茅臺(tái)鎮(zhèn)不同海拔酒廠環(huán)境可培養(yǎng)酵母多樣性分析

王星　譙露　周葉鳴　董醇波　韓燕峰　鄒曉

摘要：以中國醬香酒核心產(chǎn)區(qū)仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)為研究區(qū)域，探索高溫大曲和環(huán)境中可培養(yǎng)酵母的物種多樣性，以及在不同海拔下的種群結(jié)構(gòu)和相對豐度。結(jié)果顯示，從高溫大曲和環(huán)境樣品中最終分離474株酵母，鑒定為21屬32個(gè)種，其中從環(huán)境樣品中共分離269株酵母，鑒定為19屬28個(gè)種；從大曲中共分離205株酵母，鑒定為15屬18個(gè)種。Wickerhamomyces anomalus在環(huán)境和大曲中均作為核心酵母菌。環(huán)境中分離出的酵母菌多樣性指數(shù)高于高溫大曲。在不同海拔梯度上，環(huán)境樣品中酵母多樣性和豐度差異明顯，高溫大曲中酵母多樣性和豐度差異較小，主要的優(yōu)勢菌群均保持一定的相似性和穩(wěn)定性?？偟膩碚f，海拔500 m以上的酵母菌群落結(jié)構(gòu)較為相似；海拔500～600 m的酵母菌群相對豐度及多樣性最高，海拔600 m以上酵母多樣性及豐度要低于海拔500 m以下。

關(guān)鍵詞：環(huán)境；大曲；可培養(yǎng)方法；不同海拔；酵母菌群多樣性

中圖分類號：TS262.33文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）06－0065－07國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.06.009

仁懷市位于貴州省西北部，地處赤水河中游，大婁山脈西段北側(cè)［1］。作為中國醬香型白酒的發(fā)源地和核心產(chǎn)區(qū)，仁懷市有著悠久的釀酒歷史、特殊的釀造環(huán)境和獨(dú)特的釀造工藝，代表著醬香白酒釀造的最高水準(zhǔn)。醬香白酒作為我國的特色名酒，具有突出濃郁的酒體風(fēng)格，是世界上最受歡迎的酒類之一［2］。其釀造工藝以“三高三長”著稱，即高溫制曲、高溫堆積、高溫蒸餾，大曲貯存時(shí)間長、基酒生產(chǎn)周期長、基酒酒齡長［3］。復(fù)雜的釀造工藝也造就了其他香型白酒無法比擬的特殊風(fēng)味［4］。無法復(fù)制的釀造環(huán)境和常年釀酒所形成的特殊微生物區(qū)系也直接影響著發(fā)酵的產(chǎn)率和質(zhì)量［5］。釀造過程微生物群系來源廣泛，主要有生產(chǎn)原料、大曲和發(fā)酵環(huán)境［6］。整個(gè)釀酒過程涵蓋著細(xì)菌、酵母、霉菌等菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜的演替，其中酵母菌是白酒釀造發(fā)酵的主要?jiǎng)恿Γ?］。酵母菌在釀造過程中大量存在，除高溫大曲自身提供的酵母外，釀造環(huán)境（如地面、空氣、使用工具等）、生產(chǎn)原料都能夠提供來源［8］。

茅臺(tái)鎮(zhèn)作為最大的醬香型白酒產(chǎn)地，位于仁懷西北部13 km處，屬河谷坡地。張亞麗［9］對茅臺(tái)鎮(zhèn)空氣微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵微生物有一部分來源于當(dāng)?shù)氐目諝馕⑸?，即“離開茅臺(tái)鎮(zhèn)，就釀不出茅臺(tái)酒”［10］。特殊復(fù)雜的釀造工藝與不可復(fù)制的釀造環(huán)境造就了醬香型白酒獨(dú)特的風(fēng)格特征，而釀造過程的極端環(huán)境，也迫使微生物經(jīng)過長期生存馴化，從而形成了醬香酒釀造環(huán)境中特有的微生物菌群［11］。對釀造環(huán)境中的酵母進(jìn)行研究已成為研究酵母類群的熱點(diǎn)。

