光合細菌和小球藻對石生苔蘚種源擴繁的作用

王鶴鳴,卜崇峰,吳淑芳,王 春,莫秋霞

(1 西北農林科技大學 水利與建筑工程學院,陜西楊凌 712100;2 西北農林科技大學 水土保持研究所,陜西楊凌 712100;3 中國科學院 水利部 水土保持研究所,陜西楊凌 712100;4 西北農林科技大學 資源與環(huán)境學院,陜西楊凌 712100)

秦嶺是中國地理、氣候分界線、重要的生物基因庫,起到涵養(yǎng)水源、調節(jié)氣候等多種重要的生態(tài)功能[1-2]。高速公路建設、礦產資源開發(fā)等活動導致秦嶺地區(qū)形成了大量裸露巖石坡面[3-4],嚴重影響了秦嶺的生態(tài)功能。其巖體堅硬、完整性好,持水能力差的坡面狀況,更增加了植被恢復工作的難度,依靠單一的工程措施難以達到長期穩(wěn)定的防護效果[3,5]。苔蘚結皮是以苔蘚為優(yōu)勢種的生物結皮,可以從大氣中吸收水分及養(yǎng)分,附著在巖石表面生長,促進礦物分化和植被演替,是裸巖邊坡修復潛在的理想材料[6-10]。利用人工培育的石生苔蘚結皮,進行巖石工程創(chuàng)面的生態(tài)修復具有非常廣闊的市場前景。但目前人工培育苔蘚結皮的效率無法滿足修復需求,培育方案亟待優(yōu)化。

除已有研究關注的物理化學因素外,菌藻添加亦可促進苔蘚結皮的生長[11-12],且藻菌配施添加更有利于培養(yǎng)體系的穩(wěn)定和持續(xù)運行。如巨大芽孢桿菌和小球藻配施可以提高土壤磷有效性,改善土壤理化性質,改變土壤微生物群落結構,提高微生物活性,從而更好地促進作物生長[13]。因此,不同菌藻的選擇嘗試及組合對于提高苔蘚結皮種源擴繁效率具有重要實踐意義。光合細菌是一種植物根際促生菌,可將分子態(tài)氮和不溶性磷酸鹽轉化為植物可吸收的有效養(yǎng)分[14-16],還可合成植物激素促進植物生長發(fā)育[15,17],目前已被證實能顯著促進多種經濟作物的生長[18],改善作物品質[19],但該類菌對苔蘚結皮的作用效果有待驗證。藻類分泌的胞外多糖在低濃度下能促進齒肋赤蘚原絲體和配子體萌發(fā)產生新的莖葉體[20]。研究表明,添加硅藻和小球藻的復合藻液可顯著促進以土生對齒蘚為優(yōu)勢種的苔蘚結皮的形成[11]。添加小球藻可顯著促進銀葉真蘚生長,延緩其衰老。但藻類對秦嶺地區(qū)石生蘚的作用效果及最適濃度仍有待探究。此外,光合細菌可為藻類生長發(fā)育提供有效氮、有效磷等養(yǎng)分[21],二者配施對苔蘚生長發(fā)育的作用效果是否更佳亦有待嘗試。

利用人工培育的苔蘚結皮進行巖石工程創(chuàng)面的生態(tài)修復具有非常廣闊的市場前景,而針對特定地區(qū)的優(yōu)勢種探討高效的種源擴繁技術則成為了首要任務。為此,本研究以秦嶺北麓長勢好、生物量大的石生匍匐型蘚種——羽枝青蘚[Brachytheciumplumosum(Hedw.) B. S. G.]作為種源,考慮最具代表性,且在種植業(yè)應用最廣泛的2種微生物——沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和小球藻(Chlorellavulgaris)的濃度兩因素,開展室內種源擴繁完全試驗,旨在明晰2種菌藻的作用效果、最適濃度及組合,從而提高擴繁效率,優(yōu)化羽枝青蘚培育方案,為后期大規(guī)模石生苔蘚種源擴繁提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 種源采集與材料制備

