用兩段式加熱方式進行加熱[14]，即水浴40 ℃加熱30 min 和90 ℃加熱20 min，之后迅速放入冰水中冷卻，而后放置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.5 凝膠強度的測定

參考Huang 等[15]的方法，破斷力和破斷距離的測定選用P/5S 球形探頭。測試參數(shù)：最大穿刺距離15.00 mm，測前速度為1.00 mm/s，測試速度為1.00 mm/s，測后速度為2.00 mm/s。每個樣品重復5 次，取平均值，凝膠強度以破斷力與破斷距離的乘積表示。

1.3.6 全質(zhì)構分析

參考An 等[16]的方法，選用P/36R 柱形探頭進行全質(zhì)構分析。測試參數(shù)：樣品下壓程度15%，測前速度為1.00 mm/s，測試速度為1.00 mm/s，測后速度為2.00 mm/s。每個樣品重復5 次，取平均值。

1.3.7 持水力的測定

將魚糜凝膠切成2 mm 的薄片，稱量5.0 g 左右樣品，用4 層濾紙包裹后放置于離心管中8 000 r/min 離心10 min，按照下述公式計算凝膠的持水力（water holding capacity，WHC）[17]，每個樣品重復3 次，取平均值。

H=M2/M1×100

式中：H為凝膠持水力，%；M1為離心前質(zhì)量，g；M2為離心后質(zhì)量，g。

1.3.8 色澤的測定

參照Wang 等[18]的方法，將樣品切成10 mm 薄片，測定樣品亮度L*、紅度a*、黃度b*，并按照下面公式計算凝膠的白度（W）。每個樣品重復5 次，取平均值。

W=100-[（100-L*）2+a*2+b*2]1/2

1.3.9 SDS-PAGE

參照Balange 等[19]的方法，凝膠樣品與5%SDS 溶液均質(zhì)后于85 ℃水浴加熱1 h，離心后采用BCA 法測定上清液濃度，并調(diào)至1 mg/mL。蛋白樣品與5×SDSPAGE 緩沖液按4∶1（體積比）混合，煮沸5 min 后進行電泳分析，電泳凝膠采用4%濃縮膠和10%的分離膠，采用考馬斯亮藍進行染色，并脫色至蛋白條帶清晰。

1.3.10 魚糜纖維的切片及圖像采集

樣品在約-80 ℃下的異戊烷中快速冷凍，并在-80 ℃下儲存，在冷凍切片機上切割制片（10 μm），之后用伊紅進行染色，乙醇脫色后用中性樹膠封片保存，并使用帶有成像系統(tǒng)的顯微鏡進行圖像采集。顯微鏡參數(shù)設置見表1[20]。

表1 顯微鏡參數(shù)設置Table 1 Parameter settings of the microscope

1.3.11 魚糜纖維化程度的評價

采用Yu 等[3]構建的EFANet-50 模型和創(chuàng)建的生魚肉體系纖維圖片數(shù)據(jù)集，EFANet-50 模型是在ResNet-50 的基礎上，通過增加對邊緣特征注意力機制來構建新的模型。EFANet-50 模型在生魚肉體系纖維圖片數(shù)據(jù)集上訓練后的最佳識別準確率達到94.27%，將此時模型的權重和偏差保存，用于識別魚糜纖維化程度。圖像處理與模型測試相關的步驟均使用Python 3.7 編寫腳本，并在Pytorch 1.6.0 的環(huán)境下運行。

1.3.12 工藝過程的中試放大

按照圖1所示工藝過程進行放大中試，通過回收實際生產(chǎn)過程中兩道回轉篩中的魚肉蛋白，并進行TG酶預處理和回填，制備試驗中所描述的纖維化魚糜，后與經(jīng)傳統(tǒng)采肉、漂洗、精濾和螺桿擠壓所制備的傳統(tǒng)魚糜進行對比。