茅臺(tái)醬香酒的工藝使得大曲能夠不斷從釀造環(huán)境中富集釀造酵母菌［12-13］，相對開放的環(huán)境也使得大曲中的酵母能夠被釋放到環(huán)境中，從而形成較為特殊的酒體風(fēng)味。吳徐建［14］對醬香型白酒釀造2～7輪次環(huán)境、大曲及酒醅中的酵母進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)釀造空氣中幾乎包含了大曲中的酵母種屬。隨著茅臺(tái)醬香酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需求增加，發(fā)酵性能好、產(chǎn)香性能好的酵母的分離成為研究的主要目的之一［15-16］。

研究表明，隨著海拔的變化，光照、水分、溫度、土壤養(yǎng)分、植物等因子也隨之改變，從而引起區(qū)域小氣候的微生物發(fā)生變化［17］。Wang等［18］跟蹤大曲發(fā)酵過程微生物的變化情況發(fā)現(xiàn)，大曲存放的位置不同，微生物群落的結(jié)構(gòu)也會(huì)不同。因此，不同的小氣候可能會(huì)對酵母種類和數(shù)量產(chǎn)生影響，從而直接或間接影響醬香型白酒的發(fā)酵及其品質(zhì)［19］。目前對茅臺(tái)鎮(zhèn)的酵母研究常限于某一輪次或某個(gè)酒廠，酵母群落結(jié)構(gòu)在不同海拔層面上的關(guān)系還未揭示。因此，本研究根據(jù)茅臺(tái)鎮(zhèn)各酒廠在不同海拔的分布情況，大致可分為<500 m、500～600 m、>600 m等3個(gè)梯度，對不同海拔釀造環(huán)境及大曲中的酵母進(jìn)行可培養(yǎng)分離，這有利于認(rèn)識酵母菌在不同海拔上的群落結(jié)構(gòu)分布差異，也為茅臺(tái)鎮(zhèn)的釀酒酵母研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試樣品

環(huán)境樣品及大曲樣品取自貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)核心釀酒區(qū)域，分別在海拔<500 m（H1）、500～600 m（H2）、>600 m（H3）各選取3家醬香型白酒公司，共9家（表1）。其中環(huán)境樣品采集包括：將各酒廠生產(chǎn)車間的窗戶玻璃、窗臺(tái)、晾堂及四周地面、墻面、墻角、行車梯子及上表面、配電箱上表面、消防箱上表面、儲(chǔ)酒罐和一些平時(shí)不易被打掃的角落等處的采樣點(diǎn)進(jìn)行灰塵樣品等量采集并均勻混合，每個(gè)企業(yè)采集混合樣100 g。大曲樣品為曲房貯存使用的生產(chǎn)用大曲，每個(gè)企業(yè)采集混合樣500 g（取樣時(shí)間2022年7月—2023年3月）。同一海拔梯度采樣點(diǎn)采集的兩類樣品分別進(jìn)行等量均值混勻，采集后立即裝袋密封運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2供試培養(yǎng)基

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g、酸水解酪蛋白5.0 g、葡萄糖50.0 g、磷酸二氫鉀0.55 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.0025 g、硫酸錳0.0025 g、溴甲酚綠0.022 g、瓊脂17 g、pH值5.5±0.2。

麥芽汁液體培養(yǎng)基：麥芽膏粉130.0 g、氯霉素0.1 g、pH 5.6±0.2。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1稀釋涂布平板分離

在無菌條件下分別稱取25 g大曲粉末和25 g環(huán)境樣品于225 mL無菌水中，搖床充分震蕩30 min，制成菌懸液。從菌懸液中取1 mL加到9 mL無菌水中，以10倍為稀釋單位，逐次稀釋到10-2～10-7倍，各吸取100 μL菌懸液于WL營養(yǎng)培養(yǎng)基中（3個(gè)平行）。放入30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d，然后進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)。酵母菌的鑒定根據(jù)形態(tài)持征，參照《常見與常用真菌》中的方法鑒定［20］。

