高壓熱殺菌處理結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活動(dòng)力學(xué)研究

王旭娟,劉月,李佳佳,武思睿,王傳發(fā),辛偉山,章中

(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏回族自治區(qū) 銀川,750021)

芽孢是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體在特殊條件下形成的休眠態(tài),對(duì)食物有致腐敗作用[1]。因此如何高效地殺滅芽孢是食品殺菌領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

高壓熱殺菌處理(high-pressure thermal sterilization, HPTS)是一種新型殺菌技術(shù),由超高壓(400～900 MPa)和中溫(50～90 ℃)協(xié)同處理,能更好地滅活芽孢[2]。溶菌酶作為食品添加劑,對(duì)各類食品中的微生物有抑制和滅活作用[3]。研究表明,超高壓與溶菌酶具有協(xié)同殺菌作用[4]。且比熱殺菌技術(shù)更好地保留了食品的營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)[5-6]。ARAS等[7]發(fā)現(xiàn)溶菌酶協(xié)同650 MPa、50 ℃處理對(duì)解淀粉和嗜熱芽孢殺滅作用是顯著的。

通過(guò)構(gòu)建殺菌動(dòng)力學(xué)模型,可以對(duì)殺菌效果進(jìn)行預(yù)測(cè),目前常用的殺菌動(dòng)力學(xué)模型主要有一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Weibull模型[8]。RAMASWAMY等[9]在研究HPTS殺滅梭狀桿菌芽孢時(shí)發(fā)現(xiàn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能很好地?cái)M合其滅活動(dòng)力學(xué)曲線,郭全友等[10]在研究枯草桿菌芽孢在熱、Nisin和ε-聚賴氨酸處理下的滅活動(dòng)力學(xué)時(shí),發(fā)現(xiàn)Weibull模型能很好擬合其失活過(guò)程,而線性模型難以描述其失活動(dòng)力學(xué)。目前關(guān)于HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的動(dòng)力學(xué)尚無(wú)研究報(bào)道。

芽孢內(nèi)膜具有高度不通透性,是保護(hù)芽孢的一層關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[11],內(nèi)膜的損傷和變化是引起芽孢死亡的主要原因[12-13]。當(dāng)內(nèi)膜受損時(shí),細(xì)胞的內(nèi)容物會(huì)泄漏到膜外,如一些大分子核酸和蛋白。通常用OD600值來(lái)表征芽孢內(nèi)容物釋放量[14],用OD260值和OD280值分別表征核酸與蛋白物泄漏情況[15]。探討芽孢滅活量與芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值之間的相關(guān)性可用于快速估計(jì)殺菌效果[16],但目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

本文研究了HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活動(dòng)力學(xué)并探討了芽孢滅活量與芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值之間的相關(guān)性,可為HPTS結(jié)合溶菌酶在食品殺菌技術(shù)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;營(yíng)養(yǎng)瓊脂,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;硫酸錳,江蘇源之源生物科技有限公司;溶菌酶,北京索萊寶科技有限公司;TSA-YE培養(yǎng)基,上海研生生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型高壓滅菌鍋,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;TGL-10B型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;754PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),西安華辰樂(lè)天實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;DZ-500/2G型落地式真空包裝機(jī),西安星火包裝機(jī)械有限公司;LRH-250型生化培養(yǎng)箱,青島明博環(huán)?？萍加邢薰?UV-9000S型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;超高壓設(shè)備,包頭科發(fā)高壓科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備

參考劉月[17]的方法并稍加改進(jìn)來(lái)制備枯草桿菌的菌懸液。將活化3代的枯草桿菌芽孢劃線接種至斜面培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)7 d,用無(wú)菌水洗滌芽孢并收集于離心管中,在4 ℃、9 000 r/min、15 min的條件下洗滌芽孢3次,將其濃度調(diào)整為約1.5×109CFU/mL,4 ℃保存。使用前調(diào)節(jié)芽孢懸浮液濃度為1.5×108CFU/mL。

