滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢對凍胚移植新生兒出生體質(zhì)量的影響

楊如雪,黃江笛,徐 影,胡繼君,張俊韋,管一春,孫麗君

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心,鄭州 450052)

自1990年首例應(yīng)用胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing,PGT)技術(shù)的試管嬰兒出生以來[1],PGT技術(shù)得到了迅速發(fā)展。PGT檢測技術(shù)包括卵裂球基因檢測、極體活檢、細(xì)胞游離DNA檢測和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢[2-3]。滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢是在囊胚階段獲取3～5個滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)診斷,而滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞主要發(fā)育成胎盤部分。滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢不會影響發(fā)育成為胎兒的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)[4],相比于卵裂球基因檢測與極體活檢技術(shù),不僅可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,還相對保障了胚胎的安全[5]。雖然滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢已廣泛應(yīng)用于臨床,但透明帶打孔及激光切割外胚層細(xì)胞屬于對胚胎的侵入性操作[6],是否對胚胎后續(xù)發(fā)育存在不利影響尚未可知。

PGT技術(shù)包括胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)重排檢測(preimplantation genetic testing for chromosomeal structural rearrangements,PGT-SR)、胚胎植入前非整倍體篩查(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)和胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing for monogenic,PGT-M)[7]。PGT-A用于夫妻雙方染色體核型正常,但胚胎染色體非整倍體高風(fēng)險的患者,如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗和高齡的患者[7-9]。文獻(xiàn)表明,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者在隨后的妊娠中早產(chǎn)率明顯升高[10],反復(fù)著床失敗患者行凍胚移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)后單胎活產(chǎn)低出生體重兒、早產(chǎn)和胎膜早破的發(fā)生風(fēng)險增加[11]。PGT-SR適用于染色體結(jié)構(gòu)異常的夫婦,篩選染色體正常胚胎進(jìn)行移植[12]。PGT-M可用于攜帶致病基因的夫妻,以篩選未患病的子代[13]。目前很少有研究排除PGT-A周期來研究滋養(yǎng)外胚層活檢對出生體重和圍產(chǎn)期結(jié)局的影響。本研究旨在探討經(jīng)凍胚移植并獲得單胎活產(chǎn)的周期(PGT-SR、PGT-M及ICSI周期)中,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢對新生兒出生體質(zhì)量、圍產(chǎn)期及新生兒結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性隊列研究分析2017年1月至2021年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)/PGT-FET助孕并獲得單胎活產(chǎn)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)采用ICSI/PGT-FET單枚囊胚移植患者;(2)獲得單胎活產(chǎn)的周期;(3)女方年齡小于43歲;(4)臨床周期資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)行PGT-A助孕的患者;(2)子宮結(jié)構(gòu)異常,如子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮解剖異常、宮腔粘連子宮肌瘤及輸卵管積水患者等;(3)受卵周期;(4)重復(fù)移植患者。本研究符合《赫爾辛基宣言》基本原則。納入PGT和同期ICSI助孕患者,通過PSM對兩組進(jìn)行1∶2匹配,匹配變量包括孕產(chǎn)次數(shù)、不孕年限及移植日內(nèi)膜厚度(卡鉗值=0.1),匹配后得到PGT組191例和ICSI組363例。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵方案及授精方式 根據(jù)患者個體情況采用本中心的對應(yīng)促排卵方案進(jìn)行促排卵,取卵日行超聲引導(dǎo)下卵泡穿刺術(shù),在體視顯微鏡下分揀出卵冠丘復(fù)合物,沖洗干凈,置于內(nèi)有G-IVF+培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife)的中央井皿。所有PGT周期均采用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)授精方式,在人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)(中國珠海麗珠制藥)注射后40h左右進(jìn)行ICSI授精,ICSI后將卵子放入G-1+培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife)中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 胚胎培養(yǎng)及評分 使用Vitrolife和Cook兩種序貫培養(yǎng)液進(jìn)行胚胎的培養(yǎng)。ICSI授精后放于卵裂培養(yǎng)液中培養(yǎng),16～20h后觀察原核及極體情況,于D3換至囊胚培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。于D5、D6及D7進(jìn)行囊胚的觀察并評分。囊胚參照Gardner評分法[14]進(jìn)行評分:將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞分為A～C級。A級:細(xì)胞數(shù)目多,排列緊密;B級:細(xì)胞數(shù)目少,排列松散;C級:細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均不為C級時評為優(yōu)質(zhì)囊胚,兩者中任一評為C級則為非優(yōu)質(zhì)囊胚,兩者均為C級評為不可利用囊胚。囊胚評分≥4BC級時符合活檢的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 囊胚活檢 均于囊胚期進(jìn)行活檢,活檢前在囊胚透明帶上打孔,對遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢,活檢3～5個細(xì)胞,使用激光(英國RI Satum 5 Active)切割法進(jìn)行切割,能量0.20～0.25ms?；顧z后的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞使用G-Mops plus液清洗,轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的PCR管中進(jìn)行NGS法檢測?；顧z后的囊胚進(jìn)行冷凍。不同的操作者均按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operation procedure,SOP)進(jìn)行,所有操作均在雙人核對下進(jìn)行。