1.1.1 采樣區(qū)概況

研究區(qū)位于陜西省西安市周至縣西南部的翠峰山國家森林公園(34°00′05″-34°10′25″N,107°55′10″-108°05′35″E),總占地面積3 918 hm2,主體處于秦嶺北麓中段,由于園區(qū)內山體阻隔明顯,開放區(qū)僅為泥峪、車峪及其與翠峰山山體交匯的淺山溝谷帶,原始景觀保存較好[22]。園區(qū)內屬溫帶濕潤性氣候,年平均氣溫12～13.6 ℃,最低溫-5.2 ℃,最高溫20.5 ℃;年降水量650～720 mm,全年降水分布不均,夏季多以暴雨形式出現(xiàn),秋季常出現(xiàn)連陰雨,洪澇災害較為頻繁;年平均日照時間為2 002 h;山區(qū)平均風速為8～15 m/s,多為山谷的狹管效應形成的下山風;地下水pH值7～8,地表水為軟水或中等軟水,均宜灌溉;翠峰山海拔1 773 m,土壤分布呈明顯的垂直地帶性,海拔1 200 m以下多為褐土,1 200 m以上為棕壤;調查區(qū)動植物資源豐富,人工林主要為油松(PinustabuliformisCarr.)、漆樹[Toxicodendronvernicifluum(Stokes) F. A. Barkl.]、刺槐(RobiniapseudoacaciaLinn.)等;天然林多為高山鐵杉[Tsugachinensis(Franch.) Pritz.]、冷杉[Abiesfabri(Mast.) Craib]、云杉(PiceaasperataMast.)等珍稀樹種,是當之無愧的生物多樣性寶庫[23]。

1.1.2 樣品采集

石生苔蘚結皮采自陜西省西安市周至縣西南部的翠峰山國家森林公園(34°00′05″-34°10′25″N,107°55′10″-108°05′35″E),海拔950～1 150 m之間,干擾較少的山區(qū)。采集時選擇生境相似,發(fā)育狀況相近的苔蘚結皮作為試驗材料。經鑒定,其優(yōu)勢苔蘚種為羽枝青蘚[Brachytheciumplumosum(Hedw.) B. S. G.]。采集的苔蘚結皮置于陰涼通風處陰干,人工剔除枯落物和石塊等雜物后用粉碎機將結皮粉碎,過篩選取1～3 mm的莖葉碎片作為室內擴繁試驗種源[23]。

1.1.3 微生物制備

于北京百歐博偉生物技術有限公司https://www.biobw.org/購買沼澤紅假單胞菌(bio-52488=CGMCC 1.2352)菌株液體培養(yǎng)物10 mL,并在30 ℃密封條件下用鎢絲燈全天照射培養(yǎng)獲得沼澤紅假單胞菌液(OD600=3.231);于中國科學院淡水藻種庫(http://algae.ihb.ac.cn/Default.aspx)購買普通小球藻(FACHB-2338)藻株液體培養(yǎng)物10 mL,并在25 ℃,12 h/12 h(晝/夜)下培養(yǎng)獲得普通小球藻藻液(OD680=0.814)。

1.2 擴繁試驗環(huán)境

苔蘚結皮種源擴繁試驗于陜西省咸陽市楊凌區(qū)西北農林科技大學水土保持研究所工程中心116實驗室人工氣候箱內進行。人工氣候箱內溫度、空氣濕度、光照強度及光照時間分別設定為20 ℃、80%、1 500～2 000 lx及16 h/8 h(晝/夜)[23]。

