乙型肝炎病毒感染性疾病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性分析

趙成燕 周欣怡 高冉冉 韓丹 鄭嶸炅 魯曉擘

乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA病毒科病毒,其感染成為全球性公共衛(wèi)生問題。雖然隨著乙型肝炎疫苗的普及,我國在HBV感染防治方面已取得巨大成績,低年齡組人群HBV感染率大幅度下降,但HBV防治形式依然十分嚴(yán)峻。國內(nèi)仍約有7000萬HBV慢性感染者[1]。HBV感染早期無明確診斷,或?qū)Ω腥菊哌M(jìn)行持續(xù)治療,則部分患者會在感染后10～15年出現(xiàn)肝硬化、肝功能衰竭、甚至肝細(xì)胞癌(HCC)等[2]。國內(nèi)肝硬化和HCC中分別約有77%和84%為HBV感染所致[3]。探究影響HBV感染者肝損傷及惡化的危險因素,對預(yù)防HBV感染者肝硬化、肝衰竭、HCC發(fā)生具有重要意義。人體腸道中種類繁多的微生物被稱為“腸道菌群”。正常情況下,人體腸道菌群參與宿住新陳代謝,維持宿住身體健康?，F(xiàn)有研究證實,腸道菌群失調(diào)可能與慢性肝損傷[4]、糖尿病[5]、惡性腫瘤[6]等發(fā)生有關(guān)。趙志方等[7]研究發(fā)現(xiàn),與健康人群相比,慢性乙型肝炎(CHB)患者體內(nèi)出現(xiàn)普雷沃氏菌屬(Prevotella)、勞特氏菌屬(Blautia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、真桿菌屬(Eubacterium eligens group)等菌屬失調(diào),單形擬桿菌中的Ruminococcus sp.5-1-39BFAA與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、超敏C反應(yīng)蛋白(HsCRP)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)水平呈顯著負(fù)相關(guān),Bacteroides uniformis與ALT水平正相關(guān),提示腸道菌群失調(diào)可能在肝損傷發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。但關(guān)于不同肝損傷程度的HBV感染者腸道菌群失調(diào)的具體表現(xiàn),目前尚缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)報道。本研究采用基因測序法對HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化(LC)、肝細(xì)胞癌(HCC)、慢加急性肝衰竭(ACLF)、自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者腸道菌群進(jìn)行測定分析,以明確腸道菌群失調(diào)在HBV感染肝臟功能損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用機制,從而為HBV者持續(xù)干預(yù)提供參考。

資料與方法

一、一般資料

選擇2020年2月—9月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病專科接受診治的133例肝病患者為研究對象,其中HBV攜帶者(HBV組) 23例、LC(LC組) 25例、HCC(HCC組) 38例、ACLF(ACLF組) 16例、AIH (AIH 組)13例、PBC(PBC組)18例。納入標(biāo)準(zhǔn):①HBV組和LC組診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3],ACLF組符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8],HCC組符合《中國原發(fā)性肝細(xì)胞癌放射治療指南(2020年版)》中有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9],AIH組符合《自身免疫性肝炎診斷和治療共識( 2015)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],PBC組符合《對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見》中診斷標(biāo)準(zhǔn)[11];②入組前3個月內(nèi)未使用過抗菌類藥物,4周內(nèi)未使用過益生菌或促胃腸動力藥物;③了解研究內(nèi)容且簽署知情協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn):①丙型肝炎病毒等其他肝炎病毒感染性疾病;②具有消化道器質(zhì)性病變或手術(shù)操作史;③具有甲狀腺功能異?；蜃陨砻庖呦到y(tǒng)疾病;④無糖尿病、脂肪肝代謝性疾病[2]。6組患者基本資料間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1)。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 各研究樣本基本情況比較