1.3.2 HPTS結(jié)合溶菌酶處理

將一定量的枯草桿菌芽孢懸浮液加入到離心管中,離心15 min(4 ℃、9 000 r/min),棄去上清液,加入配制好的同等體積溶菌酶溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.10%、0.30%),充分振蕩接觸。用無(wú)菌聚乙烯真空袋將處理后的芽孢懸浮液真空包裝,放入超高壓加壓釜中。設(shè)定壓力為600 MPa,處理溫度為65、75 ℃,保壓時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min?？紤]到升壓時(shí)每100 MPa水的升溫約3 ℃,在進(jìn)行600 MPa-65 ℃、600 MPa-75 ℃處理前,對(duì)高壓處理腔內(nèi)水的溫度進(jìn)行預(yù)調(diào)控,600 MPa-65 ℃處理前用水浴夾套將腔內(nèi)水預(yù)熱到50 ℃左右,600 MPa-75 ℃處理前用水浴夾套將腔內(nèi)水預(yù)熱到60 ℃左右;然后進(jìn)行升壓處理,升壓到600 MPa,此時(shí)實(shí)際處理溫度在64～66 ℃、74～76 ℃;在保壓過(guò)程中高壓處理腔外的恒溫水浴夾套仍進(jìn)行工作,以使得高壓處理腔內(nèi)的溫度維持在一個(gè)較穩(wěn)定的水平。采用計(jì)算機(jī)控制壓力、時(shí)間和溫度。在加壓過(guò)程中,K型熱電偶測(cè)量高壓處理腔中水的溫度。卸壓后冷卻,隨即放入4 ℃冰箱保存。

1.3.3 平板計(jì)數(shù)

參照MENG等[18]的方法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。將處理前后的菌懸液梯度稀釋,并將1 mL的稀釋菌液和15～20 mL的TSA-YE注入培養(yǎng)皿中,37 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h,對(duì)存活的芽孢進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí),取3個(gè)相同稀釋度的平均值。

1.3.4 動(dòng)力學(xué)模型及模型擬合度比較

本實(shí)驗(yàn)所用HPTS設(shè)備升壓到600 MPa約需3 min,為排除升壓過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。我們首先做了升壓到600 MPa后立即泄壓的實(shí)驗(yàn),測(cè)定升壓過(guò)程對(duì)樣品的菌落總數(shù)、OD600、OD260和OD280值的影響,后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均先減除了升壓過(guò)程的影響,然后進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模型擬合和相關(guān)性分析。

1.3.4.1 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型

該模型表示芽孢的滅活量和處理時(shí)間的變化是一種線性關(guān)系[19],其表達(dá)式如公式(1)所示:

(1)

式中:N0,初始芽孢的數(shù)量,CFU/mL;Nt,處理t時(shí)間后芽孢的存活數(shù)量,CFU/mL;D,滅活90%的芽孢所需的時(shí)間,min;t,處理時(shí)間,min。

1.3.4.2 Weibull一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型

Weibull模型是一種用于描述各種線性和凹凸型曲線的非線性模型[20]。其表達(dá)式如公式(2)所示:

(2)

式中:N0,初始芽孢菌落數(shù)量;Nt,時(shí)間t時(shí)芽孢的菌落數(shù)量;b,比例因子;n,形狀系數(shù);t,時(shí)間。

1.3.4.3 動(dòng)力學(xué)模型擬合度比較

用決定系數(shù)R2、準(zhǔn)確因子Af、偏差因子Bf、均方根誤差(root mean square error, RMSE)等相關(guān)評(píng)估指標(biāo)對(duì)模型擬合度進(jìn)行評(píng)估。R2為實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行線性擬合得到的回歸系數(shù)。其中,精確因子Af為實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的一致性,偏差因子Bf代表實(shí)測(cè)值與預(yù)期值偏差的程度,RMSE描述模型的可靠程度。研究表明,決定系數(shù)R2越大,RMSE越小,Af越小且Bf越接近1,模型的擬合度愈好[21-22];公式(3)～公式(5)為Af、Bf、RMSE的計(jì)算方法:

(3)

(4)

(5)

式中:n為試驗(yàn)次數(shù)。

1.3.5 OD600值的測(cè)定

將芽孢懸浮液振蕩均勻,在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定處理前后枯草桿菌芽孢懸浮液的吸光度[23]。

1.3.6 紫外吸收物質(zhì)泄漏量的測(cè)定

將處理前后的芽孢懸浮液于4 ℃、9 000 r/min離心15 min,上清液為工作液,以無(wú)菌水為空白對(duì)照測(cè)定260 nm波長(zhǎng)(核酸)和280 nm波長(zhǎng)(蛋白質(zhì))處的吸光度[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析,P<0.05為顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)。采用Origin 2019.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢效果分析