1.3 試驗設計與布置

試驗設置沼澤紅假單胞菌濃度(高濃度24 mL/L,低濃度12 mL/L,不添加)[24]和普通小球藻濃度(高濃度250 mL/L,低濃度125 mL/L,不添加)[13]兩因素三水平完全試驗(表1),共9個處理,3個重復,27個樣品。培育盒規(guī)格為10 cm×10 cm×5 cm,培育盒內加入4 cm厚的火山巖,將其表面整理平坦。高溫蒸汽滅菌后,鋪上兩層醫(yī)用滅菌紗布,在紗布上噴灑菌液或藻液。菌藻液添加量綜合參考光合細菌對植物促生研究[24]及其他微生物菌劑對苔蘚促生研究[25]的用量并適當調整,最終均定為2 L/m2。無需添加菌藻的處理添加等量蒸餾水。隨后,在每培育盒內均勻撒播種源0.6 g(60 g/m2)。培育期間,每日澆水1次,每8 d測定苔蘚結皮的生長指標(蓋度、新發(fā)芽莖長、新發(fā)芽數(shù))1次,每次測定指標后噴灑霍格蘭營養(yǎng)液(2.1 L/m2)1次。試驗于2022年6月2日開始,2022年7月3日結束,歷時32 d[23]。

表1 試驗處理

1.4 指標測定及方法

(1)蓋度:在培育盒上方放置10 cm×10 cm的畫有等分100個方格的透明亞克力板,每個格子下方有新發(fā)芽苔蘚計為1,沒有則計為0,累計數(shù)量除以100即為該樣方苔蘚結皮蓋度[23]。

(2)新發(fā)芽數(shù):在培育盒上方放置由四線交叉等分為9個方格的10 cm×10 cm的透明亞克力板,選取2條對角線上的5個方格測量羽枝青蘚種源的新發(fā)芽個數(shù),加和除以所占面積即為該樣方單位面積的新發(fā)芽數(shù)[23]。

(3)新發(fā)芽枝長:在培育盒內隨機選取10根新發(fā)枝芽,用游標卡尺測定其長度,取平均值即為該樣方新發(fā)芽平均枝長[23]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行預處理,多重比較和方差分析使用IBM SPSS Statistics 26軟件完成,作圖使用Origin 2022軟件完成。

2 結果與分析

2.1 菌藻添加對苔蘚結皮蓋度的影響

從各處理結皮蓋度隨時間變化趨勢(圖1)可以看出,在全培育期內,各處理的結皮蓋度均呈穩(wěn)定上升趨勢。培育前期生長速率較快,末期速率減緩,但還有繼續(xù)生長的空間。培育32 d后各處理均能形成穩(wěn)定的苔蘚結皮。在培育期第16天后,處理R2C0的苔蘚結皮蓋度始終高于其他處理。第32天收獲時,添加菌藻的處理其苔蘚結皮蓋度均高于對照處理。表明播種時添加沼澤紅假單胞菌或普通小球藻有益于羽枝青蘚更快實現(xiàn)全覆蓋。

圖1 各處理苔蘚結皮蓋度隨時間的變化Fig.1 Changes of moss crust coverage with time in each treatment

多重比較結果(圖2)表明在試驗末期,處理R1C2和R2C0的蓋度顯著高于處理R1C0、R0C2、CK,其中處理R2C0蓋度最高,達到了90.33%,對照處理(CK)的蓋度最低,僅為79.00%。添加菌或藻的處理蓋度均達到80.00%以上。對于添加菌藻的處理,除處理R1C2和R2C0外,其他處理與CK蓋度無顯著差異。說明播種時僅添加低濃度菌或混合添加高濃度菌和低濃度藻可以顯著提高苔蘚結皮的蓋度。

柱狀圖上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。圖2 試驗末期各處理苔蘚結皮蓋度Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.Fig.2 Moss crust coverage at the end of each treatment

