天然綠色蠶絲抗氧化組分向皮膚遷移的特性研究

譚 婷, 李哲陽(yáng), 馬明波, 周文龍

(浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國(guó)際絲綢學(xué)院), 浙江 杭州 310018)

我國(guó)有著豐富的天然彩色蠶絲資源,野蠶如天蠶、樟蠶、琥珀蠶等均可吐出顏色鮮艷的彩色絲,但由于養(yǎng)殖條件苛刻、產(chǎn)量低等原因,這些天然彩色蠶絲并未得到有效利用。少數(shù)家蠶種也攜帶有相關(guān)基因,能吐出金黃、黃、粉、綠等顏色的絲[1-2]。目前,浙江大學(xué)、蘇州大學(xué)及西南大學(xué)等機(jī)構(gòu)已培育出多個(gè)性狀穩(wěn)定、覆蓋主要色系(包括金黃、粉色、綠色 3個(gè)品系)的新品種[3],并獲得了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

天然彩色蠶絲有著與普通家蠶絲相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能與化學(xué)成分[3-4]。主要差異在于:天然彩色蠶絲非蛋白附生物含量較高,是普通白色繭絲的1.2～1.9倍, 包括色素以及其它眾多生物質(zhì)[1-2,5]。這些附生物賦予了天然彩色蠶絲顏色及優(yōu)異的功能性,如紫外線防護(hù)性能、抗菌及抗氧化性能[1,5-6]。尤其是天然彩色蠶絲綠色品種(本文簡(jiǎn)稱(chēng)為天然綠色蠶絲),其抗菌活性高達(dá)99%,抗氧化活性更是普通白色繭絲的12～24倍[6]。這表明天然彩色蠶絲不僅是一種不需要染色的“綠色”環(huán)保纖維,更是一種優(yōu)良的天然功能纖維,在衛(wèi)生保健紡織品領(lǐng)域有較大的應(yīng)用價(jià)值。天然彩色蠶絲的耐水洗和耐日曬牢度較差[4],目前主要用于蠶絲被和床上用品的開(kāi)發(fā),而其功能性遠(yuǎn)未被充分發(fā)掘和利用。

人體皮膚的老化和許多皮膚疾病的發(fā)生與其組織的過(guò)氧化密切相關(guān),使用外源性抗氧化劑是緩解皮膚組織過(guò)氧化的有效手段之一,日常生活中人們使用含維生素C或E、超氧化物歧化酶(SOD)、葡萄籽提取物等抗氧化劑的護(hù)膚品便是典型的例子。近年來(lái),將抗氧化劑微膠囊化并整理到紡織品上成為了研究熱點(diǎn)[7-8]?？寡趸徔椘?也稱(chēng)美容紡織品)不僅獲得了商業(yè)化應(yīng)用,還用于臨床實(shí)驗(yàn)治療某些皮膚病[9]。天然綠色蠶絲纖維中含有較高含量的天然抗氧化劑黃酮類(lèi)化合物,這使得其作為一種天然抗氧化纖維具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文利用經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)評(píng)估了天然綠色蠶絲抗氧化組分向皮膚遷移的特性、影響因素及量效關(guān)系,以期為開(kāi)發(fā)天然彩色蠶絲抗氧化功能紡織品奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

材料:天然綠色蠶絲非織造布(厚度為1 mm,面密度為203 g/m2),利用浙江大學(xué)動(dòng)物學(xué)院培育的秋風(fēng)系列彩色品種在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下喂食新鮮桑葉至吐絲前,然后將蠶放置在平板上吐絲獲得。新鮮豬皮,購(gòu)置于杭州下沙京西菜市場(chǎng),所有豬皮均為豬肚兩側(cè)皮膚,厚度基本一致,皮層經(jīng)過(guò)輕微刮皮處理,并去除皮下脂肪。Scotch 810型膠帶,美國(guó)3M公司生產(chǎn)。