1.2.4 凍胚復(fù)蘇周期內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植 HRT周期方案:適用于平素月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙、自然周期卵泡生長不良者。月經(jīng)周期2～3d常規(guī)陰道超聲檢查,內(nèi)膜剝脫后(≤6mm)開始口服戊酸雌二醇(商品名:補(bǔ)佳樂,德國拜耳公司)4～8mg,根據(jù)患者子宮內(nèi)膜生長情況調(diào)整劑量,當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8mm,雌激素作用時間≥12d時轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。自然周期方案:適用于平素月經(jīng)規(guī)律、有正常排卵者。月經(jīng)周期2～3d常規(guī)陰道超聲檢查,排除卵巢及子宮異常情況,月經(jīng)10～12d開始監(jiān)測卵泡發(fā)育,當(dāng)卵泡直徑≥14mm,囑每日陰超,若尿促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)試紙陽性,測定血LH、雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)水平,出現(xiàn)LH峰給予HCG 10000IU,次日陰超監(jiān)測不論是否排卵均轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。刺激周期方案:適用于排卵障礙者。月經(jīng)周期3～5d給予口服來曲唑(letrozole,LE,江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)2.5～5mg/d×5d,月經(jīng)周期10d開始監(jiān)測卵泡,根據(jù)卵泡發(fā)育情況加用人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropins,hMG),至優(yōu)勢卵泡直徑≥18mm,給予HCG 10000IU次日轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。轉(zhuǎn)化日給予陰塞黃體酮緩釋凝膠(雪諾酮,瑞士默克雪蘭諾有限公司)90mg/d,同時口服地屈孕酮(達(dá)芙通,荷蘭蘇威制藥公司)20mg/d至移植后14d。轉(zhuǎn)化第6d后移植囊胚期胚胎。

1.2.5 圍產(chǎn)期結(jié)局隨訪 移植后30d陰道超聲監(jiān)測是否有孕囊及胚芽、胎心,確定是否臨床妊娠,并記錄孕囊位置及孕囊數(shù)。隨訪至妊娠結(jié)束,電話隨訪或在病歷系統(tǒng)中查詢并記錄妊娠期并發(fā)癥及新生兒結(jié)局等指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo) 包括一般資料、妊娠期并發(fā)癥及新生兒結(jié)局。新生兒出生體質(zhì)量<2500g稱為低出生體質(zhì)量兒,>4000g稱為巨大兒。

2 結(jié) 果

2.1 匹配前后兩組患者治療的基線數(shù)據(jù)比較 共納入977例,其中PGT組221例,ICSI組756例。兩組孕產(chǎn)次存在差異,PGT組的不孕年限及移植日內(nèi)膜厚度顯著低于ICSI組(P<0.05)。傾向性評分匹配后得到PGT組191例和ICSI組363例,兩組基線數(shù)據(jù)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

表1 匹配前后兩組患者治療的基線數(shù)據(jù)比較

2.2 兩組患者圍產(chǎn)期結(jié)局比較 匹配前后,兩組的妊娠期高血壓疾病發(fā)生率、妊娠期糖尿病發(fā)生率、胎膜早破、前置胎盤、剖宮產(chǎn)率及新生兒結(jié)局比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。

表2 匹配前患者圍產(chǎn)期結(jié)局的比較(x±s,%)

