產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其益生性能評價

張樂,丁一珍,潘媛娜,李科,耿燕,周娟,許泓瑜,李恒*,許正宏,史勁松

1(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無錫,214112) 2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214112)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類公認(rèn)的重要腸道益生菌,具有維持胃腸道菌群平衡、促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫功能、降低膽固醇等多方面生理功能[1]。乳酸菌腸道益生作用的發(fā)揮,與其代謝產(chǎn)生的多種有益代謝物密不可分[2]。部分乳酸菌在代謝過程中所產(chǎn)生的細(xì)菌素,又稱抗菌肽,是一種生物活性多肽,能在靶細(xì)菌細(xì)胞膜上形成通道或直接抑制某些細(xì)胞功能而發(fā)揮高效抑菌或殺菌作用,在腸道健康中受到廣泛關(guān)注[3]。

研究表明,產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌可通過抑制病原微生物生長、競爭排斥或競爭黏附等方式促進(jìn)自身及其他益生菌在腸道內(nèi)的定植[4-5],從而調(diào)節(jié)紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu),穩(wěn)定腸內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)。NAIMI等[6]在模擬豬近端結(jié)腸的體外發(fā)酵模型上證明了細(xì)菌素MccJ25對紐波特沙門氏菌的抑制活性,并在腸道炎癥小鼠模型[7]中發(fā)現(xiàn)給予MccJ25可減少腸道病原體定植,保護(hù)宿主免受腸毒性大腸桿菌的感染。一些乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素結(jié)合了抗菌特性和宿主導(dǎo)向活性[8],通過免疫調(diào)節(jié)或者誘導(dǎo)宿主腸道抗菌肽的表達(dá)[9],進(jìn)一步促進(jìn)病原體的排除,如加氏乳桿菌產(chǎn)生的環(huán)狀細(xì)菌素加氏菌素A調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的液體吸收和分泌能力,促進(jìn)了導(dǎo)致早期斷奶仔豬腹瀉的微生物的消除[10]。此外,產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌還具有緩解慢性感染、炎癥性腸病和肥胖等疾病的能力,如從母乳中分離的產(chǎn)細(xì)菌素干酪乳酸菌可與腸道病原體競爭,減少結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系和膽固醇水平,并改善小鼠模型中的炎癥性腸病[11];植物乳桿菌NCMIB8826產(chǎn)生的植物乳桿菌素EF能有效改善在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中顯示出有益的作用[12]。因此,進(jìn)一步挖掘具有高效抑菌作用的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌,并分析評價其腸道益生活性,對推進(jìn)乳酸菌通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)干預(yù)或治療疾病等應(yīng)用具有重要的作用。

本研究以大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922為指示菌,通過有機(jī)酸和過氧化氫排除試驗、蛋白酶敏感試驗,篩選得到一株抑菌能力較強(qiáng)、產(chǎn)細(xì)菌素的哈爾濱乳桿菌(Lactobacillusharbinensis)P1-1,并對其益生性能進(jìn)行評價,同時通過共培養(yǎng)的方式評價其與特定微生物之間的相互作用,為進(jìn)一步豐富對產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的了解和拓展應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料

指示菌株E.coliNissle1917、L.plantarumCGMCC No.18389、E.coliATCC 25922、StaphylococcussepidermidisATCC 12228均保藏于本實驗室。

蛋白胨、酵母粉,OXOID公司;牛肉膏、葡萄糖、CH3COONa、檸檬酸氫二銨、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胰蛋白胨、NaCl、蔗糖、膽鹽、吐溫80、酵母膏、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖、無水乙醇、卡那霉素、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10.0,酵母粉5.0,蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,CH3COONa 5.0,檸檬酸氫二銨2.0,K2HPO4·3H2O 2.0,MnSO4·4H2O 0.05,MgSO4·7H2O 0.2,吐溫80 1.0。115 ℃,滅菌20 min后備用。

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0, 酵母粉5.0, NaCl 10.0,121 ℃,滅菌150 min后備用。

