表面等離子體共振技術(shù)及其在蛋白質(zhì)活性濃度絕對定量中的應(yīng)用

羅世聞, 武利慶, 楊 彬, 劉亞輝

(中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

1 引 言

蛋白質(zhì)是生物體中廣泛存在的一類生物大分子,它是由核酸編碼的α氨基酸通過α氨基和α羧基形成肽鍵,并連接成肽鏈,再經(jīng)翻譯后加工生成了具有特定立體結(jié)構(gòu)和活性的大分子[1]。生物體中的蛋白質(zhì)通過與其他分子的相互作用表現(xiàn)出其活性,并在細(xì)胞中發(fā)揮著催化、免疫、傳導(dǎo)、調(diào)控等重要功能[2]。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機物,是生命活動的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾,即使具有相同的一級結(jié)構(gòu),也會因不同的折疊形成的高級結(jié)構(gòu)以及翻譯后修飾的不同而導(dǎo)致活性的不同。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮往往僅依賴其具有活性的部分,因此,正確測定蛋白質(zhì)的活性濃度對于更好地了解與評價蛋白質(zhì)功能,提升和控制蛋白類生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)的量顯得尤為重要[3]。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析技術(shù),如凱氏定氮法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、考馬斯亮藍(lán)染色法[4]等,都依據(jù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進行定量,測定出的蛋白質(zhì)濃度是蛋白質(zhì)的理化濃度而不是活性濃度。即使目前發(fā)展起來的蛋白質(zhì)定量潛在計量基準(zhǔn)方法,如同位素稀釋質(zhì)譜法、定量核磁法、高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用法、電噴霧-差分電遷移-顆粒計數(shù)法[5,6]等,也是依據(jù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進行定量。這種方法雖然可以準(zhǔn)確測定出蛋白質(zhì)的理化濃度,但是該濃度與廣為關(guān)注的蛋白質(zhì)活性濃度之間沒有必然的關(guān)系。

蛋白質(zhì)作為一類復(fù)雜的生物大分子,多肽鏈在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上可進一步盤旋折疊并與其他蛋白質(zhì)亞基結(jié)合,從而形成不同的二級、三級或四級結(jié)構(gòu),同時經(jīng)過翻譯后修飾的加工才具有最終的生理功能。具有正確高級結(jié)構(gòu)以及翻譯后修飾的蛋白質(zhì)只是存在相同氨基酸序列,是蛋白質(zhì)中的一部分,但只有這部分蛋白質(zhì)才具有生理活性,因此需對這部分活性蛋白濃度的測定更為關(guān)注。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、數(shù)字酶聯(lián)免疫吸附法[7]等各種免疫分析方法,雖然通過抗原與抗體之間的相互作用可以反映出部分蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與翻譯后修飾等對蛋白質(zhì)濃度測量的影響,但是這類方法一般都是相對測定法。需通過活性蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線才能對樣品中的蛋白進行活性測定。然而目前還未研制出蛋白質(zhì)活性濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),從而使得通過免疫分析測定蛋白質(zhì)活性濃度的方案也不可行。

迫于蛋白質(zhì)功能評價表征以及蛋白制品活性指標(biāo)質(zhì)量控制對蛋白質(zhì)活性濃度測量和計量的需求,近年來研究人員提出并逐步發(fā)展了基于表面等離子體共振光譜(surface plasmon resonance,SPR)的無校準(zhǔn)濃度分析技術(shù)(calibration free concentration analysis,CFCA)[8,9],成功實現(xiàn)了在無需標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,對蛋白質(zhì)活性濃度的絕對測定,并逐步在蛋白質(zhì)純化、疫苗開發(fā)、臨床檢驗、蛋白類生物制品質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制等眾多領(lǐng)域進行應(yīng)用。該技術(shù)已經(jīng)引起國際國內(nèi)計量界的廣泛關(guān)注,CFCA有望成為蛋白質(zhì)活性濃度計量的基準(zhǔn)方法。故此,本文對該技術(shù)的測量原理、應(yīng)用領(lǐng)域、存在不足以及未來可能地發(fā)展方向等進行了綜述和展望。

