線粒體自噬探討5-Fu 心肌毒性及黃芪甲苷的干預(yù)機制

周湘忠 楊書鳳 李玉捷 陳立軍 魏剛

自噬是一種以包裹降解物形成自噬體輸送到溶酶體進行消化的細胞內(nèi)降解過程，起到細胞器更新、滿足代謝需求以及保持細胞穩(wěn)定的作用［1］。線粒體是細胞內(nèi)氧化磷酸化的主要場所，可生成腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），參與細胞增殖、衰老、穩(wěn)態(tài)及凋亡等過程［2］。當機體處于缺血缺氧、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等情況時，線粒體自噬則會被啟動。5-氟尿嘧啶（5-fluorouocil，5-Fu）為抗代謝類化療藥物，其多應(yīng)用治療消化道腫瘤，特別是對只能進行藥物化療的老年患者具有重要治療意義。有研究指出［3］5-Fu 體內(nèi)的代謝產(chǎn)物F-cltrate 可應(yīng)用于線粒體阻斷三羧酸循環(huán)，降低ATP 的生成，使得線粒體膜通透性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致線粒體功能異常。黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是黃芪的主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明［4］AS-Ⅳ通過保護線粒體、抑制凋亡、減輕鈣超載、保持內(nèi)皮細胞自穩(wěn)態(tài)、良好的抗脂質(zhì)過氧化及清除氧自由基等途徑參與心肌細胞的保護。但目前有關(guān)線粒體自噬途徑的干預(yù)機制鮮少見研究報道。本研究從線粒體自噬角度探討AS-Ⅳ對5-Fu 誘導(dǎo)心肌毒性的干預(yù)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥物與儀器

氟尿嘧啶注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；AS-Ⅳ（Med Chem Express，純度為98.0%）；兔源LC3Ⅱ一抗（美國Proteintech Group 公司）；Beclin1、Parkin、PINK1、LAMP 一抗（沈陽萬類生物有限公司）；LC3 一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG（美國Cell Signaling Technology公司）；美國Sigma-Aldrich Chemical Company］；TUNEL 原位細胞凋亡檢測試劑盒（美國ROCHE）；線粒體ATP 及膜電位檢測試劑盒（上海碧云天有限公司）；細胞計數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8，同仁化學(xué)研究所）；多功能酶標儀（美國Bio-Rad 公司），光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），透射電鏡（日本日立公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗細胞、培養(yǎng)

選8 周齡雄性SD 大鼠（200±20 g）20 只，由北京維通利華實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0006。通過腹膜內(nèi)注射氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，無菌條件下取出心室肌組織，用冷PBS灌注3 min 后切成小塊。采用0.25%胰酶溶液反復(fù)消化小塊，并應(yīng)用10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，隨后將細胞懸浮液過濾離心1 min。將獲得的心肌細胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)，細胞板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，當細胞生長、融合至≥80%時，采用0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞開展后續(xù)研究。

1.3 細胞分組

將細胞分成5 組：A 組、B 組、C 組、D 組、E 組。其中，除A 組外其余四組均加入80 μL 5-Fu溶液構(gòu)建5-Fu 心肌毒性模型，C 組、D 組、E 組均加入40 μmol/L AS-Ⅳ，另D 組、E 組分別加入線粒體自噬抑制劑1 μmol/L Mdivi-1 及激動劑0.1 μmol/L RAPA 進行處理。最后所有組均加入等量體積DMEM 和20%生理鹽水進行培養(yǎng)。

1.4 CCK-8 檢測細胞活力

采用細胞計數(shù)儀計數(shù)所制備細胞懸液中的細胞數(shù)目，接種于96 孔板，每孔100 μL，使每孔細胞數(shù)目至1×105個后，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。各組按分組干預(yù)后，斜貼孔壁每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，采用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度，評估細胞活力。

1.5 TUNEL 染色檢測心肌細胞凋亡情況

細胞經(jīng)爬片處理后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗2 遍，爬片經(jīng)固定、破膜、通透后，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，室溫孵育10 min 進行平衡處理，將配制好的TdT 孵育緩沖液37℃避光孵育1 h，利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚進行核染色，加抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況。

