肝纖維化進程中巨噬細胞異質(zhì)性對肝星狀細胞命運的影響

曹越 鄒燕婷 寧柳心 徐蓓莉 張順財 蔡瑜

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是由各種慢性損傷導(dǎo)致的可逆性病理修復(fù)過程,以肝臟中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)(如Ⅰ型和Ⅲ型膠原等)的異常產(chǎn)生與過度沉積為特征[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)是ECM的主要來源。病因去除后,HF可發(fā)生消退并伴隨著活化的肝星狀細胞(activated hepatic stellate cells,aHSC)的明顯減少[2]。aHSC的清除主要有以下4種方式:程序性細胞死亡、衰老、轉(zhuǎn)化為失活狀態(tài)及自然殺傷細胞(natural killer cells,NKcell)的殺傷[3-6]。來自免疫細胞、肝內(nèi)常駐細胞和ECM的細胞外信號都能對HSC的激活與aHSC的清除產(chǎn)生重要影響[3]。巨噬細胞具有高度的異質(zhì)性,是各類急、慢性肝病發(fā)病機制中的關(guān)鍵效應(yīng)細胞,可通過分泌可溶性因子、囊泡、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等多種方式對HSC的表型轉(zhuǎn)換進行調(diào)控[7]。本綜述總結(jié)了HF進程中,巨噬細胞異質(zhì)性對HSC命運的影響及其作用途徑。

一、肝巨噬細胞的異質(zhì)性

肝巨噬細胞的異質(zhì)性常通過不同細胞亞群的起源和遷移行為、極化表型、特殊標志物的表達以及效應(yīng)功能的差異進行解釋。

(一)起源的異質(zhì)性 根據(jù)不同的起源,肝巨噬細胞可分為肝巨噬細胞(Kupffer cells,KC)和單核細胞衍生的巨噬細胞(monocyte-derived macrophages,MoMF)。通常認為肝巨噬細胞亞群的功能與其起源密切相關(guān)。KC起源于胚胎卵黃囊或胎肝來源的紅系/髓系祖細胞,駐留于肝組織中,依靠巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)維持自我更新。KC具有免疫耐受性,參與鐵、膽紅素、膽固醇等的代謝,幫助病原微生物、細胞碎片、代謝廢物的清除以維持肝臟和全身的穩(wěn)態(tài)[8]。肝臟受損后,KC分泌的炎性細胞因子、趨化因子等生物活性物質(zhì),將大量免疫細胞募集到肝臟;在此過程中骨髓間充質(zhì)干細胞來源的循環(huán)單核細胞受到CC趨化因子配體2/CC趨化因子受體2(CC chemokine ligand 2/CC chemokine receptor 2,CCL2/CCR2)或CCL1/CCR5的引導(dǎo)向肝臟浸潤,分化為高表達淋巴細胞抗原6復(fù)合物C位點(lymphocyte antigen 6 complex locus C,LY-6C)的MoMF,發(fā)揮促炎和促纖維化的作用[9]。但是,有研究發(fā)現(xiàn)在疾病進程中同一來源的巨噬細胞會發(fā)生功能轉(zhuǎn)變,如在肝損傷消退期間,LY-6Chi巨噬細胞吞噬來自凋亡細胞的細胞碎片后,受胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)激活,可轉(zhuǎn)換為LY-6Clo的恢復(fù)性巨噬細胞[10]。此外,在KC大量死亡或耗竭的情況下,MoMF可向KC表型轉(zhuǎn)換[11]。

(二)極化方向的異質(zhì)性 依據(jù)極化表型巨噬細胞可被分為M1型和M2型。巨噬細胞受到脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、γ干擾素(interferon γ,IFN-γ)或腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等刺激后向M1型方向極化,參與1型輔助T(type 1 T helper,Th1)細胞型免疫應(yīng)答,分泌促炎細胞因子,發(fā)揮抗原呈遞功能,具有促炎、清除病原微生物、降解細胞外基質(zhì)、抗腫瘤的作用。巨噬細胞受到白細胞介素4(interleukin 4,IL-4)或IL-13等刺激后向M2型方向極化,參與Th2細胞型免疫應(yīng)答,并可進一步細分為發(fā)揮抗炎功能的M2a型、免疫調(diào)節(jié)功能的M2b型、創(chuàng)傷愈合功能的M2c型和促進腫瘤進展的M2d型[12]。但因巨噬細胞亞群有組織和疾病微環(huán)境特異性的基因轉(zhuǎn)錄、表觀修飾和代謝改變,簡單的二分類模型并不能完整地將各個亞群進行歸類。另外,具有同樣促炎或抑炎功能的巨噬細胞在異質(zhì)性分類上也并不一一對應(yīng),如LY-6ChiMoMF與M1型巨噬細胞及LY-6CloMoMF與M2型巨噬細胞間并無相應(yīng)的匹配關(guān)系。