1.1.3 溶液配制

人工胃液:取0.1 mol/L HCl用蒸餾水調(diào)節(jié)pH值至2.0,加入胃蛋白酶0.01 g/mL,溶解均勻后微孔濾膜除菌備用。

人工腸液:取KH2PO42.04 g,加蒸餾水150 mL溶解,用4 g/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8,加入胰蛋白酶0.01 g/mL,溶解均勻后微孔濾膜除菌備用。

1.1.4 儀器與設(shè)備

小型低溫離心機(jī),德國Eppendorf公司;酶標(biāo)儀,Molecular Devices公司;PCR儀、實時熒光定量PCR儀,BIO-RAD公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海實驗儀器廠有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋,美國AUTOCLAVE Engineers公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌活性評價

采用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性評價實驗。抑菌乳酸菌的篩選以E.coliATCC 25922為指示菌。取100 μL 稀釋至107CFU/mL的指示菌培養(yǎng)液于提前準(zhǔn)備好的LB平板上,涂布均勻后晾干,用無菌鑷子夾取滅菌后的牛津杯于平板上。供試乳酸菌在37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,測定發(fā)酵液OD600值,并將發(fā)酵液分別于4 500 r/min離心10 min,取200 μL上清液加入牛津杯中,之后在指示菌最適生長溫度37 ℃下培養(yǎng)24 h,測定各乳酸菌抑菌圈直徑,計算抑菌圈直徑與OD600比值,以單位菌體對應(yīng)的抑菌圈大小作為抑菌效果評價依據(jù)。選定乳酸菌的抑菌活性以E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228為指示菌株再次評價,目標(biāo)菌株于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),取4、8、12、16、20、24 h的發(fā)酵上清液進(jìn)行評價。

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選與確定

1.2.2.1 乳酸菌的篩選與鑒定

分別取酸乳和酵素樣本10 g加至90 mL生理鹽水中,振蕩使之充分混勻,梯度稀釋后取10-5、10-6、10-7菌液分別均勻涂布于MRS平板中,置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng),24 h后通過菌落形態(tài)初步鑒定,從中挑選出符合菌種特征的菌株進(jìn)行劃線分離,挑選單菌落在液體MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng),培養(yǎng)24 h取樣進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.2.2 排除有機(jī)酸的干擾

測定各供試乳酸菌發(fā)酵液上清的pH,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0,之后進(jìn)行抑菌實驗。以利用1 mol/L乳酸、乙酸調(diào)節(jié)成相同pH且未接種的MRS培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.2.3 排除過氧化氫的干擾

將過氧化氫酶加入到各供試乳酸菌發(fā)酵上清液中,使過氧化氫酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。以不使用過氧化氫酶處理的各供試菌發(fā)酵上清液為空白對照,評價處理后發(fā)酵上清液抑菌活性的變化。

1.2.2.4 蛋白類抑菌物質(zhì)的確定

用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)各供試乳酸菌發(fā)酵上清液至胃蛋白酶最適作用pH 2.0,加入胃蛋白酶使其終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,37 ℃水浴2 h后煮沸滅酶,之后將pH值調(diào)節(jié)到5.0并加入終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的過氧化氫酶進(jìn)行抑菌活性測定。

1.2.3 16S rDNA序列同源性分析

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取篩選得到的乳酸菌總DNA,以菌株基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增16S rDNA基因片段。上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增體系與條件包括:反應(yīng)體系30 μL,DNA模板2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus) 15 μL,ddH2O 11 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)34次,72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。凝膠電泳檢驗合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果拼接后在NCBI中數(shù)據(jù)庫利用BLAST進(jìn)行同源性比對,選取序列一致性在98%以上的部分序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 乳酸菌益生性能評價

1.2.4.1 胃腸液耐受性評價

將篩選所得菌株的24 h發(fā)酵液按體積比1∶10接種至人工胃液中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng),分別在0、1、2、3 h取樣,對人工胃液中的活菌進(jìn)行稀釋和涂布計數(shù);將接入人工胃液中作用3 h的懸濁液進(jìn)一步以體積比1∶10加至人工腸液中,分別在4、5、6、7 h取樣計數(shù)獲得活菌數(shù),存活率的計算如公式(1)所示,公式(1)評價了菌株對模擬胃腸液的耐受能力。