2 表面等離子體共振技術(shù)的基本原理

表面等離子體共振的概念早已出現(xiàn)[10],是一種由隱失波引發(fā)金屬表面疏密電子振蕩的物理學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)光從光密介質(zhì)進入光疏介質(zhì)時會產(chǎn)生一束反射光和一束折射光,折射光的角度與兩種介質(zhì)的折射率有關(guān),且符合菲涅爾公式:

n1sinθ1=n2sinθ2

(1)

當(dāng)入射角增大到臨界點時,折射光將徹底消失,只存在反射光,這一現(xiàn)象被稱為全反射[11]。在這一過程中入射光并不是在剛接觸界面時產(chǎn)生反射光,而是先進入光疏介質(zhì)沿著界面流過波長量級再返回光密介質(zhì),其中經(jīng)過光疏介質(zhì)的光稱為消逝波[12]。這時如果介質(zhì)中存在一層具有等離子波的金屬膜,2種波相遇可能發(fā)生共振,導(dǎo)致入射光的部分能量轉(zhuǎn)移到表面等離子波中,使得反射光的強度大幅度減弱。使反射光完全消失的入射角就被稱為SPR角。SPR角通常與金屬表面折射率相關(guān),而金屬表面折射率又和其表面捕獲的分子質(zhì)量成正比,所以通過檢測SPR角的改變可以獲得分子間相互作用的信息[13,14]。

從1902年首次觀察到表面等離子體共振現(xiàn)象到1983年首次引入氣體傳感和生物傳感器,SPR技術(shù)在納米技術(shù),光學(xué)技術(shù),流體技術(shù)和光源技術(shù)的支持下得到了迅速發(fā)展[15]。近幾十年來,表面等離子體共振技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物研發(fā)、材料開發(fā)等方面被廣泛應(yīng)用,覆蓋了醫(yī)藥、環(huán)境、生物和材料等多個領(lǐng)域[16,17]。SPR技術(shù)具有樣本需求量小、檢測速度快、耗材成本低和操作簡單等優(yōu)點[18],無需對生物分子進行熒光或放射性標(biāo)記就可以直接測量分子間相互作用的親和力及動力學(xué)常數(shù)[19],可應(yīng)用于各類分子間相互作用的實時動態(tài)監(jiān)測[20],如抗體-抗原、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、酶-底物、蛋白質(zhì)-DNA、受體-藥物、蛋白質(zhì)-多糖、蛋白質(zhì)-病毒[21,22]等。

3 蛋白質(zhì)活性濃度測量原理

基于SPR的蛋白質(zhì)活性濃度絕對測量技術(shù),即無校準(zhǔn)濃度分析技術(shù)(calibration free concentration analysis,CFCA)的概念最早于1993年提出,隨后被逐步完善和發(fā)展。使用CFCA時,需將分析物在層流條件下注入傳感器表面,傳感器的表面上要固定有分析物的受體或抗體。溶液中分析物首先通過擴散來到傳感器的表面,隨后表面附近分析物中具有的活性分子將與固定在傳感器表面的受體或抗體結(jié)合,從而引起傳感器表面質(zhì)量變化,而這種變化將引起SPR產(chǎn)生響應(yīng),整個過程如圖1所示。

當(dāng)分析物在層流條件下注入傳感器表面且傳感器表面偶聯(lián)的受體或抗體足夠多、分子之間的結(jié)合反應(yīng)足夠快的時候,整體的擴散與結(jié)合反應(yīng)速率就僅受到分析物擴散速率的影響,即處于傳質(zhì)限制(mass transferlimited,MTL)條件下,此時溶液中的分析物與傳感器表面的分析物濃度之間存在下式中的化學(xué)平衡。

(2)

式中:Abulk代表溶液中分析物的濃度,g/L;Asurface代表傳感器表面分析物的濃度,g/L。根據(jù)質(zhì)量作用定律,可以寫下式:

(3)

(4)

式中:D代表分析物的擴散系數(shù),m2/s;f代表流動池中溶液的流速,m3/s;H、w和l分別流動池的幾何尺寸即高度、寬度和長度,m。擴散系數(shù)D取決于分析物的分子量和粘度等常數(shù)[23],如下所示:

(5)

式中:M代表分析物的分子量,Da;ηrel代表溶劑的相對粘度(20 ℃下)。

4 蛋白質(zhì)活性濃度測量的應(yīng)用

4.1 在蛋白質(zhì)活性計量中的應(yīng)用

Su[24]等建立了測定轉(zhuǎn)基因蛋白G2-EPSPS活性濃度的CFCA方法,研究發(fā)現(xiàn)該方法日內(nèi)精密度為3.26%～4.59%,日間精密度為8.36%。在1.5～8 nmol/L 的濃度范圍內(nèi),該方法的回收率為97.46%～104.34%。通過與同位素稀釋質(zhì)譜測定的理化濃度進行比較,發(fā)現(xiàn)G2-EPSPS的比活性僅為0.18,證明針對選擇的抗體,大部分蛋白沒有活性,同時反映出如果采用理化濃度替代活性濃度計算親和常數(shù)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)的活性進行質(zhì)控,將引起較大的誤差。

Hu[25]等以人肌紅蛋白為研究對象,進一步采用3種經(jīng)過篩選的不同單克隆抗體建立CFCA方法對肌紅蛋白的活性濃度進行測定,結(jié)果分別為2.985、2.912和3.032 mg/mL,不僅不同抗體獲得的活性濃度結(jié)果一致,而且與通過同位素稀釋質(zhì)譜法測得的理化濃度2.851 mg/mL接近,比活性為 1.02～1.06,證明所用蛋白活性良好。Hu認(rèn)為該方法可能成為蛋白質(zhì)活性濃度測定的基準(zhǔn)方法并用于蛋白質(zhì)活性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

Ludmilla[26]等使用Biacore 2000設(shè)備和胺偶聯(lián)試劑盒測定了重組RVG的活性濃度。通過將p75NTR中可溶解的伯胺基團與CM5傳感器芯片的羧甲基化葡聚糖基質(zhì)共價連接得到共振單元,然后將稀釋液以7種不同流速在CM5(p75)表面上流動 5 min 并與空白CM5芯片進行對照,最后使用BIA-CONC程序分析初始結(jié)合率以測定重組RVG的活性濃度。

4.2 在蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用

雖然目前還沒有直接采用CFCA方法研制蛋白質(zhì)活性濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的例子,但是中國計量科學(xué)研究院的Wu[27]等研究發(fā)現(xiàn),CFCA的蛋白質(zhì)活性濃度測定技術(shù)可用到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性評價中。Wu等分別采用CFCA和同位素稀釋質(zhì)譜測定候選蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的活性濃度與理化濃度,當(dāng)活性濃度與理化濃度在不確定度范圍內(nèi)相等時,說明2種方法識別的被測量一致,因此用同位素稀釋質(zhì)譜方法定值的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將在免疫學(xué)方法中具有良好的互換性,且相關(guān)的研究工作和技術(shù)已經(jīng)獲得專利授權(quán)[27]。

4.3 在臨床檢驗中的應(yīng)用

Grover[28]等使用CFCA方法直接測定患有不同傳染病和非傳染病患者血清樣品中的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物豐度。對近100個血清樣品中β2-微球蛋白(β2M)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)的濃度進行測定,發(fā)現(xiàn)CFCA都具有很好的重復(fù)性、準(zhǔn)確性和靈敏度。在血清稀釋度為1 000的檢測中可測到低至 13 ng/mL 的β2M,說明該方法可用于檢測體液中的低豐度蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。應(yīng)用CFCA方法,患病受試者的血清SAA與健康組相比,豐度存在顯著差異,這與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。該研究使得CFCA在快速監(jiān)測血清樣品中的多種蛋白質(zhì)標(biāo)志物方面邁出了重要一步。