1.2.2劃線平板分離

根據(jù)稀釋涂布平板上的單菌落特征，挑取形態(tài)不同的菌株在平板上劃線純化2～3次，獲得酵母菌純培養(yǎng)物，純化后的菌株4 ℃斜面保存。

1.2.3酵母的分子生物學(xué)鑒定

將活化后的酵母菌株接入麥芽汁液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液離心后棄上清液，采用北京索萊寶科技有限公司的柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書流程進(jìn)行酵母基因組DNA提取。引物序列見表2，PCR反應(yīng)體系（25 μL體系）及反應(yīng)程序［21］：ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板2 μL，Mix 12.5 μL，補(bǔ)充dd H2O至25 μL。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72 ℃繼續(xù)延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物后，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序結(jié)果在NCBI（http：www.ncbi.nlm.nih.gov.blast）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，初步確定分離菌株的分類地位，一般相似率為98%以上，即可認(rèn)為是同一個(gè)物種。選取同源性較高的菌株作為參比對照，采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對后，進(jìn)行1000次的Bootstraps檢驗(yàn)，用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹［22］。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

利用多樣性指數(shù)分析可培養(yǎng)酵母菌的物種多樣性，Sorenson相似性指數(shù)（S）比較樣本間酵母菌種類組成的相似程度。計(jì)算公式為［23］：

Shannon-Wiener指數(shù)（H）：H＝－Σ（PilnPi） （1）

Simpson指數(shù)（D）：D＝1－ΣP（2）

Pielou指數(shù)（J）：J=H/lnS （3）

Sorenson相似性指數(shù)S=2j/（a+b） （4）

式中：Pi為菌種i的個(gè)體在全部個(gè)體中的比例；S為總物種數(shù)。

使用Excel 2016處理數(shù)據(jù)并分析物種多樣性指數(shù)；Origin Pro 2021繪制相對豐度圖及和弦圖；韋恩圖由在線軟件繪制 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。

2結(jié)果與分析

2.1環(huán)境與大曲樣品中酵母菌的多樣性分析

如表3所示，大曲中的可培養(yǎng)酵母菌多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener指數(shù)）、均勻度指數(shù)（Pielou指數(shù)）均小于環(huán)境中，兩者的Simpson指數(shù)相同，相似性（Sorenson相似性指數(shù)）程度略高。由此可知，環(huán)境樣品的酵母菌多樣性較大曲樣品豐富，這為大曲開放式獲取環(huán)境微生物提供了廣泛來源。

2.2環(huán)境和大曲中可培養(yǎng)酵母菌群落數(shù)量及組成

從表4可以看出樣品中酵母數(shù)量為103～105數(shù)量級，總數(shù)上大曲＞環(huán)境。結(jié)合多樣性指數(shù)分析結(jié)果來看，這離不開大曲開放式的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、使用環(huán)境。大曲在堆積儲(chǔ)存過程中，實(shí)則是一個(gè)個(gè)獨(dú)立的固態(tài)發(fā)酵體系，能夠廣泛地自然接種和網(wǎng)羅環(huán)境中的微生物，在曲塊內(nèi)形成豐富的核心菌系。雖然以前有研究認(rèn)為高溫制曲的環(huán)境不利于酵母菌的生長［15］，但是通過在常溫存放的過程中，酵母的休眠體可能復(fù)蘇，同時(shí)環(huán)境中的酵母附著在曲中，因此依然蘊(yùn)含著較多的酵母菌。

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從3個(gè)不同海拔的環(huán)境和大曲樣品中共分離獲得474株酵母菌，其中環(huán)境269株，大曲205株。經(jīng)菌落形態(tài)相似性初篩后，最終選擇106株菌送檢，鑒定為21屬32種（表5），其中環(huán)境28種，大曲18種。共有酵母菌有14種，大曲特有酵母菌有4種，環(huán)境中特有酵母菌14種（圖1）。

