高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚耐鹽乳酸菌的篩選及其發(fā)酵特性研究

李祥弟,徐婷,劉占,張麗杰,王棟*

1(釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)), 江蘇 無(wú)錫,214122) 3(廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司,廣東 中山,528400)

醬油是一種在東亞地區(qū)不可缺少的發(fā)酵調(diào)味品,因其濃郁的鮮味和獨(dú)特的香氣在世界范圍內(nèi)也廣受歡迎。醬油的制作過(guò)程大致可分為4個(gè)部分,即原料蒸煮、制曲、醬醪發(fā)酵以及滅菌罐裝[1]。成熟醬醪的理化性質(zhì)和風(fēng)味特征與醬油品質(zhì)密切相關(guān),因此,醬醪發(fā)酵是醬油生產(chǎn)的關(guān)鍵階段之一。在醬醪發(fā)酵過(guò)程中,耐鹽乳酸菌起到了至關(guān)重要的作用[2]。在醬醪發(fā)酵前期,耐鹽乳酸菌會(huì)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸,降低發(fā)酵體系pH以有利于產(chǎn)香酵母菌的增殖。同時(shí),耐鹽乳酸菌可以起到提升風(fēng)味[3]、抑制有害微生物生長(zhǎng)[4]、抑制有毒物質(zhì)形成[5-6]等作用。

嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)屬于四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus),表現(xiàn)為兼性厭氧發(fā)酵模式,可以在高鹽(20% NaCl)或高糖的環(huán)境中生長(zhǎng),是我國(guó)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程(自發(fā)發(fā)酵)中的主體耐鹽乳酸菌。有報(bào)道顯示,嗜鹽四聯(lián)球菌可以提高醬油中風(fēng)味物質(zhì)含量,是日本醬油、魚(yú)醬等純菌發(fā)酵過(guò)程中的初始發(fā)酵菌劑(starter)。不僅如此,嗜鹽四聯(lián)球菌與醬油主體產(chǎn)香菌魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomycesrouxi)具有種間相互作用,前者可以有效提高魯氏結(jié)合酵母的耐鹽性[7]。因此兩菌種共培養(yǎng)可以進(jìn)一步提高醬油中風(fēng)味物質(zhì)含量。然而,對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌的泛基因組研究表明,與菌種發(fā)酵性能對(duì)應(yīng),該種不同株的基因組呈現(xiàn)明顯的菌株水平特異性,即不同菌種在菌種安全性、產(chǎn)香性能、風(fēng)味增強(qiáng)等方面具有明顯差異。因此,篩選具有優(yōu)良特性的嗜鹽四聯(lián)球菌以用于我國(guó)高鹽稀態(tài)醬油醬醪發(fā)酵,對(duì)進(jìn)一步提高醬油品質(zhì)具有重要潛在價(jià)值[8-10]。

四乙基愈創(chuàng)木酚(4-ethylguaiacol, 4-EG)是醬油中一種關(guān)鍵的風(fēng)味物質(zhì),呈煙熏及辛香味,具有緩和咸味的作用。四乙基愈創(chuàng)木酚風(fēng)味閾值極低,樣品間0.5 mg/L的差異就能被人體感官識(shí)別,因此其含量與醬油品質(zhì)密切相關(guān)。已有研究表明,微生物合成四乙基愈創(chuàng)木酚主要以阿魏酸為前體,通過(guò)阿魏酸脫羧酶,轉(zhuǎn)化為四乙烯基愈創(chuàng)木酚,后經(jīng)四乙烯基愈創(chuàng)木酚還原酶轉(zhuǎn)化為四乙基愈創(chuàng)木酚。且已有研究表明強(qiáng)化四乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生菌可以提高醬油中四乙基愈創(chuàng)木酚的含量[11]。

本文嘗試從醬油醬醪中分離篩選出高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚的耐鹽乳酸菌,對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定,并測(cè)試該菌種耐酸耐鹽性能及菌種安全性能。以該菌種為初始發(fā)酵菌劑用于模擬醬油發(fā)酵,與不加發(fā)酵劑的醬油發(fā)酵樣本相比,四乙基愈創(chuàng)木酚含量提高3.34倍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

菌株篩選樣品,國(guó)內(nèi)某醬油廠醬醪;制曲用米曲霉滬釀3.042,江南大學(xué)釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室菌種庫(kù)。