試劑:2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、蘆丁、硫酸慶大霉素、福林酚、咖啡酸,均為分析純,購(gòu)于麥克林試劑有限公司;乙醇(分析純)、甲醇(色譜純),購(gòu)于杭州米克化工有限公司。

儀器:LC-100型高效液相色譜儀,上海伍豐色譜儀器有限公司生產(chǎn);TU-1950型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬皮經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

利用經(jīng)皮滲透研究領(lǐng)域常用的Franz擴(kuò)散池裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn),流程如下:將豬皮皮下脂肪層剝除,并裁剪成面積為4.91 cm2、厚度約為2 mm的圓形切片,放入擴(kuò)散池裝置中。擴(kuò)散池由上部供體池和下部接收池組成,非織造布樣品放在豬皮上,面向供體池放置,豬皮皮下組織面向下部接收池,如圖1所示。

圖1 經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Scheme of transdermal permeation device

通過(guò)擴(kuò)散池的側(cè)向口向接收池輸入10 mL含0.4 mg/mL抗菌劑硫酸慶大霉素的生理鹽水,即接收液。取若干豬皮圓片,其中不放置樣品的1組作為空白對(duì)照組,另外3組豬皮上對(duì)齊放置面積為4.91 cm2、質(zhì)量為0.100 g的樣品圓片,放置前按樣品與水質(zhì)量比為1∶0、1∶5和1∶10向豬皮表面均勻滴加蒸餾水,分別模擬皮膚干態(tài)、微出汗和大量出汗的皮膚環(huán)境。依據(jù)GB/T 14576—2009《紡織品 色牢度試驗(yàn) 耐光、汗復(fù)合色牢度》制備堿性汗液和酸性汗液,以織物與汗液質(zhì)量比為1∶5滴加相應(yīng)汗液產(chǎn)生堿性及酸性皮膚環(huán)境。貼上樣品后在其上放置10 g的石英壓力塊使之與豬皮充分貼合。最后將裝置接收池放入37 ℃水浴中一定時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出豬皮,用膠帶黏取角質(zhì)層,使用新膠帶重復(fù)該過(guò)程8次后合并,獲得豬皮的角質(zhì)層。將膠帶與剩下的真皮層剪碎后分別加入5 mL的30%乙醇溶液,于常溫下超聲波(頻率為23 kHz,功率為200 W)提取60 min,過(guò)濾提取液,獲得皮膚組織中的天然綠色蠶絲抗氧化成分。所有豬皮經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3次, 取平均值。

1.2.2 人體皮膚經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

招募6名年齡為23～25歲的女性志愿者參與本實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為杭州,時(shí)間為10月中旬。將蠶絲非織造布裁剪為4 cm×4 cm的方塊,然后添加0.2 mL蒸餾水至受試者手臂內(nèi)側(cè)(離手腕約15 cm), 皮膚潤(rùn)濕面積與樣品大小一致,待皮膚無(wú)明顯水滴后,將樣品敷貼于皮膚上并用繃帶固定。接觸24 h后用膠帶將測(cè)試區(qū)的角質(zhì)層剝離,重復(fù) 8次后收集8條膠帶。將膠帶加入5 mL的30%乙醇溶液中超聲波提取60 min,過(guò)濾提取液,待測(cè)。

1.2.3 高效液相色譜測(cè)試

利用高效液相色譜儀對(duì)天然綠色蠶絲的純水提取物及以上皮膚組織的提取物進(jìn)行分析。色譜條件:Sharpsil-U C18 (4.6 nm×250 nm,5 μm)色譜柱,柱溫為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,流動(dòng)相為甲醇(A)和體積分?jǐn)?shù)為0.3%的乙酸水溶液(B),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,采用梯度洗脫方法(0～10 min, (10%～60%)A;10～26 min,(60%～100%)A;100%A條件下保持2 min)。