對苔蘚結皮蓋度數(shù)據(jù)的正態(tài)檢驗與方差齊性檢驗,結果均不顯著(P>0.05),滿足方差分析的前提假設。方差分析結果(表2)表明,沼澤紅假單胞菌的濃度對苔蘚結皮蓋度影響顯著(F=3.695,P=0.045);沼澤紅假單胞菌和小球藻的交互作用對苔蘚結皮蓋度影響顯著(F=3.085,P=0.042);普通小球藻的濃度對苔蘚結皮的蓋度無顯著影響。

表2 試驗末期苔蘚結皮蓋度方差分析結果

2.2 菌藻添加對苔蘚新發(fā)芽數(shù)的影響

從各處理苔蘚新發(fā)芽數(shù)隨時間變化趨勢(圖3)可以看出,在全培育期內,各處理苔蘚新發(fā)芽數(shù)均呈穩(wěn)定增加趨勢,培育前期生長速率較快,末期速率減緩。處理R2C0還有新發(fā)芽的趨勢,其余處理新發(fā)芽速率趨于平緩。

圖3 各處理苔蘚新發(fā)芽數(shù)隨時間的變化Fig.3 Changes of new sprouting number of moss with time in each treatment

在培育期第18天后,處理R2C0的苔蘚新發(fā)芽數(shù)始終高于其他處理。第32天收獲時,處理R2C0的新發(fā)芽數(shù)明顯多于其他處理,表明播種時添加低濃度沼澤紅假單胞菌可顯著增加苔蘚的新發(fā)芽數(shù)。

多重比較結果(圖4)表明在試驗末期,處理R2C0的新發(fā)芽數(shù)最多,為6.04 個/cm2,與處理4無顯著差異,但顯著多于其他處理。處理R1C2的新發(fā)芽數(shù)最少,僅為3.65 個/cm2。處理R1C0-R0C2的新發(fā)芽數(shù)均達到4.00 個/cm2以上。除處理R2C0外,其他處理與CK新發(fā)芽數(shù)均無顯著差異。表明僅添加低濃度沼澤紅假單胞菌可以顯著增加苔蘚的新發(fā)芽數(shù)。

圖4 試驗末期各處理苔蘚新發(fā)芽數(shù)Fig.4 New sprouting number of moss at the end of each treatment

對苔蘚新發(fā)芽數(shù)數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗與方差齊性檢驗,結果均不顯著(P>0.05),滿足方差分析的前提假設。方差分析結果(表3)表明,沼澤紅假單胞菌的濃度對苔蘚新發(fā)芽數(shù)影響顯著(F=4.247,P=0.031);普通小球藻的濃度以及沼澤紅假單胞菌和小球藻的交互作用對苔蘚新發(fā)芽數(shù)無顯著影響。

表3 試驗末期苔蘚新發(fā)芽數(shù)方差分析結果

2.3 菌藻添加對苔蘚新發(fā)芽莖長的影響

從各處理苔蘚新發(fā)芽莖長隨時間變化趨勢(圖5)可以看出,在全培育期內,各處理苔蘚新發(fā)芽莖長均呈穩(wěn)定增長趨勢,且在末期仍保持積極的增長態(tài)勢。在培育期第16天后,處理R2C0的苔蘚新發(fā)芽莖長始終長于其他處理,處理R0C1的新發(fā)芽莖長增長速率加快。在第32天收獲時,處理R0C1的莖長與處理R2C0基本一致,CK的新發(fā)芽莖長最短。

圖5 各處理苔蘚新發(fā)芽莖長隨時間的變化Fig.5 Changes of new sprouting length of moss with time in each treatment