Pichia屬酵母菌是環(huán)境和大曲中的優(yōu)勢屬，其中大曲中分離出3種，分別為P.kudriavzevii、P.farinosa和P.exigua；環(huán)境中分離出5種，分別為P.pastoris、P.kudriavzevii、P.farinosa、P.exigua和P.galeiformis。其次占優(yōu)勢的是Candida屬酵母，在大曲中分離出1種，為C.albicans；環(huán)境中分離出3種，分別是C.vartiovaarae、C.solani和C.glabrata。

2.3不同海拔大曲酵母種群多樣性結(jié)構(gòu)

從大曲中共分離出205株、18種酵母菌，在海拔梯度500～600 m均有分離得到，在海拔500 m以下分離出了其中12種，在海拔600 m以上分離出了其中13種。由此可知，在海拔500～600 m之間的大曲中富集了更多的酵母菌群。

從圖2可看出，大曲中的M.guilliermondii、W.anomalus、P.kudriavzevii、S.cerevisiae、S.paradoxus、Z.bailii、T.delbrueckii、T.ciferrii和Z.rouxii在3個(gè)海拔梯度中都有出現(xiàn)，平均相對豐度分別為13%、22%、11%、5%、4%、11%、7%、3%和2%。根據(jù)核心微生物的定義，即在樣本中分布頻率較大的普遍微生物群［24-25］，本研究發(fā)現(xiàn)M.guilliermondii、W.anomalus、P.kudriavzevii和T.delbrueckii是醬香型白酒大曲的核心酵母菌。

2.4不同海拔環(huán)境酵母種群多樣性結(jié)構(gòu)

環(huán)境樣本中的可培養(yǎng)酵母菌共28種269株。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，M.guilliermondii、W.anomalus、C.vartiovaarae、C.glabrata、P.pastoris、P.kudriavzevii、Z.bailii、C.solani、P.farinosa、S.pombe、P.exigua、P.galeiformis和S.podzolica在不同海拔環(huán)境中的分布頻率為100%，平均相對豐度最大的依次為W.anomalus（20%）、M.guilliermondii（15%）、C.vartiovaarae（8%）、P.pastoris（6%），是醬香型白酒環(huán)境的核心酵母菌（圖3）。

2.5不同海拔環(huán)境及大曲中酵母菌種群和弦圖分析由圖4可知，在海拔500 m以下、500～600 m及600 m以上的環(huán)境樣品中分別分離到84株、106株和79株酵母菌。海拔500 m以下的主要優(yōu)勢種為W.anomalus、M.guilliermondii和C.vartiovaarae；500～600 m的優(yōu)勢菌與500 m以下相似；600 m以上的優(yōu)勢種主要為P.kudriavzevii、M.guilliermondii和S.podzolica。M.guilliermondii在各個(gè)海拔梯度的環(huán)境中均廣泛存在。

在3個(gè)海拔的大曲樣品中分別分離到72株、79株和54株酵母菌。海拔500 m以下的主要優(yōu)勢種為W.anomalus、P.kudriavzevii、Z.bailii；500～600 m的優(yōu)勢種主要為W.anomalus和M.guilliermondii；600 m以上的優(yōu)勢種主要為S.cerevisiae、W.anomalus、M.guilliermondii和Z.bailii。W.anomalus在各個(gè)海拔梯度的大曲中均廣泛存在。

2.6不同海拔環(huán)境及大曲酵母菌群落相似性分析

基于Bray-Curtis距離指數(shù)，對3個(gè)不同海拔環(huán)境及大曲酵母菌群落進(jìn)行排序，通過點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離，能夠反映不同海拔之間酵母菌組成的差異。大曲樣本中（圖5-a），第一軸的解釋率為59.1％，第二軸的解釋率為40.9％；環(huán)境樣本中（圖5-b），第一軸的解釋率為56.9％，第二軸的解釋率為43.1％，兩個(gè)樣本的總解釋率均達(dá)到100％?？偟膩碚f，海拔500 m上下的酵母菌群落組成差異較大，海拔500～600 m與600 m以上的酵母菌組成差異相對較小。說明以海拔500 m為界，酵母菌呈明顯的垂直分布特征。海拔越往上，酵母群落間的距離逐漸拉小，群落相似性也越高。