1.1.2 試劑

面粉、麩皮、黃豆,市售;阿魏酸、四乙基愈創(chuàng)木酚、天冬氨酸、丙氨酸、組氨酸,百靈威科技公司;組胺、乳酸、乙酸、葡萄糖、甲酸,美國(guó)sigma公司;氯化鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、甲醛、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、無(wú)水乙醇、乙腈、甲醇、硫酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良MRS液體培養(yǎng)基,青島海博生物科技公司,按說(shuō)明使用,并添加8 g/100 mL NaCl,自然pH。

改良MRS固體培養(yǎng)基:同改良MRS液體培養(yǎng)基配制方法,再加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100 mL):MRS培養(yǎng)基53,NaCl 8,阿魏酸0.1,自然pH。

種曲培養(yǎng)基:按照m(麩皮)∶m(面粉)=7∶3的比例在250 mL三角瓶中加入20 g過(guò)10目篩的干料,并加入干料量70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水,拌勻。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備

電子分析天平、pH計(jì),Mettler Toledo公司;PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司;高壓濕熱自動(dòng)蒸汽滅菌鍋,Tomy公司;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;高速離心機(jī),Eppendorf公司;CytationTM3多功能酶標(biāo)儀,BioTek公司;BX51光學(xué)顯微鏡,Olympus公司;超高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司;氣相質(zhì)譜儀、高效液相色譜,安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜鹽四聯(lián)球菌的獲取

無(wú)菌條件下取適量醬醪,溶于無(wú)菌水中,振蕩均勻,使用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,取不同稀釋梯度涂布于改良MRS固體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧靜置培養(yǎng)7 d,觀察菌株形態(tài)。挑取單菌落于改良MRS液體培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)48 h,甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.2 菌株的鑒定

a)形態(tài)觀察:經(jīng)過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選的目標(biāo)菌株,將其菌懸液梯度稀釋后涂布于MRS平板培養(yǎng)基,對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞觀察及菌落形態(tài)觀察。

b)分子生物學(xué)鑒定:使用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)菌株基因組進(jìn)行提取,使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)其16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12],PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果使用NCBI上Blast工具進(jìn)行比對(duì),鑒定菌株。下載四聯(lián)球菌同屬其他模式菌株的16S rRNA序列,采用MEGA 7.0軟件中的鄰接(neighbor joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚菌株的篩選

將初篩所得嗜鹽四聯(lián)球菌活化為種子液,按3%比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃厭氧靜置培養(yǎng)10 d,結(jié)束后采用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾發(fā)酵上清液,超高效液相色譜(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)檢測(cè)發(fā)酵液中四乙基愈創(chuàng)木酚含量,篩選出高產(chǎn)菌株。

UPLC條件:色譜柱ACQUITY UPLC?HSS T3(1.8 μm×2.1 mm×150 mm);流動(dòng)相:A(0.1%甲酸水),B(甲醇);洗脫程序:0～8 min,100%～48% A;8～10 min,48% A;10～15 min,48%～30% A;15～18 min,30%～100% A;流速為0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL[13]。

制定標(biāo)準(zhǔn)曲線:取標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸、四乙基愈創(chuàng)木酚,溶于甲醇配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,依次梯度稀釋為2.5、12.5、25、50、100 mg/L。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立線性方程[14]。

1.2.4 菌株生理特征

a)菌株主體代謝產(chǎn)物檢測(cè):將菌株活化為種子液,按3%接種量接種于改良MRS培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧發(fā)酵10 d,每隔2 d取樣,結(jié)束后采用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾發(fā)酵上清液,HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物含量,方法參考文獻(xiàn)[15]。

b)氨基酸檢測(cè):使用含有0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))天冬氨酸的MRS培養(yǎng)基,按3%接種量接種,30 ℃培養(yǎng)7 d,取樣使用三氯乙酸處理后采用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾發(fā)酵上清液,采用HPLC在線衍生進(jìn)行檢測(cè)。

c)組胺檢測(cè):使用含有0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))組氨酸的MRS培養(yǎng)基,按3%接種量接種,30 ℃培養(yǎng)7 d,取樣使用三氯乙酸處理后采用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾發(fā)酵上清液,衍生后使用UPLC進(jìn)行檢測(cè)。

d)菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定:使用含6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的MRS培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH值到6.0,按3%接種量接入種子液進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為72 h,每隔8 h取樣,檢測(cè)OD600值。

e)菌株在不同pH及鹽度下生長(zhǎng)情況:將菌株活化為種子液,按3%接種量接種到含6%、10%、15%、20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl和pH 3.0、4.0、5.0、6.0的MRS培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧靜置培養(yǎng)72 h,檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600值。