(1)

式中:Ni為不同時間對應(yīng)的活菌數(shù);N0為初始活菌數(shù)。

1.2.4.2 膽鹽耐受性評價

向MRS培養(yǎng)基中分別添加0.3、0.6、0.9、1.2 g/L的膽鹽,滅菌備用。將篩選所得菌株分別接種到上述培養(yǎng)基中,以MRS培養(yǎng)基為對照,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,取樣進(jìn)行活菌計數(shù),并按照公式(1)求出其存活率。

1.2.5 共培養(yǎng)體系構(gòu)建及RT-qPCR檢測

以篩選所得菌株為研究對象,分別選擇2株益生菌E.coliNissle 1917和L.plantarumCGMCC No.18389,以及2株條件致病菌E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228作為共培養(yǎng)菌株,并按最優(yōu)接種比(10∶3)接種,于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。以篩選菌株、E.coliNissle 1917、L.plantarumCGMCC No.18389、E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228 5株菌的純培養(yǎng)體系為對照,在0、4、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)行取樣,測量OD600值、pH值及抑菌活性。

采用RT-qPCR對共培養(yǎng)時體系中的不同微生物拷貝數(shù)進(jìn)行測定。提取共培養(yǎng)發(fā)酵液的總RNA作為模板,以表1所示序列作為引物。RT-qPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增體系及條件為:反應(yīng)體系25 μL,DNA模板1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,SYBR Green Master Mix 12 μL,ddH2O 10 μL。RT-qPCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性10 s,54 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,循環(huán)40次,65 ℃梯度升溫至95 ℃,4 ℃保存。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3次,實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示,使用Graphpad Prism軟件繪圖與分析,使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選

細(xì)菌素是益生菌發(fā)揮抑菌作用的重要代謝產(chǎn)物,可以通過抑制致病菌,促進(jìn)有益菌的定殖來調(diào)節(jié)腸道菌群從而發(fā)揮腸道益生功能[13]。益生性乳酸菌通過代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、過氧化氫等多種物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用和調(diào)節(jié)腸道生態(tài)[14]。其中,以細(xì)菌素作為抑菌物在復(fù)雜腸道菌群調(diào)節(jié)中具有更高的穩(wěn)定性[15]。本研究根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定,從酸乳和酵素樣本中共篩選到20株穩(wěn)定生長的微生物。經(jīng)16S rDNA序列同源比對,鑒定得到乳桿菌屬15株(L.paracaseiJN-1、L.paracaseiJN-2、L.paracaseiJN-3、L.brevisJN-6、L.fermentumJN-7、L.fermentumJN-8、L.fermentumJN-9、L.fermentumJN-10、L.harbinensisP1-1、L.helveticusP1-2、L.brucelliP1-3、L.plantarumP1-7、L.plantarumP1-8、L.plantarumP1-9、L.plantarumP1-10),片球菌屬2株(PediococcuspentosaceusJN-4、P.lactisJN-5),腸球菌屬2株(EnterococcusfaecalisP1-4、E.faeciumP1-5),鏈球菌屬1株(StreptococcusthermophilusP1-6)。為篩選高產(chǎn)細(xì)菌素的野生型乳酸菌,進(jìn)一步以E.coliATCC 25922作為指示菌,對這20株乳酸菌進(jìn)行進(jìn)一步篩選,通過排除有機(jī)酸干擾試驗、過氧化氫酶試驗、蛋白酶敏感試驗,評估并獲得具有較強(qiáng)抑菌活性的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌。首先,通過未排除酸與過氧化氫干擾的抑菌結(jié)果分析,E.faeciumP1-4、L.paracaseiJN-1、L.paracaseiJN-2和L.harbinensisP1-1單位菌體密度的抑菌活性較高,抑菌圈直徑與OD600的比值超過6,S.thermophilusP1-6和L.plantarumP1-7的比值<3,抑菌活性較低(圖1-a)。為排除有機(jī)酸對抑菌活性的干擾,統(tǒng)一調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值為5.0再測試乳酸菌抑菌性能。如圖1-b所示,大部分乳酸菌的抑菌活性均有所下降,但仍保留有較強(qiáng)的抑菌活性,其中L.brucellaP1-3、L.harbinensisP1-1和L.plantarumP1-10單位菌體密度的抑菌活性>4,表明這些乳酸菌發(fā)酵液中除有機(jī)酸外還有其他物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用。進(jìn)一步排除過氧化氫干擾。如圖1-c所示,經(jīng)過氧化氫酶處理后,大部分乳酸菌抑菌活性幾乎沒有下降,說明過氧化氫在其發(fā)酵上清中占比較低,對整體抑菌活性的貢獻(xiàn)不高。由于乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素易被蛋白酶分解,故最后利用蛋白酶處理驗證乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的能力,結(jié)果如圖1-d所示。部分乳酸菌對大腸桿菌的抑菌活性顯著下降,甚至趨于喪失。其中,抑菌能力下降最為顯著的是L.harbinensisP1-1,其抑菌圈直徑/OD600值僅為1.18,遠(yuǎn)小于其他菌株,說明其發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)主要為細(xì)菌素。因而選定篩得的L.harbinensisP1-1作為研究對象詳細(xì)開展評價。