圖1 纖維化魚糜與傳統(tǒng)魚糜加工工藝流程Fig.1 Flowchart of the processing of fibrous surimi and traditional surimi

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

測試數(shù)據(jù)和圖形處理分別采用Excel 2016 和Graphpad prism 9 軟件，差異顯著性分析采用SPSS 16.0 軟件中Duncan 法評價，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 TG 酶處理對回收魚肉蛋白狀態(tài)的影響

經(jīng)TG 酶預處理后的回收魚肉蛋白（加鹽后）表觀狀態(tài)及蛋白質(zhì)組成變化如圖2所示。

圖2 TG 酶處理后回收魚肉蛋白表觀狀態(tài)和蛋白組成變化Fig.2 Apparent state and protein patterns of recycled fish protein treated with transglutaminase

TG 酶對尺寸較小的回收魚肉蛋白有較好的交聯(lián)效果，如圖2（A）所示，未經(jīng)TG 酶處理的魚糜在加入鹽后攪拌呈抱團狀態(tài)，這主要是魚糜中肌原纖維蛋白在鹽離子作用下充分溶出，使物料的表觀黏度和狀態(tài)發(fā)生變化[21]。隨著TG 酶含量增加和處理時間延長，回收魚肉蛋白加鹽后的抱團能力明顯減弱，魚糜顆粒的硬度也逐漸升高，這是因為TG 酶使得顆粒魚糜外表面蛋白發(fā)生交聯(lián)固化，因此阻礙了內(nèi)部鹽溶蛋白的溶出。圖2（B）中不同處理組的電泳條帶變化也可以說明TG 酶處理可促進魚糜蛋白交聯(lián)，因此可觀察到肌球蛋白重鏈（220 kDa）條帶的減弱，有研究也表明肌球蛋白分子是TG 酶首選的底物蛋白之一，其分子內(nèi)部存在大量的酶活性作用位點[22]。

2.2 TG 酶處理對纖維化魚糜凝膠特性的影響

TG 酶處理對纖維化魚糜凝膠特性的影響見圖3。

圖3 TG 酶處理后纖維化魚糜凝膠強度和持水力的變化Fig.3 Changes of gel strength and water holding capacity of fibrous surimi gel treated with transglutaminase

凝膠強度和持水力是反映魚糜凝膠品質(zhì)特性的重要指標[23]。由圖3（A）可知，當回收魚肉蛋白經(jīng)0.1%TG 酶處理8 h 后添加到減損魚糜中時，魚糜凝膠有最大的凝膠強度值，其次是0.2%TG 酶處理6 h 組。然而，TG 酶處理時間繼續(xù)延長時，纖維化魚糜的凝膠強度顯著降低（P＜0.05），這可能是由于長時間處理導致顆粒表面交聯(lián)變硬，導致其與減損魚糜顆粒間難以形成較強的交聯(lián)網(wǎng)絡，從而導致魚糜凝膠強度的降低。圖3（B）所示持水力變化也可反映出纖維化魚糜凝膠網(wǎng)絡結構的變化，與未經(jīng)TG 酶處理組相比，經(jīng)過用0.1%TG酶處理8 h 的魚糜凝膠持水力顯著提高（P＜0.05）。以上結果表明，適當條件的TG 酶處理有助于減損魚糜和回收魚肉蛋白的重組，使其具有較好的凝膠特性。

2.3 TG 酶處理對纖維化魚糜凝膠全質(zhì)構與白度的影響

對纖維化魚糜凝膠的全質(zhì)構和白度進行測定，結果如表2所示。

表2 TG 酶處理對纖維化魚糜凝膠全質(zhì)構與白度的影響Table 2 Effect of transglutaminase on the texture and whiteness of fibrous surimi gel