圖1為不同條件下的HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢滅活效果的關(guān)系曲線。由圖1可知,在600 MPa-65 ℃下,處理時(shí)間為5、10、15、20、25 min時(shí),枯草桿菌芽孢的滅活量分別為1.06、2.17、2.90、3.28、3.43 lg CFU/mL,保持溫壓不變,600 MPa-65 ℃-25 min相較于600 MPa-65 ℃-5 min芽孢滅活量高2.37 lg CFU/mL。當(dāng)保壓時(shí)間為25 min時(shí),在600 MPa-75 ℃下,芽孢的滅活量為5.14 lg CFU/mL,比600 MPa-65 ℃高1.71 lg CFU/mL,表明在一定的壓力和保壓時(shí)間下,溫度升高能促進(jìn)芽孢失活。在600 MPa-65 ℃-0.05%溶菌酶處理5～25 min后,枯草桿菌芽孢的滅活量分別為1.28、2.38、2.91、3.68、3.96 lg CFU/mL,在相同溫壓和處理時(shí)間下,經(jīng)過(guò)0.30%溶菌酶處理后,其滅活量分別增加至1.67、3.06、4.11、4.44、4.83 lg CFU/mL,表明提高溶菌酶的濃度,進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活作用。在600 MPa-75 ℃-0.30%溶菌酶處理5～25 min后,枯草桿菌芽孢的滅活量分別增加至2.44、4.41、5.68、6.09、6.36 lg CFU/mL,相較于600 MPa-65 ℃-0.30%溶菌酶處理芽孢的滅活量分別提高了0.77、1.35、1.57、1.65、1.53 lg CFU/mL?？傮w上,滅活曲線呈現(xiàn)由快到慢的降低速率,表明芽孢的滅活率隨保壓時(shí)間的增加而降低,芽孢滅活曲線出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,研究發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象可能是由于部分芽孢具有極強(qiáng)的抗性[25-26]。

a-未添加溶菌酶;b-0.05%溶菌酶;c-0.10%溶菌酶;d-0.30%溶菌酶圖1 不同條件下HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果Fig.1 Inactivation effect of HPTS combining with lysozyme on Bacillus subtilis spores under different conditions

2.2 動(dòng)力學(xué)模型擬合度分析

一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型與Weibull模型的模型參數(shù)和模型評(píng)價(jià)參數(shù)如表1、表2所示。用決定系數(shù)R2、準(zhǔn)確因子Af、偏差因子Bf、RMSE等相關(guān)評(píng)估指標(biāo)對(duì)模型擬合度進(jìn)行評(píng)價(jià)[27]。

表1 不同處理?xiàng)l件下一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Weibull模型的模型參數(shù)Table 1 Model parameters of the-first order kinetic and Weibull models under various treatment conditions

表2 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Weibull模型評(píng)價(jià)參數(shù)Table 2 The-first order kinetic model and Weibull model evaluation parameters

在本研究中,一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的平均決定系數(shù)R2=0.875,Af為1.16～1.28,Bf為0.48～0.91,RMSE為0.46～1.17;Weibull模型的平均決定系數(shù)R2=0.972,Af為1.05～1.11,Bf為1.02～1.04,RMSE為0.14～0.48。與一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型相比,Weibull模型的RMSE更小,Af更小,Bf和R2更接近1,Weibull模型對(duì)于HPTS結(jié)合溶菌酶處理下枯草桿菌芽孢的滅活情況的擬合更可靠。WANG等[28]研究表明Weibull模型對(duì)70、80 ℃的溫度協(xié)同400～600 MPa處理下凝結(jié)芽孢桿菌芽孢滅活曲線的擬合效果更佳。COLLADO等[29]在研究高溫對(duì)蠟樣芽孢桿菌滅活動(dòng)力學(xué)時(shí)也發(fā)現(xiàn)Weibull模型可較好描述滅活動(dòng)力學(xué)過(guò)程。VAN BOEKEL[30]對(duì)55組微生物的熱失活動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有2條符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,而大部分的存活曲線呈非線性的凹形,Weibull模型可用于擬合非線性滅活曲線。

2.3 模型的驗(yàn)證

實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的一致性可用來(lái)衡量模型的可靠性,常用線性擬合得到的決定系數(shù)R2來(lái)表征。擬合方程的截距越靠近0,且斜率越接近1,實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的一致性越高。如圖2所示,Weibull模型的決定系數(shù)R2為0.964,截距為-0.215,斜率為0.945;一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的決定系數(shù)R2為0.848,截距為0.742,斜率為1.10。Weibull模型對(duì)HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢效果的動(dòng)力學(xué)擬合效果更好。

a-一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型;b-Weibull模型圖2 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型與Weibull模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between predicted and measured values of the-first order kinetic model and Weibull model

2.4 HPTS結(jié)合溶菌酶處理對(duì)芽孢懸浮液OD600值的影響

通過(guò)測(cè)定樣品在600 nm處的吸光度來(lái)確定芽孢的內(nèi)容物釋放量。芽孢懸浮液的OD600值與其折光性相關(guān),芽孢量釋放量越大,其折射性越低,吸光度值越小[31-32]。圖3為HPTS結(jié)合溶菌酶處理后枯草桿菌芽孢樣品OD600值的變化情況。

a-600 MPa-65 ℃;b-600 MPa-75 ℃圖3 不同處理時(shí)間下HPTS結(jié)合溶菌酶處理后 OD600值的變化曲線Fig.3 Change cures of OD600 treated by HPTS combining with lysozyme under different time conditions