(三)轉(zhuǎn)錄譜的異質(zhì)性 單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用又為巨噬細胞的異質(zhì)性提供了新的解釋。對人體健康肝臟樣本的轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),CD68+巨噬細胞表面膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細胞受體(macrophage receptor with collagenous structure,MACRO)表達水平有差異,可分為CD68+MARCO+細胞簇和CD68+MARCO-細胞簇。前者富集了耐受性相關(guān)的通路,具有免疫調(diào)節(jié)特征,而后者則富集了炎癥性相關(guān)的通路,表現(xiàn)出促炎特征[13]。

因此,用單一的標準對肝巨噬細胞進行分類具有一定的局限性,而以疾病背景下的功能特征為主要標準對巨噬細胞亞群進行歸類,有助于我們更好地理解巨噬細胞的異質(zhì)性,并提供了HF進程中巨噬細胞異質(zhì)性作用的研究線索。

二、肝巨噬細胞對HSC活化的調(diào)節(jié)

穩(wěn)態(tài)環(huán)境中,靜止表型的HSC位于肝細胞與肝竇內(nèi)皮細胞之間的Disse間隙內(nèi),其主要功能是儲存維生素A[2]。肝損傷后,HSC被激活,這一過程可分為啟動和延續(xù)兩個階段,啟動階段HSC對胞外信號作出反應(yīng),丟失儲存維生素A的脂滴,獲得增殖性、收縮性、炎性和趨化性;隨后的延續(xù)階段則涉及aHSC向受損部位的遷移、存活以及活化表型的保留與放大[3]。

(一)KC對HSC活化的調(diào)節(jié) KC激活后,分泌細胞因子、活性氧、損傷相關(guān)分子模式等刺激物質(zhì),直接參與HSC激活的啟動與延續(xù),從而導(dǎo)致HF的發(fā)生與進展(表1)。如在由四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的小鼠HF模型中,KC在肝內(nèi)CXCL6的誘導(dǎo)下分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),TGF-β可通過與HSC表面的I型受體結(jié)合誘導(dǎo)下游SMAD蛋白磷酸化,SMAD3進一步與BRD4相互作用并觸發(fā)BRD4/C-MYC/EZH2軸的級聯(lián)信號,最終導(dǎo)致HSC的活化[14]。KC對CCl4造成的肝組織損傷還能產(chǎn)生另一種損傷相關(guān)分子模式——高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1,HMGB1),它能增強HSC中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路的表達,進而促進I型膠原蛋白α1鏈(collagen type I alpha 1 chain,Colla1)的產(chǎn)生[15]。血吸蟲性肝病小鼠模型中,KC受血吸蟲可溶性蟲卵抗原的刺激而產(chǎn)生骨橋蛋白(osteopontin,OPN),OPN通過Hedgehog通路促進HSC激活并產(chǎn)生Ⅰ型膠原[16]。

表1 巨噬細胞在HSC活化過程中釋放的刺激物質(zhì)[3,17-22]

KC還可通過受體-配體相互作用的方式調(diào)節(jié)HSC的活化。如在膽管結(jié)扎法(bile duct ligation,BDL)和CCl4誘導(dǎo)的小鼠HF模型中,KC表面的膜結(jié)合配體Jagged-1與HSC的Notch受體結(jié)合,從而啟動Notch1介導(dǎo)的HSC的活化[23]。

(二)骨髓來源的巨噬細胞亞群對HSC活化的調(diào)節(jié) HF進展期間,LY-6Chi巨噬細胞亞群在肝臟中占主導(dǎo)地位,通過分泌各類刺激物質(zhì),為HSC的活化與存活提供了各類細胞外信號(表1)。如在由缺乏蛋氨酸和膽堿(methionine and choline deficient,MCD)飲食誘導(dǎo)的小鼠纖維化脂肪性肝炎模型中,C3ar1基因在骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)中表達上調(diào),誘導(dǎo)了IL-1β和TGF-β的產(chǎn)生,促使HSC中α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纖維發(fā)生相關(guān)基因(Colla1,TGF-β,Smad2)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物(GRP78,IRE1α,PDI)的表達上調(diào)[24]。