1.2.5 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵工藝

a)種曲制備:將平板培養(yǎng)菌種的孢子用接種針接入種曲培養(yǎng)基,搖勻后30 ℃培養(yǎng)4 d,每日攪拌使曲料松散[16]。

b)大曲制備:大豆用自來(lái)水沖洗3次除雜,1.5倍溫水浸泡8 h,瀝干水分。121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫。將大豆、面粉和種曲進(jìn)行混合,置于恒溫恒濕條件下培養(yǎng),及時(shí)翻曲,制曲48 h,待曲料表面布滿黃色菌絲體,即可出曲。

c)發(fā)酵工藝:將大曲與20% NaCl的鹽水按質(zhì)量比1∶2的比例混合。將混合好的曲料加入含0.1%阿魏酸的500 mL瓶子中,將嗜鹽四聯(lián)球菌活化為種子液,離心收集菌體,使用生理鹽水懸浮,按107CFU/g 接種,30 ℃發(fā)酵40 d,每隔10 d取樣。

1.2.6 理化指標(biāo)檢測(cè)

pH使用pH計(jì)檢測(cè)?？偹岷桶被釕B(tài)氮檢測(cè)參照GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》方法。游離氨基酸測(cè)定具體操作參考已有研究[17],使用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測(cè)。揮發(fā)性化合物采用固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(phase microextraction-mass spectrometry coupled with gas chromatography-mass spectrometry, SPME-GC-MS)進(jìn)行測(cè)定,詳細(xì)處理辦法參照鄭鵬飛等[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚菌株的篩選

耐鹽乳酸菌可以在含5%～25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的厭氧或微耗氧環(huán)境生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃[19],通常呈現(xiàn)白色、表面光滑的圓形菌落形態(tài),為盡可能提高所選耐鹽乳酸菌的菌株多樣性,本研究以我國(guó)華東、華南、華中、華北四區(qū)域中的10家高鹽發(fā)酵調(diào)味品公司的高鹽發(fā)酵樣品(包括醬醪、魚(yú)醬醪等)為篩選源,在含有10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的MRS培養(yǎng)基,置于30 ℃的厭氧環(huán)境中進(jìn)行耐鹽乳酸菌的篩選。

對(duì)上述高鹽發(fā)酵樣品進(jìn)行梯度稀釋涂布平板,分別靜置培養(yǎng)3、5、7 d后,通過(guò)初步的形態(tài)觀察,總共隨機(jī)挑選出350株具有乳酸菌形態(tài)特征的菌落。生長(zhǎng)性能良好是工業(yè)菌種的前提,本研究首先根據(jù)培養(yǎng)液菌株生長(zhǎng)情況,從中挑選出90株長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株,并進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)。將純化菌種轉(zhuǎn)接至含0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))阿魏酸的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d,使用UPLC檢測(cè)各發(fā)酵液中的四乙基愈創(chuàng)木酚,如圖1所示,菌株LBM 20027展現(xiàn)出突出的四乙基愈創(chuàng)木酚合成能力,含量達(dá)到26.8 mg/L。與之相比,嗜鹽四聯(lián)球菌模式菌株DSM 20339的產(chǎn)量?jī)H為4.2 mg/L,由此可見(jiàn)耐鹽乳酸菌LBM 20027具有較優(yōu)的四乙基愈創(chuàng)木酚合成能力。因此使用菌株LBM 20027進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同乳酸菌株發(fā)酵液中四乙基愈創(chuàng)木酚含量Fig.1 4-Ethylguaiacol concentration in fermentation broth of different lactic acid bacteria strains

2.2 菌株LBM 20027的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

如圖2-a所示,菌株LBM 20027菌落形態(tài)呈現(xiàn)為乳白色,觀察其邊緣比較規(guī)則表面平滑,顯示為圓形菌落。在光學(xué)顯微鏡視野下,菌株LBM 20027多呈四聯(lián)球型,也有細(xì)胞成簇聚集,排列方式多種多樣(圖2-b)。在高精度的掃描電子顯微鏡視野下,高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚的菌株LBM 20027呈典型的成對(duì)或四聯(lián)球形態(tài)(圖2-c)。

a-菌落形態(tài);b-顯微鏡下形態(tài);c-電鏡下形態(tài);d-基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖2 菌株LBM 20027形態(tài)特征及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Morphological characteristics and phylogenetic tree of strain LBM 20027