1.2.4 總酚含量測(cè)試

采用福林酚法[10]對(duì)各皮層中的抗氧化提取物進(jìn)行定量測(cè)試。將0.5 mL提取液置于反應(yīng)瓶中,加入0.5 mL濃度為0.25 mol/L的福林酚試劑,混合均勻后靜置3 min,再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的Na2CO3溶液,顯色反應(yīng)30 min,然后離心,取上清液。以同濃度 Na2CO3溶液為空白對(duì)照,測(cè)試其在 740 nm 處的吸光度。配制7種不同質(zhì)量濃度(1.0～15.0 μg/mL)的多酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)——蘆丁溶液代替抗氧化提取物重復(fù)以上步驟,獲得蘆丁質(zhì)量濃度Y與顯色反應(yīng)液吸光度X的線性回歸方程,用于總酚定量分析,回歸方程為Y=0.037 5X+0.038 3,相關(guān)系數(shù)R2為0.990 3。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)試

利用DPPH自由基清除法[6]評(píng)價(jià)遷移實(shí)驗(yàn)后各豬皮組織的抗氧化活性。取1 mL上述提取液加入到0.5 mL濃度為0.06 mmol/L DPPH·溶液中,避光反應(yīng)1 h后測(cè)其532 nm處的吸光度,記為A1?？瞻讓?duì)照組為1 mL蒸餾水加入到0.5 mL DPPH·溶液后的混合液,同樣靜置1 h后測(cè)得吸光度,記為A0。根據(jù)下式計(jì)算提取液對(duì)DPPH·的清除率:

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚環(huán)境的影響

豬皮類(lèi)似人體皮膚,由表皮層和真皮層組成,2層之間無(wú)天然的界限。角質(zhì)層為皮膚的最外層,是皮膚的重要組成部分。自由基處于皮膚真皮層,因此抗氧化劑需滲入真皮層才能發(fā)揮作用[8-9]。圖2 和表1分別示出經(jīng)皮滲透后各皮層抗氧化物提取物的液相色譜圖和多酚含量。經(jīng)過(guò)24 h接觸,皮膚角質(zhì)層和真皮層均檢測(cè)到了多酚的存在,而空白對(duì)照組皮膚未檢測(cè)到。各抗氧化組分的遷移量之間也存在差異,親水性較強(qiáng)的成分(保留時(shí)間為2～5 min)相對(duì)容易遷移至皮層中,因而這部分抗氧化組分在皮層中的含量相對(duì)較高。而親水性較弱的抗氧化組分(保留時(shí)間為10～25 min)雖然在纖維中的含量遠(yuǎn)高于親水性較強(qiáng)的組分,但是其向各皮層遷移的量相對(duì)較少,這是由于皮膚組織液是水性性質(zhì)的。

表1 24 h后天然綠色蠶絲向皮膚各層滲透的多酚含量及其占纖維總酚含量的百分率Tab.1 Content and percentage of polyphenols permeated to skin from naturally green-colored silk after 24 h

圖2 天然綠色蠶絲及皮層抗氧化物提取物的液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of antioxidant extracts of naturally green-colored silk and skin layers. (a) Fiber;(b) Stratum corneum;(c) Dermis;(d) Blank

另外,也并非所有抗氧化組分都能遷移至各皮層中。例如:保留時(shí)間為14 min的組分既不能遷移至真皮層也不能進(jìn)入角質(zhì)層;保留時(shí)間為22和 23 min 的組分能遷移至角質(zhì)層,但不能進(jìn)入真皮層。

皮膚濕度環(huán)境對(duì)纖維中抗氧化成分的遷移量影響很大。如表1所示,干態(tài)下的皮膚多酚含量?jī)H為(3.8±2.0) μg/cm2, 約占纖維中總酚含量的3.6%,其中角質(zhì)層和真皮層中的多酚占比相近。濕態(tài)下的皮膚多酚遷移率顯著增加,在類(lèi)似于皮膚微出汗的濕度條件下,皮膚中多酚含量達(dá)到(11.7±2.9) μg/cm2, 約占纖維中總酚含量的11.0%。其中,真皮層中的多酚含量約為角質(zhì)層中的3.2倍。這說(shuō)明在較長(zhǎng)時(shí)間的接觸后,纖維中的抗氧化組分能遷移深入至皮膚真皮層中。