1.6 線粒體ATP 檢測心肌線粒體功能損傷情況

采用1.5 mL 離心管收集細胞，每管加入100 μL 熱蒸餾水，在95℃熱水浴中超聲震碎。細胞懸液置于沸水浴10 min，取出渦旋混勻30 s。4℃下1 500 r/min 離心5 min，取上清液，按照線粒體ATP試劑盒說明書檢測各組ATP 含量。

1.7 膜電位觀察線粒體功能改變

利用陽離子熒光染料JC-1 進行線粒體膜電位檢測，將細胞接種于24 孔板，細胞處理后，將細胞與JC-1 工作液在37℃避光孵育30 min，隨后PBS洗2 次，熒光顯微鏡觀察紅色及綠色熒光，如膜電位較高時為紅色，而膜電位降低為綠色，紅綠熒光比值反映膜電位情況。

1.8 LC3Ⅱ免疫熒光染色檢測線粒體自噬活性

各組按分組干預(yù)后，給予細胞固定、通透、封閉、一抗孵育、FITC 標記熒光二抗孵育、DAPI 染核后，于顯微鏡上觀察。采用Image J軟件進行陽性標記計數(shù)。

1.9 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction technology，RT-PCR）檢測PINK1/Parkin 基因變化

使用1.5 mL 離心管收集細胞，每管加入1 mL Trizol 裂解液，提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA。將合成的cDNA 加入引物建立擴增體系，按RT-PCR 試劑盒說明書進行擴增，擴增條件：95℃，15 s，60℃，60 s，72℃，40 s，進 行35 個循環(huán)。采 用2-ΔΔCt方法處 理數(shù)據(jù)，并以GAPDH 作為內(nèi)參計算各組PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、LC3 mRNA 水平。

1.10 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測PINK1/Parkin 通路蛋白表達

使用1.5 mL 離心管收集心肌細胞，每管加入RIPA 裂解液提取總蛋白。使用BCA 法定量、SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜，4℃過夜孵育PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、COX-Ⅳ抗體（稀釋度均為1∶500）及LC3 抗體（稀釋度為1∶1 000），次日洗膜后以辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體（稀釋度為1∶1 000）繼續(xù)孵育90 min。掃描膠片，采用Image J 軟件進行相對定量分析，各目的蛋白以COX-Ⅳ（內(nèi)參蛋白）校正。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞功能改變情況

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，細胞存活率比較，A 組＞D 組＞C 組＞E 組＞B 組（P＜0.05）；TUNEL 染色檢測結(jié)果顯示，細胞凋亡率比較，E 組＞B 組＞C 組＞D 組＞A 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心肌細胞功能改變情況（）Table 1 Changes of cardiomyocyte function in each group（）

表1 各組心肌細胞功能改變情況（）Table 1 Changes of cardiomyocyte function in each group（）

2.2 各組線粒體功能改變情況

各組ATP 含量、膜電位比較，A 組＞D 組＞C 組＞B 組＞E 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組線粒體功能改變情況（）Table 2 Changes of mitochondrial function in each group（）

表2 各組線粒體功能改變情況（）Table 2 Changes of mitochondrial function in each group（）

2.3 各組細胞LC3Ⅱ表達水平比較

各組LC3Ⅱ表達水平比較，E 組＞B 組＞C 組＞D組＞A 組（F=38.130，P＜0.05）。圖1。

圖1 各組心肌細胞LC3Ⅱ表達水平Fig. 1 LC3Ⅱexpression level of cardiomyocytes in each group

2.4 各組細胞PINK1/Parkin 通路相關(guān)mRNA 表達水平

各組Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP及LC3Ⅱ/ⅠmRNA 相對表達量比較，E 組＞B 組＞C 組＞D 組＞A組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞PINK1/Parkin 通路相關(guān)mRNA 表達水平（）Table 3 mRNA expression levels related to PINK1/Parkin pathway in cells of each group（）

表3 各組細胞PINK1/Parkin 通路相關(guān)mRNA 表達水平（）Table 3 mRNA expression levels related to PINK1/Parkin pathway in cells of each group（）

2.5 各組PINK1/Parkin 通路相關(guān)蛋白表達比較

各 組Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP 及LC3Ⅱ/ⅠmRNA 相對表達量比較，E 組＞B 組＞C 組＞D組＞A 組（F=16.824、8.167、23.291、14.622、6.571，P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組PINK1/Parkin 通路相關(guān)蛋白表達Fig. 2 Expression of PINK1/Parkin pathway-related proteins in each group