3結(jié)論與討論

本研究的環(huán)境樣品包括釀造空氣沉降灰塵、釀造車間地面灰塵、墻體表面的灰塵、粉塵、車間外地面、溝渠表面土質(zhì)粉塵等，所采集樣品具有充分的代表性，能體現(xiàn)環(huán)境樣品特征性。采用可培養(yǎng)方法分離得到的474株高純度單個(gè)酵母菌株，豐富了醬香型白酒釀造的酵母菌資源，有利于菌種特性的探究和實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用。高溫大曲培養(yǎng)出的酵母菌數(shù)量是環(huán)境的42倍，這得益于釀造過程的開放式，使得環(huán)境中酵母菌不斷向大曲富集［26］。環(huán)境和大曲中的共有種14株，包括W.anomalus、M.guilliermondii、S.cerevisiae等常見的釀酒有益菌株。

Pichia屬是醬香大曲中常見的酵母屬，占酵母菌總數(shù)的絕大部分，可促進(jìn)釀酒過程發(fā)酵和生香［27-28］。本研究從環(huán)境和大曲樣品中共分離出5種Pichia酵母，均在環(huán)境中存在，在大曲中存在3種。有研究者從醬香白酒酒醅中篩選出一株P(guān).kudriavzeviil，發(fā)現(xiàn)它能夠高產(chǎn)乙酸苯乙酯，對白酒有提香提味作用［29］。在大曲和環(huán)境樣品中還分離到4種Candida屬酵母，該屬酵母菌具備較高的乙醇耐受性，使其在釀造過程中能夠持續(xù)貢獻(xiàn)產(chǎn)酯能力［30］。S.cerevisiae和W.anomalus作為環(huán)境和大曲中相對豐度較大的種，具有較好的產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力，在白酒成品曲中也廣泛存在［31］。范光先等［32］從制曲發(fā)酵過程中分離得到微生物有97種，其中酵母18種。整個(gè)制曲發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)的酵母種類主要有P.kudriavzevii、Z.cidrci、Hyphichia burtoniiai等［16］。相關(guān)醬香型白酒的研究表明，雖然酵母的數(shù)量相對于霉菌和細(xì)菌最少，但是酵母的種類和數(shù)量對酒的品質(zhì)影響巨大，其中產(chǎn)酒酵母主要影響著酒質(zhì)和出酒率［33］。產(chǎn)香酵母能夠產(chǎn)生大量的揮發(fā)性香氣化合物，能提高酒體中香味物質(zhì)的含量，賦予酒體獨(dú)特的風(fēng)格［34］。

3個(gè)海拔層面環(huán)境和高溫大曲中可培養(yǎng)酵母多樣性和豐度存在差異，環(huán)境中酵母多樣性和豐度差異明顯，高溫大曲酵母多樣性和豐度差異小。其中W.anomalus在環(huán)境和大曲中均為核心酵母菌。海拔500～600 m的酵母菌種類及豐度最高，這可能是受地勢、地形條件的影響，茅臺(tái)鎮(zhèn)境內(nèi)氣候垂直分異較為明顯，區(qū)域分異較大，各海拔形成了獨(dú)特的小生境，影響著酵母菌群的分布［35］。其次，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該海拔的酒廠較多，長期的釀酒活動(dòng)也使得該海拔積累了豐富的酵母菌群。不同海拔的大曲和環(huán)境樣品可培養(yǎng)酵母菌群結(jié)構(gòu)組成及豐度雖有所不同，但主要優(yōu)勢菌群卻保持一定的相似性和穩(wěn)定性。

通過對海拔間可培養(yǎng)酵母菌種群結(jié)構(gòu)差異性分析，證實(shí)了不同海拔樣品中酵母菌之間存在一定的共性特征，中間海拔作為一個(gè)過渡的海拔梯度，富集了較多來自低海拔和高海拔的酵母菌群。海拔500 m上下的酵母菌呈明顯的垂直分布特征，群落差異較大。海拔越往上，群落相似性越高。本研究對環(huán)境和大曲中的酵母群落垂直分布結(jié)構(gòu)有一個(gè)整體而系統(tǒng)的認(rèn)識，也在一定程度為高溫大曲中酵母屬與海拔的關(guān)系進(jìn)行了探討，為今后更好地認(rèn)識和了解醬香酒品質(zhì)提供科學(xué)參考。

（責(zé)任編輯：胡吉鳳嚴(yán)秀芳）

參考文獻(xiàn)：

[1]貴州省仁懷市地方志編纂委員會(huì).仁懷市志（1978-2005）［M］.北京：方志出版社，2013.