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

使用PCR擴(kuò)增16S rDNA序列,對(duì)高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚菌株LBM 20027進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。測(cè)序后獲得基因序列,將其于Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST 比對(duì),比對(duì)結(jié)果表明該菌株與四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)的幾個(gè)菌種具有較高的同源性,可認(rèn)定其為四聯(lián)球菌屬。通過(guò)多序列同源性分析,使用MEGA X 7.0的NJ法構(gòu)建菌株間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2-d所示,結(jié)果表明菌株LBM 20027與嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)的親緣關(guān)系最近。根據(jù)分子生物學(xué)鑒定菌株LBM 20027屬于嗜鹽四聯(lián)球菌。而嗜鹽四聯(lián)球菌作為醬油發(fā)酵中的主體乳酸菌,LBM 20027有潛力更好的在醬油發(fā)酵環(huán)境下生長(zhǎng),同時(shí)其高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚的能力可能有助于醬油風(fēng)味的提升。

2.3 菌株的發(fā)酵性能

菌株的發(fā)酵性能,包括生長(zhǎng)速率、耐酸耐鹽性能等,是評(píng)判該菌株能否在食品發(fā)酵過(guò)程中成功定植并發(fā)揮風(fēng)味增強(qiáng)作用的關(guān)鍵因素之一。另外,對(duì)于食品發(fā)酵行業(yè)來(lái)說(shuō),菌種安全性是其能否用于食品發(fā)酵的重要前提。嗜鹽四聯(lián)球菌已在日本醬油生產(chǎn)中有半個(gè)世紀(jì)的應(yīng)用歷史,暗示該菌種可能具有食品安全的特性。然而,嗜鹽四聯(lián)球菌并非在我國(guó)《可用于食品的菌種名單》中,因此,本研究對(duì)篩選得到的嗜鹽四聯(lián)球菌LBM 20027進(jìn)行了必要的菌種安全及發(fā)酵性能測(cè)試。

2.3.1 菌株生長(zhǎng)曲線

由圖3-a可知,菌株LBM 20027在培養(yǎng)初期(0～40 h)生長(zhǎng)較慢,為生長(zhǎng)遲緩期;而在40～48 h生長(zhǎng)速率明顯增加,此時(shí)為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期;48 h后生長(zhǎng)速率逐漸變慢,到56 h進(jìn)入穩(wěn)定期,此后OD600值再無(wú)明顯變化。

a-生長(zhǎng)曲線;b-基礎(chǔ)代謝;c-丙氨酸;d-組胺;e-耐酸性;d-耐鹽性圖3 菌株LBM 20027的生長(zhǎng)特性Fig.3 Growth characteristics of strain LBM 20027

2.3.2 菌株主體代謝產(chǎn)物

通過(guò)HPLC檢測(cè)菌株LBM 20027發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗以及主體代謝產(chǎn)物生成情況,結(jié)果如圖3-b所示?？梢钥闯?菌株LBM 20027主要代謝葡萄糖,產(chǎn)生乳酸和乙酸,表現(xiàn)為兼性乳酸發(fā)酵形式。在發(fā)酵前4 d,葡萄糖被大量消耗,同時(shí)迅速生成乳酸和乙酸,第4天后,葡萄糖消耗速率變慢,乳酸和乙酸的生成也變慢,趨于平穩(wěn),發(fā)酵第10天,生成3.35 g/L乳酸和1.14 g/L乙酸。

2.3.3 菌株氨基酸轉(zhuǎn)化

嗜鹽四聯(lián)球菌可能具有將天冬氨酸轉(zhuǎn)化為甜味氨基酸——丙氨酸的能力,而丙氨酸呈現(xiàn)甜味,能豐富醬油的口感。因此,是否能將天冬氨酸有效轉(zhuǎn)化為丙氨酸是嗜鹽四聯(lián)球菌性能的重要指標(biāo)之一。本研究對(duì)高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚的菌種LBM 20027和模式菌株DSM 20339的天冬氨酸轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3-c所示,在含有0.3%天冬氨酸的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后,LBM 20027生成了28 mg/L的丙氨酸,而模式菌株DSM 20339僅生成了10 mg/L的丙氨酸。因此,LBM 20027不僅在風(fēng)味化合物4-乙基愈創(chuàng)木酚合成方面具有優(yōu)良特性,其轉(zhuǎn)化天冬氨酸為丙氨酸的能力很強(qiáng),是有潛力的工程菌種。