由表2 可知，0.1%TG 酶處理6 h 或8 h 以及0.2%TG 酶處理6 h 可以顯著降低魚糜凝膠的硬度，但是魚糜凝膠在彈性方面沒有顯著變化（P＞0.05）。硬度表示使物體變形所需要的力，回收魚肉蛋白的加入會改變重組魚糜中的內(nèi)部結構，證明通過TG 酶預處理可以得到質(zhì)地更加柔軟的魚糜凝膠。咀嚼性反映出魚糜凝膠咀嚼的難易程度，一般可作為硬度值的補充參數(shù)[24]。凝膠的回復性代表凝膠在外力作用形變后的回復能力，是魚糜凝膠彈性和凝聚性的綜合體現(xiàn)[25]，由表2 可知，所有的TG 酶處理組間的凝聚性和回復性均高于空白處理組，但是不同處理條件間并沒有顯著性差異（P＞0.05）。白度值結果表明回收魚肉蛋白經(jīng)0.1%TG酶處理并不會顯著降低魚糜凝膠的白度（P＞0.05），然而當TG 酶添加量為0.2%時，魚糜凝膠的白度顯著降低，這主要是由于TG 酶處理會使回收魚肉蛋白的黃度值升高。綜上所述，選擇TG 酶添加量0.1%、酶處理時間8 h 作為處理回收魚肉蛋白的最優(yōu)條件，將處理后的回收魚肉蛋白與減損魚糜進行重組，所制備的纖維化魚糜具有較優(yōu)的凝膠特性，并對其進行后續(xù)的纖維化程度評價。

2.4 水溶性蛋白對減損魚糜凝膠特性的影響

水溶性蛋白對減損魚糜凝膠特性的影響如圖4所示。

圖4 添加水溶性蛋白后減損魚糜凝膠強度和持水力的變化Fig.4 Changes of gel strength and water holding capacity of loss reduction surimi gel with water soluble protein addition

由圖4 可知，將水溶性蛋白回填至減損魚糜中會顯著降低其凝膠強度和持水力，說明肌漿中水溶性蛋白對魚糜凝膠具有一定的劣化作用。淡水白鰱魚體中內(nèi)源性組織蛋白酶活性較高，在第1 次漂洗過程中可被大量洗出[26]。另外，沉淀后的水溶性蛋白光滑細膩，也可能會阻礙凝膠的形成。然而回填經(jīng)TG 酶處理的水溶性蛋白后，凝膠強度得到了顯著提升（P＜0.05），這主要是TG 酶對魚糜凝膠品質(zhì)的強化作用所致。

2.5 魚糜纖維的圖像采集

不同處理條件下得到的魚糜纖維圖像如圖5所示。

圖5 不同處理條件下魚糜纖維切片F(xiàn)ig.5 Sliced images of surimi fiber under different treatment conditions

從圖5 可以看出，采用剖片式采肉所得到的減損魚糜能夠保留較為完整的纖維結構，纖維紋理清晰，而回收魚肉蛋白的肌纖維破壞嚴重。采用TG 酶對回收魚肉蛋白進行預處理后，破損斷裂的纖維蛋白發(fā)生網(wǎng)狀交聯(lián)，纖維連接更加緊密，但TG 酶處理對試驗所回收的水溶性蛋白的交聯(lián)沒有明顯的影響，將水溶性蛋白回填到減損魚糜中并沒有促進纖維明顯的交聯(lián)。纖維化魚糜的纖維圖像顯示，通過減損魚糜與TG 酶處理的回收魚肉蛋白進行重組結合，可以既保留部分纖維也能將破碎纖維適度連接，實現(xiàn)條狀纖維和網(wǎng)狀纖維網(wǎng)絡的交互。

2.6 魚糜纖維化程度的評價

采用EFANet-50 模型對魚糜纖維程度的評價結果如圖6所示。

圖6 不同處理條件下魚糜的纖維化程度Fig.6 Fiber degree of surimi under different treatment conditions