天然綠色蠶絲的抗氧化成分黃酮類(lèi)是具有中等極性至極性的一類(lèi)多酚化合物,具有一定的水溶性[10-11]。這也是其遷移量與皮膚的濕潤(rùn)環(huán)境密切相關(guān)的根本原因。在更高的皮膚濕度時(shí),多酚遷移量反而略有下降,這可能是因?yàn)楸砥さ囊后w過(guò)多,液體連同溶解在其中的抗氧化成分不能全部被皮膚吸收,反而被樣品吸收回去。值得說(shuō)明的是,在接收池中并未檢測(cè)到多酚的存在,這說(shuō)明纖維中的抗氧化成分只是遷移到了皮層中,并未穿透整個(gè)皮層。

考慮到人的皮膚環(huán)境具有一定的酸堿性,而多酚類(lèi)物質(zhì)的溶解性及其抗氧化活性與所處環(huán)境的pH值相關(guān),因此評(píng)估了酸性及堿性皮膚環(huán)境對(duì)天然綠色蠶絲抗氧化組分遷移性質(zhì)及抗氧化活性的影響,結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?堿性皮膚環(huán)境下接觸24 h后,角質(zhì)層和真皮層中的抗氧化組分的含量與中性皮膚環(huán)境下相似(見(jiàn)表1),但其抗氧化活性較中性皮膚環(huán)境下稍差。這與多酚的結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系有關(guān):在堿性條件下,酚羥基離解,多酚與自由基的反應(yīng)活性下降[11];而酸性皮膚環(huán)境下,角質(zhì)層和真皮層中的多酚含量分別是2.9和10.5 μg/cm2。其角質(zhì)層的多酚含量與中性皮膚環(huán)境下情況類(lèi)似,但真皮層中的含量要明顯高于中性皮膚環(huán)境的遷移量(8.9 μg/cm2),可能是因?yàn)槎喾釉谒嵝云つw中滲透性較好。得益于酸性皮膚中抗氧化組分的含量較高,其皮膚的抗氧化能力也更好。

圖3 酸堿性皮膚環(huán)境對(duì)多酚含量及抗氧化活性的影響Fig.3 Effects of alkaline and acidic skin condition on content and antioxidant activity of polyphenols

2.2 接觸時(shí)間的影響及抗氧化劑量效應(yīng)

天然綠色蠶絲抗氧化成分向皮膚的遷移量表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性,且在皮膚各層的分布也與時(shí)間有關(guān)。圖4(a)示出在樣品與水質(zhì)量比為1∶5條件下不同時(shí)刻皮膚中的多酚含量。在24 h內(nèi),各皮層中的多酚含量幾乎呈線性增加。24 h后,其遷移量仍在增加,但增加速率有所減緩。以類(lèi)似于夏季穿著、皮膚微出汗的環(huán)境估算,第1次穿著天然綠色蠶絲織物12 h,其大約能向皮膚遷移5 μg/cm2的抗氧化組分。前12 h,抗氧化組分在角質(zhì)層中的分布比其在真皮層中多;而12 h后,其真皮層中的含量逐漸超過(guò)角質(zhì)層,且含量差隨接觸時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越大。這說(shuō)明天然綠色蠶絲的抗氧化組分會(huì)逐漸透過(guò)角質(zhì)層向真皮層遷移,且會(huì)在真皮層中累積。

圖4 接觸時(shí)間對(duì)皮膚中多酚含量及其抗氧化活性的影響Fig.4 Effects of contact time on content(a) and antioxidant activity(b) of polyphenols in skin