2.3.4 關(guān)于生物胺產(chǎn)生的安全性分析

已有報(bào)道顯示,嗜鹽四聯(lián)球菌在合成組胺時(shí)具有菌株水平特異性,即有些嗜鹽四聯(lián)球菌會(huì)利用組氨酸合成對(duì)人體健康有害的組胺,而有些菌株不具有上述催化反應(yīng)。本研究通過(guò)液相檢測(cè)組胺濃度,從而對(duì)菌株LBM 20027的組胺合成能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3-d所示,以具有組胺合成能力的嗜鹽四聯(lián)球菌LBM 20159作為對(duì)照,經(jīng)過(guò)7 d發(fā)酵,組胺產(chǎn)生菌LBM 20159生成組胺602.5 mg/L,而LBM 20027無(wú)法合成組胺。因此,LBM 20027在組胺形成方面具有生物安全性。

2.3.5 菌株耐受性檢測(cè)

本研究對(duì)菌株LBM 20027耐受酸性及NaCl能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3-e、圖3-f所示,LBM 20027在pH 6.0～7.0時(shí)具有良好的生長(zhǎng)性能,可判定該菌株的最適pH值為6.0～7.0,在pH 5.0以下生長(zhǎng)性能較弱。相較于模式菌株DSM 20339,菌株LBM 20027在酸性環(huán)境下顯示出更好的耐受性。菌株的耐鹽能力如圖3-f所示,可以看出菌株的生長(zhǎng)能力隨著NaCl濃度的升高而降低,在6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl條件下,展現(xiàn)出最佳生長(zhǎng)性能,與模式菌株DSM 20339相比,生長(zhǎng)能力略高。

2.4 模擬發(fā)酵

2.4.1 基本理化特征

如上所示,菌株LBM 20027在四乙基愈創(chuàng)木酚合成及天冬氨酸轉(zhuǎn)化方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。本研究將該菌株作為模擬醬油起始發(fā)酵菌劑,來(lái)探究?jī)?yōu)質(zhì)菌劑添加對(duì)醬油品質(zhì)的影響。本研究通過(guò)模擬醬油發(fā)酵實(shí)驗(yàn),在發(fā)酵第0天添加106CFU/mL的菌株LBM 20027,在發(fā)酵0、10、20、30、40 d取樣,對(duì)模擬高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程中的基本理化指標(biāo)pH、總酸、氨基酸態(tài)氮以及四乙基愈創(chuàng)木酚進(jìn)行檢測(cè),來(lái)檢驗(yàn)LBM 20027的發(fā)酵性能。

如圖4所示,嗜鹽四聯(lián)球菌作為起始發(fā)酵菌劑被加入醬油發(fā)酵體系中后,pH略有下降(圖4-a),在發(fā)酵前10 d,醬醪pH迅速降低,10 d后pH降低速度變緩,到20 d趨于穩(wěn)定,此時(shí)pH值為4.4;總酸變化如圖4-b所示,在發(fā)酵前10 d,快速提升,后續(xù)趨于穩(wěn)定,達(dá)到11 g/100 mL,相較于空白提升了22.2%。氨基酸態(tài)氮變化如圖4-c所示,前10 d增長(zhǎng)迅速,而10 d以后趨于穩(wěn)定,發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到0.5 g/100 mL,比空白組略高。

a-pH變化;b-總酸變化;c-氨基酸態(tài)氮變化;d-四乙基愈創(chuàng)木酚變化圖4 模擬發(fā)酵過(guò)程理化特征及風(fēng)味化合物變化Fig.4 Physicochemical characteristics and changes of flavor compounds during simulated fermentation