2.3 多因素回歸分析單胎活產(chǎn)新生兒出生體質(zhì)量的影響因素 多因素線性回歸分析結(jié)果顯示,PSM前后兩組患者新生兒出生體質(zhì)量均無明顯差異(P=0.623,P=0.897)。女方BMI、移植日子宮內(nèi)膜厚度、分娩孕周和新生兒性別顯著影響新生兒出生體質(zhì)量(P均<0.05)(表3)。

表3 多因素線性回歸分析單胎活產(chǎn)新生兒出生體質(zhì)量的影響因素

3 討 論

人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)是受精卵著床后由絨毛滋養(yǎng)層的合體細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素,包括α、β兩個亞基,其中β-HCG是維持妊娠所必需的關(guān)鍵胚胎信號及妊娠早期的特異標(biāo)志物[15-16],妊娠早期血清β-HCG水平在一定程度上代表了胎盤分泌功能。目前滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢后其細(xì)胞數(shù)目減少是否導(dǎo)致血清β-HCG水平下降并影響胎盤功能存在爭議。有研究表明,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢降低妊娠早期血清β-HCG水平[17],可能對后期胎盤功能、胎兒生長發(fā)育及母體產(chǎn)生不良影響。Wu等[18]則持相反觀點(diǎn),即滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢不影響囊胚移植后14d血清β-HCG水平。然而,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢對后續(xù)妊娠中母兒結(jié)局影響的研究很少。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗患者發(fā)生早產(chǎn)等妊娠不良結(jié)局風(fēng)險增加[10-11],本研究排除了此類患者的PGT-A周期。為避免卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)對研究結(jié)果產(chǎn)生影響,本研究中納入采取ICSI方式授精的PGT患者為實驗組并將同期ICSI助孕患者作為對照組。研究對象均為移植單枚凍囊胚并獲得單胎活產(chǎn)的周期,可消除多胚胎移植、移植胚胎時期、多胎妊娠與新鮮胚胎周期移植的影響。本研究結(jié)果表明,PGT組與ICSI組單胎活產(chǎn)周期的圍產(chǎn)期結(jié)局無明顯差異。與文獻(xiàn)報道[17,19]一致,即滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢可能不會增加不良新生兒結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險。本中心既往研究表明,PGT助孕患者的妊娠期高血壓疾病的發(fā)生風(fēng)險高于體外受精(in vitro fertilization,IVF)與ICSI助孕患者,可能與活檢后胎盤功能和血管結(jié)構(gòu)異常有關(guān)[20-21]。本研究中,匹配后PGT組高血壓疾病的發(fā)生率高于ICSI組(6.3% vs 3.0%),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.068)。可能與本研究僅納入PGT-SR、PGT-M周期與ICSI助孕患者進(jìn)行比較有關(guān)。女方既往孕產(chǎn)次數(shù)、分娩孕周與巨大兒發(fā)生風(fēng)險呈正相關(guān)[22]。Zhang等[23]認(rèn)為,男性新生兒的出生體質(zhì)量高于女性。將這些變量納入多元線性回歸分析,結(jié)果顯示女方BMI、移植日子宮內(nèi)膜厚度、分娩孕周和新生兒性別顯著影響新生兒出生體質(zhì)量。

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)中的一些操作與治療,如滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢、胚胎冷凍和FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案等,對圍產(chǎn)期結(jié)局的潛在影響很難完全消除[21]。相比于自然妊娠,PGT與前置胎盤、剖宮產(chǎn)和早產(chǎn)的風(fēng)險增加有關(guān),但這些增加的風(fēng)險與其他ART助孕周期相當(dāng)[24]。由于對胚胎進(jìn)行侵入性操作,PGT安全性一直備受關(guān)注[25]。隨著PGT的廣泛應(yīng)用,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢對胚胎著床后進(jìn)一步發(fā)育的影響值得深入研究。

本研究使用傾向性評分匹配使兩組患者基線具有可比性,顯著降低影響新生兒出生體質(zhì)量的偏倚。但本研究存在以下不足:單中心回顧性隊列研究,缺乏男方及孕婦孕期的數(shù)據(jù),如吸煙、飲酒、飲食、運(yùn)動、體重變化、胎盤發(fā)育和胎盤重量等數(shù)據(jù)。后續(xù)研究中,有待加大樣本量或采用隨機(jī)對照研究進(jìn)一步評估滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢的安全性。