為評(píng)估遷移至皮層中的天然綠色蠶絲抗氧化組分的實(shí)際活性,對(duì)提取自各皮層中的成分進(jìn)行了自由基清除能力測(cè)試,結(jié)果如圖4(b)所示。由于皮膚中殘存一些內(nèi)源性抗氧化組分,如超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等,空白對(duì)照皮膚顯示出了微小的抗氧化活性,其角質(zhì)層和真皮層對(duì)0.03 μmol DPPH·的清除率分別為9.7%和16.5%。隨著接觸時(shí)間和皮膚組織中抗氧化組分的增加,皮膚的抗氧化活性顯著增加。接觸12 h后,皮膚角質(zhì)層和真皮層對(duì)DPPH·的清除率分別達(dá)到了24.2%和45.6%;接觸24 h后,其清除率進(jìn)一步增加到了37.8%和62.8%。由此可見(jiàn),與天然綠色蠶絲接觸后皮膚的抗氧化能力得到了顯著增強(qiáng),其抗氧化能力與抗氧化成分的遷移量呈正相關(guān)性。

2.3 人體皮膚經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

為明晰服用過(guò)程中天然綠色蠶絲抗氧化組分向皮膚遷移的情況及量效關(guān)系,對(duì)6位志愿者進(jìn)行了皮膚接觸實(shí)驗(yàn),其皮膚中的多酚含量及抗氧化活性結(jié)果如圖5所示。

圖5 從志愿者皮膚角質(zhì)層中檢測(cè)到的多酚含量及其抗氧化活性Fig.5 Content and antioxidant activity of polyphenols in stratum corneum of volunteers′ skin

從圖5可看出,志愿者皮膚接觸樣品24 h后,其皮膚角質(zhì)層中檢測(cè)到的多酚含量范圍為5.1～6.6 μg/cm2, 平均值為(5.7±0.5)μg/cm2?？梢?jiàn),同樣的接觸時(shí)間和接觸面積條件下,天然綠色蠶絲向人體皮膚角質(zhì)層遷移的抗氧化組分的含量顯著高于豬皮角質(zhì)層((2.8±1.9 )μg/cm2)。這可能是因?yàn)槿梭w皮膚與樣品之間的相對(duì)摩擦有助于抗氧化組分的遷移,且人體皮膚相對(duì)較高的溫度及組織液的流動(dòng)性也有利于抗氧化組分經(jīng)皮滲透。

得益于擁有較高含量的抗氧化組分,各志愿者皮膚角質(zhì)層對(duì)自由基的平均清除率高達(dá)(76.7±8.2)%,顯著高于同條件豬皮實(shí)驗(yàn)組角質(zhì)層 ((37.8±3.7)%)。這預(yù)示著纖維中的抗氧化組分能遷移至人體皮膚中,并賦予皮膚優(yōu)異的抗氧化能力。

3 結(jié) 論

1)天然綠色蠶絲中的抗氧化組分能遷移到豬皮角質(zhì)層和真皮層中,與人體皮膚實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。相同條件下,抗氧化組分向人體皮膚遷移得更多。皮膚微濕環(huán)境下,接觸24 h后人體皮膚角質(zhì)層中抗氧化組分的含量約為5.7 μg/cm2。

2)天然綠色蠶絲的抗氧化組分向皮膚遷移具有時(shí)間依賴(lài)性?？寡趸M分的遷移量隨樣品與皮膚接觸時(shí)間的增加而增加;抗氧化組分在各皮層中分布的差異也與接觸時(shí)間相關(guān)。接觸時(shí)間少于12 h,抗氧化組分更多地分布于皮膚角質(zhì)層中;12 h后,抗氧化組分更多地滲透并積累于真皮層中?？寡趸M分只能遷移至皮層中,并不能穿透皮層。

3)抗氧化組分向皮膚遷移的量與皮膚表面的濕度、酸堿性有較大關(guān)系。濕潤(rùn)的皮膚環(huán)境有利于抗氧化組分向皮膚遷移,但并不是皮膚越濕潤(rùn)遷移量越大,類(lèi)似于人體微出汗的皮膚環(huán)境更優(yōu);酸性皮膚環(huán)境下抗氧化組分的遷移量最大,且向皮膚深層遷移較多,其次是中性皮膚環(huán)境。

4)各皮層的抗氧化活性表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng),皮層吸收的抗氧化組分越多,皮層的自由基清除活性越高。