2.4.2 模擬發(fā)酵過(guò)程中四乙基愈創(chuàng)木酚變化

在模擬醬油發(fā)酵過(guò)程中,對(duì)四乙基愈創(chuàng)木酚的含量進(jìn)行追蹤,結(jié)果如圖4-d所示。四乙基愈創(chuàng)木酚在醬油模擬發(fā)酵過(guò)程前20 d呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì),20 d后增長(zhǎng)趨于平穩(wěn),暗示嗜鹽四聯(lián)球菌LBM 20027由于具有良好的耐鹽耐酸性能,在發(fā)酵前20 d成功定植并發(fā)揮風(fēng)味物質(zhì)合成能力。如圖4-d所示,在發(fā)酵40 d時(shí),與添加模式菌株DSM 20339和不接發(fā)酵劑的空白組比較,接種嗜鹽四聯(lián)球菌LBM 20027的模擬醬油發(fā)酵樣品中四乙基愈創(chuàng)木酚含量分別是它們的1.44和3.34倍。

目前國(guó)際上已報(bào)道的具有高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚能力的微生物主要以芽孢桿菌和酵母菌為主。郭明威等[14]報(bào)道了一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),其四乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量達(dá)到29 mg/L;王少磊等[20]報(bào)道了一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),其四乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量達(dá)到33 mg/L;鄒謀勇等[21]報(bào)道了一株擬威克酵母(Wickerhamiellaversatilis),其四乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量達(dá)到630 mg/L。如上四乙基愈創(chuàng)木酚高產(chǎn)菌種有潛力高效提升醬油中四乙基愈創(chuàng)木酚含量。然而,醬油的濃郁風(fēng)味來(lái)源于包括四乙基愈創(chuàng)木酚在內(nèi)的多種風(fēng)味成分而非單一成分。本研究篩選的高產(chǎn)四乙基愈創(chuàng)木酚的菌種為嗜鹽四聯(lián)球菌,該菌種為醬油釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物,貫穿整個(gè)醬油發(fā)酵周期,且能發(fā)酵生成多種風(fēng)味成分或風(fēng)味物質(zhì)前體,已作為一種優(yōu)良的起始發(fā)酵劑用于在日韓高鹽發(fā)酵食品生產(chǎn)中。如圖1及圖4-d所示,相比于嗜鹽四聯(lián)球菌的模式菌株DSM 20339,嗜鹽四聯(lián)球菌LBM 20027在單菌發(fā)酵及模擬醬油發(fā)酵中均展現(xiàn)了高效的四乙基愈創(chuàng)木酚合成能力。

2.4.3 揮發(fā)性物質(zhì)

為了驗(yàn)證接種嗜鹽四聯(lián)球菌LBM 20027對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程整體揮發(fā)性物質(zhì)的影響,本研究對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行了GC-MS檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示,在接種樣品組中,發(fā)現(xiàn)酯類和酸類化合物含量明顯高于空白組,而高濃度的酸類物質(zhì)有助于濃郁的酯香形成,如乙酸乙酯、己酸乙酯、醋酸、丁酸、異戊酸等,這些酯類化合物賦予醬油強(qiáng)烈的果香和酒香,同時(shí)愈創(chuàng)木酚、四乙基愈創(chuàng)木酚、四乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量接種LBM 20027的組別高于接種DSM 20339的樣品組,賦予醬油其獨(dú)特的醬香特征。但空白組中部分醇類化合物高于接種組,如乙醇、異丁醇、正己醇、3-甲硫基丙醇等。接種嗜鹽四聯(lián)球菌可以有效提高包括四乙基愈創(chuàng)木酚在內(nèi)的各種風(fēng)味物質(zhì)含量,且接種LBM 20027的效果更為明顯。

圖5 模擬發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性化合物熱圖Fig.5 Heat map of volatile compounds in simulated fermentation process

3 結(jié)論

本研究對(duì)高鹽發(fā)酵食品的醬醪進(jìn)行分離篩選,在高鹽環(huán)境下篩選出一株具有高四乙基愈創(chuàng)木酚轉(zhuǎn)化能力的耐鹽乳酸菌LBM 20027,通過(guò)對(duì)其形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)該菌LBM 20027為嗜鹽四聯(lián)球菌。將該菌株LBM 20027與嗜鹽四聯(lián)球菌模式菌株DSM 20339相比,LBM 20027的耐酸和耐鹽能力更加出色,不產(chǎn)生組胺,具有更好的四乙基愈創(chuàng)木酚轉(zhuǎn)化能力和天冬氨酸轉(zhuǎn)化能力。將菌株應(yīng)用于高鹽稀態(tài)醬油模擬發(fā)酵,結(jié)果顯示,在模擬體系中菌株LBM 20027也具有更好的四乙基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生能力,上述結(jié)果顯示出該菌株改善醬油風(fēng)味的巨大潛力。