Ray[29]等通過使用Biacore T200系統(tǒng)的CFCA方法對SAA進行定量,將每個血清樣品連續(xù)稀釋至1/100和1/200進行濃度分析,并在25 ℃下以 5 μL/min和100 μL/min的流速通過活性和參考流動池,然后使用Biacore T200系統(tǒng)的軟件分析結(jié)合率數(shù)據(jù)從而確定SAA濃度,最終實驗結(jié)果結(jié)果表明SAA的血清豐度隨感染的嚴(yán)重程度依次增加。

Aniol-Nielsen[30]等提出了一種用于抗藥抗體(ADA)定量的CFCA方法,該方法是一種用于確定藥物特異性抗體比例的方法,它允許在基于流動的系統(tǒng)中直接確定由配體定義的活性抗體濃度。在研究中,他們使用針對內(nèi)源性人胰島素、德谷胰島素和凝血因子的多克隆陽性對照抗體進行開發(fā)和驗證,發(fā)現(xiàn)CFCA的方法可以精準(zhǔn)地測量出藥物特異性抗體的濃度,精密度為±10%,與單抗陽性對照抗體的預(yù)期值回收率為90%～112%。

4.4 在蛋白類生物制品研發(fā)與質(zhì)控中的應(yīng)用

Karlsson[31]等將CFCA技術(shù)應(yīng)用于溫度應(yīng)激TNF-α抗體的質(zhì)量控制中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過CFCA測定的活性濃度與抗體效價之間存在良好的相關(guān)性,Karlsson認(rèn)為基于SPR的劑量響應(yīng)曲線、傳感圖的比較和CFCA技術(shù)的組合可以增強抗體相對效價評估的可信度,并表明SPR技術(shù)可用于生物藥物質(zhì)量控制中并替代效價測定。

Pol[8]等采用CFCA方法測定了貝伐單抗、利妥昔單抗、干擾素a-2a等活性濃度,在優(yōu)化的實驗條件下,CFCA方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。在干擾素α-2a純化制備過程中,通過CFCA測定樣品和參考物質(zhì)的活性濃度計算相對效價對產(chǎn)品進行評價和質(zhì)量控制,發(fā)現(xiàn)比CFCA測定單一活性濃度的方法更加可靠。

4.5 在基礎(chǔ)科研中的應(yīng)用

Pol[9]等通過使用Biacore X100進行實時分析,探索了牛半胱氨酸蛋白酶抑制劑胱抑素B與木瓜蛋白酶的催化失活形式之間的相互作用。他們使用CFCA的方法確定了每個半胱氨酸蛋白酶抑制劑B變體特異性結(jié)合濃度,并將獲得的值與A(280 nm)確定的總蛋白濃度進行比較。結(jié)果說明在結(jié)構(gòu)功能的研究中使用CFCA的方法有助于獲得可靠的結(jié)果以及正確解釋相互作用機理。

Stefan[32]等在研究YpdB基因如何啟動脈沖基因表達(dá)時,使用SPR技術(shù)分析測量了原生型YpdB和磷酸化變體型YpdB-D53E與yhjX啟動子區(qū)的結(jié)合動力學(xué)。通過使用CFCA的方法在2種不同的流速下測量蛋白質(zhì)的初始結(jié)合速率,然后通過Biacore系統(tǒng)的擴散常數(shù)計算程序算出YpdB-D53E的擴散系數(shù),從而得到Y(jié)pdB-D53E的活性濃度,最后后將所得活性蛋白濃度用于計算動力學(xué)結(jié)合常數(shù),獲得了更加準(zhǔn)確的值。

Yasmina[33]等在研究FcRn/Fc相互作用的過程中,使用了Biacore公司的SPR生物傳感器進行了CFCA分析,在傳質(zhì)限制條件下對每種分析物的活性濃度進行了測定。測試數(shù)據(jù)顯示,FcRn/IgG的相互作用可以在相反的檢測方向上進行研究,這樣可以最大限度地減少表面?zhèn)斡?并得到與溶液測量接近的親和力常數(shù)。

5 蛋白質(zhì)活性濃度測量的不足

目前相對較為成熟的蛋白質(zhì)活性濃度測定方法均是基于SPR的CFCA方法。雖然該方法在蛋白質(zhì)計量、臨床檢驗、蛋白類生物制品質(zhì)量控制等領(lǐng)域逐漸被應(yīng)用,并且可以不依賴標(biāo)準(zhǔn)用于絕對活性濃度測定,但通常可能會產(chǎn)生15%～30%的誤差。受限于該方法的測量原理,目前還存在以下不足與亟待解決的問題。