除了巨噬細胞衍生的各類可溶性因子外,MoMF還能通過其他途徑與HSC進行對話。Henderson等[25]借助單細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了一群從循環(huán)單核細胞中分化出來的TREM2+CD9+瘢痕相關(guān)巨噬細胞(scar-associated macrophages,SAMφ) 其表型與小鼠肝損傷模型中的MoMF類似,在人纖維化肝臟中大量擴增。SAMφ表達表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間充質(zhì)細胞有絲分裂原TNFSF12和PDGFB的配體,通過與PDGFRA+瘢痕相關(guān)的間充質(zhì)細胞表面同源受體的交互,促進了HSC中纖維狀膠原蛋白的表達。

BMDM對HSC活化的調(diào)控也發(fā)生在原發(fā)性肝病以外的情況中。胰腺導(dǎo)管腺癌背景下,轉(zhuǎn)移相關(guān)巨噬細胞(metastasis-associated macrophages,MAM)可通過分泌顆粒蛋白促進靜止狀態(tài)的HSC轉(zhuǎn)分化成分泌骨膜素的MFB,并形成有利于腫瘤細胞向肝臟轉(zhuǎn)移并生長的肝纖維化微環(huán)境[26]。

(三)M1型巨噬細胞亞群對HSC活化的調(diào)節(jié) Melgert等[27]對HF患者和小鼠肝臟中不同極化表型的巨噬細胞進行定位與定量研究發(fā)現(xiàn),在HF形成階段M1和M2極化表型的巨噬細胞均大量增殖且都參與了HSC的活化。但由于引起HF的原因各異,其發(fā)病機制與病理過程不同,導(dǎo)致占主導(dǎo)地位的巨噬細胞極化表型也不同。如在CCl4誘導(dǎo)的小鼠HF模型中,具有M1表型的F4/80+巨噬細胞可通過分泌IL-1和TNF-α上調(diào)核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路相關(guān)基因的表達,阻滯aHSC的凋亡,加重肝臟纖維化,但該路徑并不能上調(diào)Colla1、Colla2和Acta2等與HSC激活相關(guān)的基因的表達,無法直接參與HSC激活的啟動階段[28]。

另外,對M1型巨噬細胞與HSC的對話機制也有很多研究。Lian等[29]發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)刺激的THP-1(巨噬細胞系)可依靠嘌呤受體P2X配體門控性離子通道7 (purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7,P2X7R)-Toll樣受體4(toll like receptor4,TLR4)-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)式受體3(NLR family pyrin domain containing 3,NLRP3)軸以及IL-1β的分泌參與LX-2(HSC細胞系)激活的啟動與延續(xù)。Liu等[30]發(fā)現(xiàn)在LPS的刺激下THP-1細胞可產(chǎn)生含microRNA-103-3p的外泌體,microRNA-103-3p通過與Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)3’UTR的結(jié)合干擾其對α-SMA表達的負性調(diào)控作用,從而促進了HSC的增殖與活化。Liu等[31]又將RAW264.7(巨噬細胞系)用LPS進行了處理,發(fā)現(xiàn)其也可通過分泌microRNA-500抑制HSC中MFN2基因的表達并上調(diào)其下游Smad2/Smad3的磷酸化水平與TGF-β的蛋白質(zhì)表達水平,最終導(dǎo)致HSC的增殖,以及Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原的產(chǎn)生。

(四)M2型巨噬細胞亞群對HSC活化的調(diào)節(jié) 慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)可在體外誘導(dǎo)MoMF表面表達M2型巨噬細胞的標志物(CD206,CD163,DC-SIGN)并分泌TGF-β,這促使HSC中膠原蛋白、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)和α-SMA的表達上調(diào)。在慢性HCV感染者外周血和肝臟中也可觀察到循環(huán)單核細胞表面M2型相關(guān)標志物表達的增加,且其與HF嚴重程度呈正相關(guān)[32]。