二、研究方法

(一)樣本采集 留取納入者晨起時新鮮糞便樣本,采樣勺取其中間部分置入采樣管,-80 ℃冷藏待用。

(二)DNA提取及擴增 CTAB法(諾禾致源)提取糞便樣本中細(xì)菌總DNA,1%瓊脂凝膠電泳監(jiān)測所提取總DNA濃度和完整性。無菌水將DNA樣本稀釋至1 ng/mL。利用特定性引物擴增DNA樣本中16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)域(PCR擴增條件:98 ℃初變性60 s,隨后98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃伸長30 s,共30個循環(huán),之后72 ℃延伸5 min)。PCR擴增產(chǎn)物與相同體積1×負(fù)載緩沖液混合,2%瓊脂凝膠電泳儀電泳,Qiagen Gel Extraction對混合PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

(四) 生物信息分析 FLASH對剪切的reads進(jìn)行合并;根據(jù)QIIME質(zhì)量控制流程對原始標(biāo)簽在特定過濾條件下進(jìn)行質(zhì)量過濾,得到高質(zhì)量的潔凈標(biāo)簽;UCHIME將標(biāo)簽與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,去除嵌合體序列;最終獲得有效標(biāo)簽。Usparse軟件進(jìn)行序列分析,相似度≥97%的序列被分配到相同的可操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU)中;Silva數(shù)據(jù)庫基于Mothur算法對OTU進(jìn)行分類信息標(biāo)注;QIIME軟件(Version 1.7.0)計算樣本腸道菌群多樣性;QIIME軟件(Version 1.9.1)計算加權(quán)和未加權(quán)單株的Beta多樣性;R軟件(Version 2.15.3)中的ade4包和ggplot2包對原始變量主成分分析(Principal component analysis,PCA)和主坐標(biāo)分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA);QIIME軟件(Version 1.9.1)進(jìn)行非加權(quán)算術(shù)均值對組法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means,UPGMA)聚類。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組患者腸道菌群組成

6組的138個樣品共獲得83 065條有效數(shù)據(jù),經(jīng)過質(zhì)控得到69 984條數(shù)據(jù),質(zhì)控有效率為83.83%。按照97%的一致性,將獲得有效序列聚類成OTUs,共得到12 022個OTUs。不同組間特有和共有OUT花瓣圖分析繪制成韋恩圖,其中HBV組獨有OTUs數(shù)目最多,LC組次之,AIH組最少,見圖1。HBV組獨有OTUs數(shù)目最多,其次為LC組、PBC組、HCC組,AIH和ACLF組最少。

圖1 各組腸道微生物OUT分布韋恩圖

二、腸道菌群結(jié)構(gòu)

物種注釋結(jié)果顯示,6組樣本門水平上最大豐度均處于前10位的分布為Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteria、Verrucomicrobiota、Fusobacteriata、Cyanobacteria、Unidentified bacteria、Actinobacteriota、Synergistota,其中以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主,HBV組、LC組、HCC組、ACLF組、AIH組和PBC組樣本中最大豐度處于前4位菌門的總占比分布為88.76%、97.22%、96.15%、92.88%、95.91%和93.36%,見圖2。

圖2 各組門水平物種相對豐度柱狀圖

在門的水平上,HBV組和HCC組Actinobacteria豐度顯著高于LC組,HBV組Actinobacteriota豐度顯著高于LC組、HCC組和ACLF組,LC組和ACLF組均顯著低于PBC組;LC組Bacteroidota豐度顯著高于HCC組;HCC組的Firmicutes豐度顯著高于HBV組;同時,HBV組其他菌門豐度均顯著高于LC組、HCC組和ACLF組,ACLF組明顯低于PBC組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 各組門水平上物種顯著性差異統(tǒng)計圖

三、各組腸道菌清α多樣性比較

從每個樣本中抽取一定測序量的數(shù)據(jù),統(tǒng)計其所代表物種數(shù)目,并以此構(gòu)建稀釋曲線,結(jié)果顯示,隨測序量增加,各組觀測物種數(shù)量不斷增加,且最終均趨于平坦,測序數(shù)據(jù)量和深度均合理(圖4左)。Round-Abundance曲線分析顯示:HBV組橫軸上范圍最大,物種豐度最大,PBC組次之,隨后依次為LC組、HCC組、ACLF組,AIH組橫軸上范圍最小,物種豐度最低;縱軸上,HBV組曲線最平緩,物種分布最均勻,其次依次為PBC組、LC組和HCC組,ACLF組和AIH組平緩度相似,兩組均勻度相對較差(圖4右)。