［2］戴奕杰.醬香型白酒釀造過程中微生物群落組成及其與酒品質(zhì)的關(guān)系［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

［3］郭世鑫，姚孟琦，馬文瑞，等.醬香型白酒的研究現(xiàn)狀［J］.中國釀造，2021，40（11）：1-6.

［4］王婧，王曉丹，邱樹毅，等.醬香型白酒釀造體系風(fēng)格特征形成探究［J］.釀酒，2015，42（4）：99-104.

［5］金尚萍，惠明，田青.醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)及影響因素的研究進(jìn)展［J］.發(fā)酵科技通訊，2022，51（3）：164-168，181.

［6］楊國華，邱樹毅，黃永光.醬香白酒生產(chǎn)中產(chǎn)香微生物研究［J］.中國釀造，2011（4）：24-27.

［7］黃永光，諶永前，吳廣黔，等.醬香白酒堆積發(fā)酵過程酒醅中酵母菌的分析研究［J］.釀酒科技，2013（6）：8-13.

［8］戎梓溢，白茹，閆學(xué)嬌，等.醬香型白酒釀造微生態(tài)中酵母菌的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2022，43（13）：180-188.

［9］張亞麗.貴州省仁懷地區(qū)茅臺(tái)空氣微生物的鑒定與分析［D］.北京：北京化工大學(xué)，2014.

［10］王曉丹，陳美竹，邱樹毅，等.茅臺(tái)大曲中酵母的分、鑒定及其功能初探［J］.食品科學(xué)，2017，38（4）：51-57.

［11］李景輝.醬香型白酒生香酵母菌的篩選與應(yīng)用［D］.天津：天津科技大學(xué)，2023.

［12］羅方雯.茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造酵母類資源多樣性特征研究［D］.貴陽：貴州大學(xué)，2021.

［13］陳美竹，邱樹毅，胡寶東，等.醬香型白酒釀造體系中酵母菌研究進(jìn)展［J］.中國釀造，2015，34（6）：5-10.

［14］吳徐建.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中酵母與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2013.

［15］蔣紅軍.茅臺(tái)酒制曲發(fā)酵過程中微生物演替及作用規(guī)律［J］.釀酒科技，2004（3）：39-40.

［16］趙桂琴，琚澤亮，柴繼寬.海拔和品種對燕麥營養(yǎng)品質(zhì)及表面附著微生物的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2022，31（11）：147-157.

［17］Fierer N，Mccain C M，Meir P，et al.Microbes do not follow the elevational diversity patterns of plants and animals［J］.Ecology，2011，92：797-804.

［18］Wang C L，Shi D J，Gong G L.Microorganisms in Daqu：a starter culture of Chinese Maotai-flavor Baijiu［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（10）：2183-2190.

［19］吳成，楊龍飛，胡峰，等.醬香型白酒造沙輪次堆積發(fā)酵微生物及理化指標(biāo)演替規(guī)律［J］.食品科技，2023，48（6）：9-15.

［20］中國科學(xué)院.常見與常用真菌［Ｍ］.北京：科學(xué)出版社，1978.

［21］楊凱環(huán)，相里加雄，曹苗文，等.清香型酒曲中高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的篩選及鑒定［J］.釀酒科技，2023（7）：38-43.

［22］樊建輝，侯建光，郭福祥，等.仰韶陶融型白酒大曲可培養(yǎng)微生物多樣性研究［J］.中國釀造，2017，36（7）：71-75.

［23］唐雪婭，徐明，聶坤，等.黔中地區(qū)不同馬尾松群叢植物群落多樣性特征研究［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2023，42（4）：26-32.