a-未排除干擾實驗;b-排除有機(jī)酸干擾實驗;c-排除過氧化氫干擾實驗;d-蛋白酶敏感實驗圖1 二十株乳酸菌的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of 20 lactic acid bacteria

2.2 菌株L.harbinensis P1-1的同源分析及益生性能評價

通過16S rDNA基因序列測定及同源性比對分析,選取序列一致性在98%以上的部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示,L.harbinensisP1-1與L.harbinensisM1親緣關(guān)系最為接近,該菌是從天然發(fā)酵豆腐乳清中分離得到的一株益生性乳酸菌,能夠抑制單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌等的生長,具有胃腸液耐受和膽鹽耐受等益生特性[16]。

圖2 L.harbinensis P1-1的16 s rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of L.harbinensis P1-1

乳酸菌作為一種益生菌,對胃腸液及膽鹽的耐受性是菌株在宿主體內(nèi)存活、生長并發(fā)揮腸道益生功能的前提[17]。采用模擬胃腸液及膽鹽環(huán)境評價L.harbinensisP1-1的消化液耐受性。如圖3和表2所示,L.harbinensisP1-1在人工胃液中3 h仍具有90%以上的存活率;在人工腸液中4 h,存活率仍接近90%。在不同濃度膽鹽的培養(yǎng)基中,L.harbinensisP1-1均能良好生長,在0.3 g/L的膽鹽中存活率為72.4%,在1.2 g/L的膽鹽中存活率仍達(dá)到56.2%,表明L.harbinensisP1-1具有優(yōu)良的消化道環(huán)境耐受性和適應(yīng)性,與文獻(xiàn)報道的L.harbinensisXC-3耐受結(jié)果相近[18]。

圖3 人工胃腸液的耐受性Fig.3 Tolerance of artificial gastrointestinal fluid

表2 膽鹽耐受性Table 2 Bile salt tolerance

進(jìn)一步評價所獲菌株L.harbinensisP1-1的抑菌活性。分別以革蘭氏陽性菌E.coliATCC 25922和革蘭氏陰性菌S.epidermidisATCC 12228為指示菌,評價結(jié)果如圖4所示。以E.coliATCC 25922為指示菌時,L.harbinensisP1-1抑菌活性隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增強(qiáng),24 h時抑菌圈直徑達(dá)到約23 mm,遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)報道中的L.harbinensisB22[19]和L.harbinensisM1[16],與文獻(xiàn)報道的其他乳桿菌的抑菌能力相當(dāng),如L.salivarius1[20]、L.rhamnosusyoba 2012[21]和E.mundtiiCECT972T[22]。以S.epidermidisATCC 12228為指示菌時,L.harbinensisP1-1抑菌活性隨時間變化趨勢與E.coliATCC 25922相似,但抑菌活性略低,24 h 抑菌圈直徑為21 mm。目前,對于L.harbinensis產(chǎn)細(xì)菌素能力及抑菌活性的研究并不多,且已報道的L.harbinensis的抑菌能力均不顯著,如從母羊奶酪中分離的一株L.harbinensis對E.coli、Klebsiellapneumoniae、Pseudomonasaeruginosa等不同指示菌的抑菌圈直徑僅約4 mm[23];從四川泡菜樣品中分離得到的L.harbinensisB22對E.coli、Listeriainnocua、Listeriainnocua等不同指示菌的抑菌圈直徑約13 mm[19]。比較分析可知,L.harbinensisP1-1具有顯著且穩(wěn)定的抑菌能力。