圖4 各組樣本物種多樣性比較(左:稀釋曲線;右:Rank-Abundance曲線)

四、各組腸道菌群的β多樣性分析

PCA主成分和PCoA主坐標(biāo)分析顯示,6組樣本腸道菌群存在明顯差異(圖A和B)。基于β多樣性距離非度量多維尺度分析(NMDS)顯示,HBV組、LC組、HCC組和PBC組中樣本間離散度較高,組內(nèi)菌群差異性較大,ACLF組AIH組中樣本間距較近,組內(nèi)群落比較集中。HBV組與LC組、HCC組、PBC組樣本多分布于不同區(qū)域,組間腸道菌群群落結(jié)構(gòu)差異較大;ACLF組與AIH組樣本間距較近,群落結(jié)構(gòu)相似,見圖5。

圖5 各組腸道菌群多樣性的PCA(A)、PCoA(B)和NMDS分析(C)

五、各組樣本腸道菌群復(fù)雜度分析

HBV組所測物種數(shù)明顯多于LC組、HCC組和ACLF組,LC組明顯低于AIH組和PBC組,HCC組和ACLF組均顯著低于PBC組(P<0.05),而AIH組與HBV組、HCC組和ACLF組間所測物種數(shù)間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖6左)。HBV組Shannon指數(shù)明顯高于LC組和ACLF組,LC組、HCC組、ACLF組Shannon指數(shù)均明顯低于PBC組(P<0.05),但HBV組與HCC組、AIH組與HBV組、HCC組和ACLF組Shannon指數(shù)間比較差異均無統(tǒng)計意義(P>0.05)(圖6右)。

圖6 各組腸道菌群復(fù)雜度比較

六、各組樣本菌群屬間差異分析

HBV組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Unidentified-Chloroplast,豐度最低的為Escherichia-Shigella、Ruminococcus、Pseudomonas、Veillonella;LC組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Megamonas、Clostridioides、Prevotella-9、Dialister,豐度最低的為Bifidobacterium、Streptococcus、Blautia、[Rumimococcus]-gnavus-group;ACLF組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Akkermansia、Anaeroglobus、Lactiplantibacillus,豐度最低的為Megaspaera、Ligilactobacillus;HCC組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Acinetobacter、Ralstonia、Subdologrenulum、Pseudomonas,豐度最低的為Prevotella-9、Parabacteroides;AIH組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Bacteroides、Blautia、[Rumimococcus]-gnavus-group,豐度最低的Enteroccocus;PBC組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Prevotella、Alloprevotella、Neisseria、Fusobacterium,豐度最低的Alistipes、Agathobacter,見圖7。

圖7 Heatmap圖比較差異菌種在各組中的分布

通過對6組樣本進(jìn)行LEfSe分析(LDA閾值設(shè)定為4),共發(fā)現(xiàn)23個biomarker,其中ACLF組生物多樣性最豐富,代表菌群較多,LC組和PBC組次之,隨后依次為HBV組和AIH組;HCC組多樣性較少,且與其他菌群存在較大重疊,故無差異顯著的菌群,見圖8。

圖8 各組菌群屬間菌群LEfSe分析

討 論

HBV感染所致CHB可引起各種急、慢性肝損傷,進(jìn)展為LC、ACLF或HCC等,嚴(yán)重?fù)p傷人類身心健康,威脅患者生命安全[12]。全球約有2.57億慢性HBV感染者,88.7萬死于CHB并發(fā)癥[13],38.4萬死于LC[14]。腸道菌群是人體最大且最重要的微生態(tài)系統(tǒng),腸道中定植有超過100萬億個微生物,這些微生物參與并影響宿住生理代謝和各種生理病理過程[15-16]。肝病發(fā)病機制相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),慢性肝損傷患者體內(nèi)會發(fā)生腸道菌群失衡,且腸道菌群失衡與HBV感染相關(guān)肝病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[17]。Wang等[18]利用Illumina MiSeq測序平臺對85例Child-Pugh評分較低的CHB患者腸道微生物組成與22例健康對照者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),與健康人群相比,CHB患者腸道菌群發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)為Actinomyces、Clostridium sensu stricto、unclassified Lachnospiraceae、Megamonas4個屬OTUs增加,Alistipes、Asaccharobacter、Bacteroides、Butyricimonas、Clostridium IV、Escherichia/Shigella、Parabacteroides、Ruminococcus、unclassified Bacteria、unclassified Clostridiales、Unclassified Coriobacteriaceae、Unclassified Enterobacteriaceae、Unclassified Lachnospiraceae和Unclassified Ruminococcaceae等27菌門減少,這些變化提示腸道菌群失衡與CHB進(jìn)展具有潛在貢獻(xiàn)。