如圖3所示,15 min前的OD600值曲線比較陡,表明吸光度值快速下降,15 min后的吸光度值下降緩慢。在HPTS結(jié)合溶菌酶處理下,隨著保壓時(shí)間從5 min到25 min,OD600值均下降,表明延長(zhǎng)保壓時(shí)間可以促進(jìn)芽孢內(nèi)容物釋放。當(dāng)處理時(shí)間為25 min,600 MPa-65 ℃下OD600值為0.65,600 MPa-75 ℃下的OD600值為0.50,升高溫度其OD600值變小,表明升高溫度可以促進(jìn)內(nèi)容物釋放。在600 MPa-75 ℃-25 min下,當(dāng)溶菌酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.30%時(shí),OD600值分別為0.44、0.40、0.38,表明隨著溶菌酶濃度的增大,內(nèi)容的物釋放量也隨之升高。

2.5 HPTS結(jié)合溶菌酶處理對(duì)紫外吸收物質(zhì)泄漏的影響

細(xì)菌在經(jīng)過(guò)滅菌后,往往細(xì)胞中的物質(zhì)會(huì)泄漏,所以常以紫外線吸收物質(zhì)的泄漏來(lái)反映細(xì)胞的損害程度。通過(guò)測(cè)定樣品在260 nm/280 nm處的紫外吸收強(qiáng)度來(lái)確定芽孢的核酸、蛋白質(zhì)泄漏量。圖4為HPTS結(jié)合溶菌酶處理后枯草桿菌芽孢樣品OD260值和OD280值的變化情況。

a-600 MPa-65 ℃ OD260值;b、d-600 MPa-75 ℃ OD260值;c-600 MPa-65 ℃ OD280值;d-600 MPa-75 ℃ OD280值圖4 不同處理時(shí)間下HPTS結(jié)合溶菌酶處理后OD260、OD280值的變化曲線Fig.4 Change cures of OD260, OD280 treated by HPTS combining with lysozyme under different time conditions

如圖4所示,在HPTS與溶菌酶協(xié)同作用下,枯草桿菌芽孢的OD260、OD280值均隨保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,表明芽孢的紫外線吸收物質(zhì)泄漏量有所增大。在600 MPa-75 ℃-25 min下,溶菌酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.05%升高至0.30%,OD260值分別為0.48、0.51、0.54,OD280值分別為0.44、0.46、0.47,表明在一定的保壓時(shí)間下,紫外吸收物質(zhì)的泄漏量隨溶菌酶濃度的提高而增大。

2.6 相關(guān)性分析

如表3所示,芽孢滅活量與芽孢懸浮液OD600值之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)為-0.972,與核酸及蛋白泄漏量之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.828、0.848,表明在芽孢滅活量增加的同時(shí),OD600值降低,芽孢內(nèi)容物釋放量增加,且紫外吸收物質(zhì)泄漏量隨其滅活量的增加而增大。但芽孢懸浮液OD600值與芽孢滅活量之間的相關(guān)性更顯著,可以更好地預(yù)測(cè)芽孢的滅活量。這是因?yàn)殡m然核酸和蛋白質(zhì)在260、280 nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰,但是其他物質(zhì)也可能在此處有吸收峰,從而產(chǎn)生干擾。另一方面溶菌酶本身也是蛋白質(zhì),在280 nm波長(zhǎng)處也存在吸收峰,也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。以上原因使芽孢滅活量與OD260、OD280值相關(guān)性降低。

表3 芽孢滅活量與各指標(biāo)的皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Pearson correlation analysis results of Bacillus subtilis spore inactivation and each index

3 結(jié)論

HPTS結(jié)合溶菌酶能更好地滅活枯草桿菌芽孢。Weibull模型對(duì)殺菌曲線的動(dòng)力學(xué)擬合效果優(yōu)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。Weibull模型的參數(shù)n值均小于1,失活曲線出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象,芽孢殺菌抗性存在異質(zhì)性,有小部分芽孢的殺菌抗性更強(qiáng)。隨著殺菌處理時(shí)間的延長(zhǎng),芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值也不斷變化,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明芽孢懸浮液OD600、OD260、OD280值與芽孢滅活量之間都呈極顯著相關(guān),但芽孢懸浮液OD600值與芽孢滅活量之間的相關(guān)性更顯著,芽孢懸浮液OD600值簡(jiǎn)單易測(cè),可快速準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)殺菌效果。本文可為HPTS結(jié)合溶菌酶在食品殺菌中的應(yīng)用提供參考。