在體外細胞培養(yǎng)體系中,亞砷酸鹽通過microRNA-21下調(diào)第10號染色體缺失性磷酸酶張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因的表達從而誘導(dǎo)THP-1細胞向M2表型極化,并分泌TGF-β等致纖維化細胞因子;將其與LX-2細胞共培養(yǎng)后,LX-2細胞中的α-SMA和膠原蛋白的表達量上調(diào)[33]。

三、肝巨噬細胞對aHSC清除的調(diào)節(jié)

aHSC的清除主要涉及以下4條途徑:程序性細胞死亡(凋亡、壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡、銅死亡和自噬等)、衰老、轉(zhuǎn)化為失活狀態(tài)以及NK細胞的殺傷[2,34,35]。細胞凋亡是aHSC在HF消退時較為主要的(約50%)一種清除方式[3]。巨噬細胞通過與HSC的對話來調(diào)控aHSC的多種清除途徑,但目前的研究主要集中在巨噬細胞誘導(dǎo)aHSC凋亡方面。

(一)LY-6Clo巨噬細胞亞群對aHSC凋亡的影響 肝損傷因素去除后,浸潤于肝組織中的LY-6ChiMoMF表面CX3CR1的表達上調(diào),與相應(yīng)配體CX3CL1結(jié)合后抑制其自身的促炎特性,并經(jīng)表型轉(zhuǎn)換衍生出恢復(fù)型巨噬細胞——CD11bhiF4/80intLY-6CloMoMF[3]。LY-6Clo巨噬細胞是產(chǎn)生MMP9、MMP12、MMP13的主要來源,其表面表達TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)[2,3]。LY-6CloMoMF通過MMP9、TRAIL誘導(dǎo)aHSC的凋亡[10]。TIMP可通過促進aHSC的生存信號以及激活NF-κB來維持aHSC的存活;LY-6CloMoMF通過MMP12和MMP13減少了aHSC中TIMP的表達,導(dǎo)致aHSC喪失維持存活的信號,減少aHSC的數(shù)目,推動纖維化的消退[36]。

(二)M1型巨噬細胞亞群對aHSC凋亡的影響 在HF消退期間,不同極化表型的巨噬細胞都能驅(qū)動aHSC的清除和ECM的降解,但與M2型相比,M1型巨噬細胞發(fā)揮了更重要的作用[12]。Miao等[37]在CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF模型中,向大鼠腹腔內(nèi)注射衣霉素誘發(fā)KC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum,ER);ER通過IRE1α/TRAF2/NF-κB信號通路促進KC向M1表型極化并增加TNF-α的釋放;源自M1型巨噬細胞的TNF-α對激活靜息態(tài)的HSC并無明顯的作用,卻可觸發(fā)TNF-R1/caspase 8信號導(dǎo)致HSC的凋亡。在BDL和CCl4誘導(dǎo)的小鼠HF模型中,M1型BMDM可增加纖維化肝臟中NK細胞的總數(shù)量,并誘導(dǎo)NK細胞的活化;這些NK細胞通過表達TRAIL促進aHSC的凋亡[38]。

四、總結(jié)與展望

HSC的活化與清除對HF的進程起決定性的作用,不同亞群的巨噬細胞可通過各種途徑調(diào)控HSC的命運,從而影響HF的進程。因此,以巨噬細胞與HSC間的交互為焦點進行探索,有助于我們找到抗HF治療新靶點。然而,目前尚存在一些問題與挑戰(zhàn)。一方面,HF是諸多慢性肝病進展期的共同病理過程,引起肝臟損傷的病因各異,其所形成的肝病微環(huán)境也不同,故巨噬細胞與HSC間的交互作用存在疾病特異性的差異,僅用單一的動物模型或體外細胞培養(yǎng)體系進行研究可能會偏離實際情況。另一方面,肝臟中的各種細胞與信號通路間均存在串擾,巨噬細胞與HSC的對話不可避免地會受到其他信號的影響。此外,雖然針對巨噬細胞的異質(zhì)性已開展了深入的研究,但目前仍缺乏一幅足夠清晰的圖景來刻畫不同亞群的特質(zhì)。最后,由于人體樣本的獲取難度高,目前的研究主要在嚙齒類動物模型中展開,種屬差異使實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化存在一定難度。但隨著單細胞測序、活體組織顯微成像、生物信息學(xué)等研究方法的發(fā)展,為明確巨噬細胞在HSC活化與清除中的調(diào)節(jié)方式和機制帶來了可能,并為HF的診治開發(fā)出更多切實有效的新方法提供了研究基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。