鄭婷婷等[19]研究顯示,健康人及CHB、LC和ACLF患者腸道菌群均以Firmicutes、Bacteroidota為主,與本研究結(jié)果略有不同,本研究以CHB、LC、HCC、ACLF 4個HBV感染不同階段患者和AIH、PBC患者腸道菌群結(jié)構(gòu)為研究,6組樣本中門水平以Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota為主。這可能與研究對象生活于不同地區(qū)有關(guān)。李攀[20]研究結(jié)果顯示,腸道菌群與宿住信息存在廣泛聯(lián)系,地理因素對人體腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響甚至超過了不同地區(qū)疾病的影響。邢樂康等[21]研究顯示,與健康人群相比,ACLF患者腸道菌群豐度和多樣性均下降,且隨著肝損傷病情進(jìn)展腸道菌群失衡現(xiàn)象越嚴(yán)重。6組樣本腸道菌群豐度依次為HBV組、PBC組、LC組、HCC組、ACLF組、AIH組,HBV組、LC組、HCC組和PBC組組內(nèi)菌群差異性較大,組間腸道菌群群落結(jié)構(gòu)差異較大,ACLF組、AIH組中腸道菌群群落比較集中,群落結(jié)構(gòu)相似。證實,HBV感染后隨肝臟損傷病情加重,其腸道菌群多樣性明顯下降,群落結(jié)構(gòu)差異性增大,且相同肝損傷階段患者體內(nèi)腸道菌群存在明顯個體差異。此外,HBV組和HCC組Actinobacteria豐度顯著高于LC組,HBV組Actinobacteriota顯著高于LC組、HCC組和ACLF組,LC組和ACLF組的Actinobacteriota及顯著低于PBC組;LC組Bacteroidota豐度顯著高于HCC組;HCC組的Firmicutes豐度顯著高于HBV組。Actinobacteria和Actinobacteriota下的雙歧桿菌科屬于腸道有益微生物,具有營養(yǎng)人體、增強機體免疫、改善胃腸功能等生理作用。Xu等[22]分析顯示,在CHB和LC患者體內(nèi)腸道雙歧桿菌從有益菌轉(zhuǎn)變?yōu)闄C會病原菌,與健康人群相比,CHB和LC患者腸道中雙歧桿菌頻率減少,LC中檢出頻率低于CHB患者。Bacteroidota和Firmicutes均為腸道主要菌群,HBV感染導(dǎo)致機體腸道細(xì)菌多樣性下降,Bacteroidota下降,Firmicutes增多。Bacteroidota中含有膽汁酸鹽水解酶,其可直接與膽鹽和膽固醇等結(jié)合,從而降低機體膽固醇,故其下降可加重肝組織損傷,增加癌變風(fēng)險[23]。Bacteroidota和Firmicutes相互作用下,腸道有效吸收食物中熱量、積累脂肪,脂肪的積累會減少腸道黏蛋白,降低腸道屏障能力,增加Firmicutes侵襲風(fēng)險,增加機體炎癥反應(yīng),加重肝臟組織損傷和癌變風(fēng)險。

綜上所述,HBV感染者隨著肝損傷病情加重可出現(xiàn)腸道菌群豐度和多樣性下降,且HBV感染者腸道菌群豐度和多樣性與AIH和PBC患者均存在明顯差異。然而,受條件限制,本研究樣本量納入樣本量偏小,導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定局限性,需要后續(xù)加大樣本量做進(jìn)一步驗證,以更好地做好CHB感染者疾病控制和不良結(jié)局預(yù)防。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。