［24］楊第芹.醬香酒醅和大曲中耐高溫產(chǎn)酯酵母的篩選及其生產(chǎn)丟糟酒的研究［D］.貴陽：貴州大學(xué)，2023.

［25］宋哲瑋.醬香型白酒核心釀造菌群及群體代謝機(jī)制的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2022.

［26］羅方雯，黃永光，涂華彬.茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒不同釀造區(qū)域可培養(yǎng)酵母種群結(jié)構(gòu)多樣性分析［J］.食品科學(xué)，2020，41（12）：143-149.

［27］黃武，王曉丹，邱樹毅，等.醬香型酒糟發(fā)酵前后品質(zhì)和揮發(fā)性成分初步分析［J］.中國釀造，2021，40（2）：97-101.

［28］Chu Y，Li M，Jin J，et al.Advances in the application of the non-conventional yeast Pichia kudriavzevii in food and biotechnology industries［J］.Journal of Fungi，2023，9（2）：170.

［29］Rosanna T，Clemencia C L，F(xiàn)ederico D F，et al.Molecular identification and osmotolerant profile of wine yeasts that ferment a high sugar grape must［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，130（3）：179-187.

［30］侯建光，郭富祥，樊建輝，等.響應(yīng)面法優(yōu)化陶香型窖池中異常威克漢姆酵母發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件［J］.釀酒科技，2016（10）：77-81.

［31］Chen L，Li D，Ren L，et al.Effects of simultaneous and sequential cofermentation of Wickerhamomyces anomalus and Saccharomyces cerevisiae on physicochemical and flavor properties of rice wine［J］.Food Science & Nutrition，2020，9（1）：71-86.

［32］范光先，王和玉，崔同弼，等.茅臺(tái)酒生產(chǎn)過程中的微生物研究進(jìn)展［J］.釀酒科技，2006（10）：75-77.

［33］郝飛，呂錫斌，吳耀領(lǐng)，等.醬香型白酒釀造酒醅中酵母菌多樣性研究［J］.菌物學(xué)報(bào)，2019，38（5）：620-630.

［34］楊玉蓉，鐘海雁，徐帥哲，等.產(chǎn)香酵母的分離鑒定及對不同原料釀造甜酒香氣成分的影響［J］.中國釀造，2021，40（7）：77-82.

［35］宗加權(quán).茅臺(tái)酒產(chǎn)地氣候特征及氣候變化趨勢分析［D］.南京：南京信息工程大學(xué)，2022.

Population Structure and Diversity of Culturable Yeast in Maotai Liquor at Different Altitudes in Maotai Town

Wang Xing Qiao Lu Zhou Yeming Dong Chunbo Han Yanfeng Zou Xiao

（1.Forestry Bureau of Renhuai，Renhuai 564500，Guizhou，China；2.Institute of Fungus Resources/College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou，China）

Abstract：This paper explored the species diversity of culturable yeast in high-temperature Daqu and environmental samples，as well as the population structure and relative abundance at different altitudes，taking Maotai Town，Renhuai City，the core production area of Chinese Maotai-flavor liquor，as the research area.The results showed that 474 strains of yeast were finally isolated from high-temperature Daqu and environmental samples，and identified as 32 species in 21 genera.Among them，a total of 269 strains of yeast were isolated from environmental samples and identified as 28 species in 19 genera.A total of 205 strains of yeast were isolated from Daqu and identified as 18 species in 15 genera.Wickerhamomyces anomalus acts as a core yeast both in the environment and in Daqu.The diversity index of yeast isolated in the environment was higher than that of high-temperature Daqu.At different altitude gradients，the diversity and abundance of yeast in environmental samples were significantly different，while the differences in high temperature Daqu were less，and the main dominant yeast populations maintained a certain degree of similarity and stability.In general，the yeast community structure above 500 m was relatively similar，and the relative abundance and diversity of yeast community at 500～600 m were the highest，and both of them above 600 m were lower than those below 500 m.

Keywords：brewing environment; Daqu; culturable method；different altitudes；yeast community diversity