1) 該方法要求在傳質(zhì)限制(MTL)條件下進行,因此要求芯片表面具有較高的受體或抗體偶聯(lián)密度,同時蛋白質(zhì)與抗體或受體結(jié)合的反應(yīng)速率要足夠快,但是這些要求不是每個研究體系都能符合,如果不能滿足測量原理的要求,則不能通過這種方式測定蛋白質(zhì)活性濃度。一般來說,只有當(dāng)目標(biāo)蛋白的分子量大于5 000時,才能獲得比較好的分析效果。雖然后續(xù)有研究工作將該方法擴展到在部分傳質(zhì)限制條件下的活性濃度測定,并給出了描述生物分子復(fù)合物形成的微分方程的解析,但是模型的準(zhǔn)確性有待更多實驗數(shù)據(jù)的驗證。

2) 計算模型中的流通池幾何尺寸、分析擴散系數(shù)、流速、1 RU對應(yīng)的單位面積質(zhì)量等若干常數(shù)或參數(shù)均為經(jīng)驗估算值或系統(tǒng)平均值,用于特定體系的計算可能會產(chǎn)生一定的誤差。當(dāng)SPR信號從傳感器表面呈指數(shù)衰減傳導(dǎo)時,遠(yuǎn)離傳感器表面的分子比靠近傳感器表面的分子其單位質(zhì)量響應(yīng)低也會造成轉(zhuǎn)換系數(shù)的誤差。

3) CFCA計算模型通常采用1:1模型進行計算,如果分析物具有多個相同的結(jié)合位點,則不能直接確定單個結(jié)合位點的活性濃度。

6 展望與總結(jié)

隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,尤其是蛋白質(zhì)藥物等蛋白類生物制品的不斷上市,對蛋白質(zhì)活性濃度準(zhǔn)確可比測量的需求也不斷攀升,解決蛋白質(zhì)活性濃度計量問題、建立蛋白質(zhì)活性濃度量值溯源傳遞體系變得尤為迫切。國際計量局物質(zhì)的量咨詢委員會(CCQM)蛋白質(zhì)分析工作組于2018年專門成立了蛋白質(zhì)活性焦點工作組,專門研究蛋白質(zhì)活性的測量與量值溯源問題,本課題組有成員擔(dān)任了該工作組的召集人。2019年CCQM成立25周年紀(jì)念大會上,專門邀請中國計量科學(xué)研究院的專家介紹了基于SPR的蛋白質(zhì)活性濃度計量研究成果。2021開始國家科技部的質(zhì)量基礎(chǔ)(NQI)重點研發(fā)計劃等項目指南中,也對蛋白質(zhì)活性濃度計量技術(shù)研究提供經(jīng)費支持。蛋白質(zhì)活性濃度計量研究在我國已經(jīng)全面鋪開。未來一段時間,CFCA方法憑借不依賴標(biāo)準(zhǔn)品直接測定出蛋白質(zhì)活性濃度的優(yōu)點,依然是蛋白質(zhì)活性濃度計量方法研究的重點。CFCA方法將進一步朝著提高方法準(zhǔn)確度和擴大適用范圍的方向發(fā)展。例如,通過改善部分傳質(zhì)限制條件下傳質(zhì)參數(shù)和數(shù)學(xué)模型的準(zhǔn)確度提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確度;通過儀器參數(shù)的校準(zhǔn)和有關(guān)常數(shù)的準(zhǔn)確測定提高準(zhǔn)確度,及不同儀器間的可比性;通過采用捕獲模式等實驗設(shè)計,解決無法通過共價固定在傳感器芯片上的配體進行活性濃度測定的問題[34]。總之,相信不久的將來,基于SPR的CFCA方法將在蛋白質(zhì)活性濃度計量與蛋白質(zhì)活性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中發(fā)揮巨大的作用[35]。