傳統(tǒng)魚糜加工過程中，采肉和精濾過程對魚肉纖維的破壞程度較大，而通過剖片式減損采肉技術，能較大程度保留魚肉的纖維結構。由圖6 可知，減損魚糜的纖維程度達到82.74%，而回收魚肉蛋白的纖維化程度僅40.41%?；厥蒸~肉蛋白通過TG 酶處理后，肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)，纖維化程度顯著上升（P＜0.05），而水溶性蛋白經(jīng)過TG 酶處理前后，纖維化程度無顯著性差異（P＞0.05）。因回收魚肉蛋白和水溶性蛋白的纖維化程度較低，導致回填回收魚肉蛋白的重組纖維化魚糜以及回填水溶性蛋白的減損魚糜的纖維化程度均低于減損魚糜，但纖維化魚糜的纖維化程度仍保持在68%以上。

2.7 纖維化魚糜與傳統(tǒng)魚糜的凝膠差異分析

上述結果表明本研究所建立的減損采肉技術和重組方法可制備纖維化魚糜，為了進一步驗證和對比纖維化魚糜與傳統(tǒng)魚糜的品質(zhì)差異，對工藝過程進行中試放大，經(jīng)中試得到的纖維化魚糜與傳統(tǒng)魚糜凝膠強度測試結果如圖7所示。因為在纖維化魚糜重組的過程中引入了外源TG 酶組分，所以試驗中也向傳統(tǒng)魚糜和減損魚糜中加入等量TG 酶組分作參考組。

圖7 纖維化魚糜與傳統(tǒng)魚糜凝膠強度對比Fig.7 Comparison of gel strength between new fibrous surimi and traditional surimi

由圖7 可知，添加TG 酶會顯著提高傳統(tǒng)魚糜、減損魚糜和回填魚肉蛋白的重組魚糜的凝膠強度，但相較于傳統(tǒng)魚糜，剖片式減損魚糜的凝膠強度更低，這主要是因為魚糜顆粒較大時蛋白溶出不充分，并導致破斷距離較低。向減損魚糜中添加10%回收魚肉蛋白后并未對重組魚糜的凝膠強度產(chǎn)生影響。纖維化魚糜的凝膠強度顯著低于添加TG 酶的傳統(tǒng)魚糜（P＜0.05），但其凝膠強度保持率為77.14%。最后，由于此類纖維化魚糜在加工過程中添加了TG 酶組分，因此在后續(xù)魚糜制品加工過程中，可根據(jù)產(chǎn)品需求微量添加或不添加外源性TG 酶，以避免引起魚糜制品的物性品質(zhì)的變化。

3 結論

本試驗采用剖片采肉方式制備減損魚糜，并與經(jīng)TG 酶預處理的回收魚肉蛋白混合重組制成纖維化魚糜，并對其凝膠特性和纖維化程度進行研究。結果表明，減損魚糜可保留較多的肌肉纖維結構，當TG 酶添加量為0.1%并處理8 h 時，纖維化魚糜的凝膠強度和持水力最高，但過量的TG 酶處理會導致回收魚肉蛋白顆粒交聯(lián)變硬，進而影響重組魚糜的凝膠強度和質(zhì)構特性。進一步研究發(fā)現(xiàn)回填漂洗水中的水溶性蛋白會降低減損魚糜的凝膠強度和持水能力。最后，經(jīng)評估剖片式減損魚糜的纖維化程度可達到82.74%，向減損魚糜中加入經(jīng)TG 酶處理的回收魚肉蛋白制成纖維化魚糜后，其纖維化程度顯著降低（P＜0.05），但仍具有68.08%的纖維化度。水溶性蛋白的回填也可顯著降低減損魚糜的纖維化程度（P＜0.05）。進一步中試放大研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)魚糜相比，纖維化魚糜的凝膠強度保持率大于75%。綜上，采用此方法制備的冷凍魚糜具有較好的凝膠特性和纖維化程度，可批量生產(chǎn)用于魚糜新產(chǎn)品的創(chuàng)制。