a-目標(biāo)菌株在不同時間段對S.epidermidis ATCC 12228和 E.coli ATCC 25922的抑菌直徑;b-以E.coli ATCC 25922 為指示菌平板圖;c-以S.epidermidis ATCC 12228為指示菌平板圖圖4 L.harbinensis P1-1的抑菌活性評價Fig.4 Evaluation of antibacterial activity of L.harbinensis P1-1

2.3 L.harbinensis P1-1對共培養(yǎng)微生物的影響

益生菌在維護(hù)腸道健康時,往往表現(xiàn)為同時促進(jìn)其他益生菌的增殖并抑制病原菌的生長[24-25]。為進(jìn)一步了解L.harbinensisP1-1的益生特性,將L.harbinensisP1-1分別與2株益生菌及2株條件致病菌共培養(yǎng),考查體系pH、菌體密度以及各微生物的生長變化情況。其中,L.plantarumCGMCC No.18389是實驗前期從酸菜中篩選得到的一株益生菌[26],E.coliNissle 1917是公認(rèn)的益生菌,E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228是標(biāo)準(zhǔn)菌株。

共培養(yǎng)對總酸產(chǎn)量的影響如圖5-a所示,L.harbinensisP1-1與益生菌L.plantarumCGMCC No.18389協(xié)同產(chǎn)酸,使得共培養(yǎng)體系在不同時間點的pH均低于L.harbinensisP1-1純培養(yǎng)體系,且pH下降速率更快;而E.coliNissle 1917、E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228均削弱了L.harbinensisP1-1的產(chǎn)酸能力,表現(xiàn)為共培養(yǎng)體系在發(fā)酵過程中的pH均高于L.harbinensisP1-1純培養(yǎng)。

a-pH值;b-OD600值;c-與L.plantarum CGMCC No.18389共培養(yǎng)體系;d-與E.coli Nissle 1917共培養(yǎng)體系; e-與E.coli ATCC 25922共培養(yǎng)體系;f-與S.epidermidis ATCC 12228共培養(yǎng)體系圖5 L.harbinensis P1-1共培養(yǎng)體系pH值、OD600值和生物量的變化Fig.5 Changes of pH, OD600, and biomass in L.harbinensis P1-1 co-culture system

共培養(yǎng)對菌體密度的影響如圖5-b所示,各體系菌體生長速率大致相同,均在4 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期,15 h到達(dá)穩(wěn)定期,OD600值達(dá)到1.6左右。0～8 h,共培養(yǎng)體系的OD600值均高于L.harbinensisP1-1純培養(yǎng),其中以L.harbinensisP1-1與L.plantarumCGMCC No.18389共培養(yǎng)體系菌體生長速率最快,OD600值在8 h 時就達(dá)到了1.6;8 h后,L.harbinensisP1-1與L.plantarumCGMCC No.18389共培養(yǎng)體系持續(xù)穩(wěn)定增殖,其他體系種間競爭抑制趨于明顯,菌體密度增長緩慢,且體系間無顯著差異。