3 討論

心臟損傷是化療藥物的嚴重副作用之一，因此明確化療藥物心臟毒性的發(fā)生機制，對于降低化療藥物的不良影響以及治療效果的改善具有重要意義。5-FU 已廣泛應(yīng)用于癌癥治療，但5-FU 所導(dǎo)致的心肌毒性發(fā)生率較高，可達20%～100%。本研究結(jié)果顯示，與A 組相比，B 組的細胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均降低，凋亡率、LC3Ⅱ水平均升高，提示5-FU 可誘導(dǎo)心肌線粒體損傷，與既往研究［5］相符。5-Fu 導(dǎo)致的心肌毒性發(fā)病機制是多方面的，而線粒體損傷是一種機制假說，線粒體損傷會積累有缺陷的細胞器，導(dǎo)致線粒體自噬被啟動［6］。自噬的激活通常被認為具有心臟保護性，但過度自噬會造成心肌損傷以及細胞凋亡［7］。黃芪具有益衛(wèi)固表、補氣健脾作用，其在臨床已被應(yīng)用于高齡、慢性疾病以及術(shù)后放化療等患者［8］。AS-Ⅳ是黃芪的主要成分之一，研究表明［8］AS-Ⅳ通過激活一氧化氮合成酶產(chǎn)生一氧化氮，從而激活cGMP/PKG 信號通路，進一步使糖原合成酶激酶-3 失活，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，發(fā)揮心肌線粒體保護作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)AS-Ⅳ干預(yù)后，心肌細胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均高于B 組，凋亡率、LC3Ⅱ水平均低于B 組，提示AS-Ⅳ可減輕5-Fu 誘導(dǎo)的心肌線粒體損傷，與前期動物實驗研究一致。因線粒體自噬抑制劑Mdivi-1與AS-Ⅳ作用類似，而線粒體自噬激動劑RAPA 增強了自噬的作用。本研究結(jié)果顯示，與B 組相比，D 組的細胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均更高，凋亡率、LC3Ⅱ水平均更低，與AS-Ⅳ干預(yù)結(jié)果相似；而與C 組相比，E 組的細胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均降低，凋亡率、LC3Ⅱ水平均升高，表明過度的自噬會造成心肌損傷以及細胞凋亡。

PINK1/Parkin 信號通路與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。既往研究表示［10-11］抑制線粒體自噬后可明顯減少升主動脈縮窄引起的心肌纖維化。本研究結(jié)果顯示，E 組的PINK1/Parkin 信號通路相關(guān)蛋白及基因表達升高，表明線粒體自噬參與了5-Fu 誘導(dǎo)的心肌毒性，而且線粒體可呈現(xiàn)自噬過度狀態(tài)。當自噬激活時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇共價結(jié)合后形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜，故LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬水平［12］。再灌注階段自噬的激活與Beclin1 密切相關(guān)，Beclin1的表達受活性氧的誘導(dǎo)及抗凋亡蛋白Bcl-2 的負性調(diào)節(jié)，活性氧的積累會磷酸化Bcl-2 導(dǎo)致其從Bcelin1 復(fù)合體上分離出來，進一步激活自噬，故再灌注階段自噬的激活會導(dǎo)致細胞損傷及凋亡的增高［13］。正常情況下的PINK1 表達極低，當線粒體損傷時會阻礙PINK1 進入線粒體內(nèi)的過程，使其積累在線粒體外膜TOM 復(fù)合物上，PINK1 的積累可造成引起泛素和Mfn2 磷酸化，并隨后募集E3 連接酶Parkin。Parkin 磷酸化可激活周圍泛素化的蛋白，通過與LC3 特異性結(jié)合，最終激活PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬［14］。此外，LAMP為溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合狀態(tài)［15］。本研究結(jié)果顯示，AS-Ⅳ干預(yù)后，Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP 及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白及基因表達均降低，證實AS-Ⅳ可通過抑制線粒體自噬PINK1/Parkin 通路過度激活，維持自噬穩(wěn)定狀態(tài)，進而對心肌線粒體數(shù)量與質(zhì)量的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到維持作用。

綜上，AS-Ⅳ可能通過抑制線粒體自噬PINK1/Parkin 通路過度激活，減輕5-Fu 誘導(dǎo)的心肌線粒體損傷，為AS-Ⅳ治療心肌損傷提供理論依據(jù)。