進(jìn)一步分析共培養(yǎng)體系中各微生物的生物量變化。整體比較L.harbinensisP1-1與這4株菌共培養(yǎng)過程中菌體生長的變化趨勢發(fā)現(xiàn)(圖5-c～圖5-f),發(fā)酵初期,共培養(yǎng)體系中微生物生物量變化較為復(fù)雜,但在發(fā)酵中后期,尤其是共培養(yǎng)16 h后,菌體生長趨勢相對明朗,L.harbinensisP1-1的益生特性更為明顯,且自身生長增殖情況比純培養(yǎng)時更穩(wěn)定。具體分析來看,L.harbinensisP1-1完全不抑制L.plantarumCGMCC No.18389的生長,L.plantarumCGMCC No.18389在24 h的生物量約為7.2 copies/mL,與L.plantarumCGMCC No.18389純培養(yǎng)體系生物量相當(dāng);對E.coliNissle 1917的生物量無顯著影響,其生物量與純培養(yǎng)相當(dāng),在12 h后才略呈下降趨勢,E.coliNissle 1917的存活率高于95%;顯著抑制了致病菌E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228的生長,共培養(yǎng)8 h后兩株菌的存活率均低于90%,E.coliATCC 25922的生物量顯著低于純培養(yǎng),存活率下降了15.9%。共培養(yǎng)對抑菌活性的影響如表3所示,與L.harbinensisP1-1純培養(yǎng)時比較,當(dāng)L.harbinensisP1-1與2株益生菌共培養(yǎng)時,抑菌圈直徑均大于26 mm,抑菌活性增強(qiáng)了約20%;與2株條件致病菌共培養(yǎng)在一定程度上促進(jìn)了L.harbinensisP1-1的抑菌活性,推測原因可能是共培養(yǎng)條件進(jìn)一步誘導(dǎo)了L.harbinensisP1-1細(xì)菌素的產(chǎn)生,已報道文獻(xiàn)中,WU等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)L.plantarumRUB1與ListeriamonocytogenesATCC 19111和StaphylococcusaureusATCC 6538共培養(yǎng)時可增強(qiáng)抑菌活性和細(xì)菌素相關(guān)基因的表達(dá)。

表3 L.harbinensis P1-1對共培養(yǎng)菌株的抑制情況及 不同體系的抑菌活性Table 3 Inhibition of L.harbinensis P1-1 on co-cultured strains and antibacterial activity of different systems

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵食品中分離篩選得到20株乳酸菌,通過排除有機(jī)酸、過氧化氫等的干擾以及蛋白酶敏感試驗,獲得了一株抑菌能力較強(qiáng)的產(chǎn)細(xì)菌素哈爾濱乳桿菌L.harbinensisP1-1。益生活性評價表明,L.harbinensisP1-1具有良好的胃腸液及膽鹽耐受性能,在人工胃液中的存活率高達(dá)91.1%,在人工腸液中的存活率超過70%,在1.2 g/L的膽鹽中存活率高達(dá)56.2%。分別以E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228為指示菌,L.harbinensisP1-1抑菌活性均隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增強(qiáng),培養(yǎng)24 h后對E.coliATCC 25922的抑菌圈直徑達(dá)到23 mm,對S.epidermidisATCC 12228的抑菌活性略低。共培養(yǎng)結(jié)果表明,L.harbinensisP1-1與益生菌L.plantarumCGMCC No.18389互利共生,二者生長及增殖更為穩(wěn)定,共培養(yǎng)發(fā)酵液pH下降加快,且抑菌效果增強(qiáng),抑菌圈直徑提高了約20%;與E.coliNissle 1917共培養(yǎng)時,其生物量約為7 copies/mL,與純培養(yǎng)相比相差不大,共培養(yǎng)發(fā)酵液抑菌圈直徑增加到25 mm左右;L.harbinensisP1-1可顯著抑制E.coliATCC 25922和S.epidermidisATCC 12228的生長,2株條件致病菌的存活率均低于90%,L.harbinensisP1-1的抑菌活性同時增強(qiáng),推測條件致病菌促進(jìn)了L.harbinensisP1-1細(xì)菌素的產(chǎn)生。綜上所述,L.harbinensisP1-1是一株抑菌能力較強(qiáng)的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌,且具有良好的腸道益生能力,在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中具有較高的應(yīng)用價值。