多重比較結果(圖6)表明在試驗末期,處理R2C0和R0C1的新發(fā)芽莖長最長,為6.45 mm,與處理R1C1-R2C2無顯著差異,顯著長于處理R0C2和CK。CK的新發(fā)芽莖長最短,僅為4.81 mm。處理R1C1-R0C1的新發(fā)芽莖長均達到5 mm以上。處理R1C1、R1C2、R1C0、R2C2與CK新發(fā)芽數(shù)均無顯著差異。對苔蘚新發(fā)芽莖長數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗與方差齊性檢驗,結果均不顯著(P>0.05),滿足方差分析的前提假設。方差分析結果(表4)表明,沼澤紅假單胞菌的濃度對苔蘚新發(fā)芽莖長影響顯著(F=4.185,P=0.032);普通小球藻的濃度以及沼澤紅假單胞菌和小球藻的交互作用對苔蘚新發(fā)芽莖長無顯著影響。

圖6 試驗末期各處理苔蘚新發(fā)芽莖長Fig.6 New sprouting length of moss at the end of each treatment

表4 試驗末期苔蘚新發(fā)芽莖長方差分析結果

3 討 論

3.1 沼澤紅假單胞菌對羽枝青蘚生長的影響

沼澤紅假單胞菌的添加顯著促進了羽枝青蘚的生長發(fā)育。具體表現(xiàn)為:相比對照處理,添加低濃度沼澤紅假單胞菌將羽枝青蘚蓋度提高了14.3%、新發(fā)芽數(shù)增加了61.2%、新發(fā)芽莖長增長了34.0%。這可能與光合細菌自身的生理特性有關。光合細菌可通過自身代謝和生物固氮功能,將大氣中的分子態(tài)氮及土壤中的不溶性磷酸鹽轉化為植物可吸收的離子態(tài)氮磷,為作物提供有效養(yǎng)分[14-16]。此外,光合細菌能提高土壤中銨態(tài)氮的含量,為放線菌提供氮源,從而提高土壤中放線菌含量[26]。而放線菌和光合細菌一樣可以提高土壤中有效磷的含量,釋放植物激素促進多種植物生長[27-28]。這可能也是光合細菌促進羽枝青蘚生長的一個原因。

試驗結果表明,低濃度沼澤紅假單胞菌相較于高濃度菌對羽枝青蘚的促生效果更好?？赡苁且驗楦邼舛染a生的植物激素濃度較高,抑制了苔蘚的生長。光合細菌的胞外分泌物中含有大量植物激素,如吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)等[29]。這些外源激素也可被植物吸收利用,從而影響植物生長[30]。高葉青等人通過短葉對齒蘚愈傷組織生長對不同濃度IAA響應效果的研究發(fā)現(xiàn),低濃度IAA處理的愈傷組織,其分化出的原絲體長度最長,直徑最大,而高濃度IAA處理的愈傷組織其原絲體短而稠密[31],這表明高濃度IAA會對苔蘚莖長產生抑制作用。此外,盡管光合細菌可以促進溶磷放線菌的繁殖,提高基質中有效磷的含量,但放線菌會和苔蘚爭奪銨態(tài)氮[26],降低基質中銨態(tài)氮含量。因此,過高濃度的沼澤紅假單胞菌可能使放線菌和苔蘚的共生平衡轉化為競爭關系,這也可能是高濃度菌對羽枝青蘚促生效果較差的原因。

3.2 小球藻對羽枝青蘚生長的影響

單獨添加小球藻對羽枝青蘚的各項生長指標均無顯著影響。這與陳祥舟等人的研究結果[23]一致。但也有眾多對其他蘚種的研究證實,藻類可以釋放胞外多糖促進苔蘚莖葉體萌發(fā),也可提高土壤內有機質等養(yǎng)分含量,促進植物生長[20]。白雪強等人的研究表明,添加小球藻可延緩銀葉真蘚植株衰老,使其保持較好的生長狀況[12]。鞠孟辰等人的研究也表明,添加小球藻和硅藻可以提高土生對齒蘚結皮的微生物多樣性,促進結皮發(fā)育[11],這些均與本研究結果不符。這可能因不同蘚種的生理習性而異,土生對齒蘚和銀葉真蘚大多為土生直立型蘚,而羽枝青蘚為石生匍匐型蘚,大多定植在養(yǎng)分貧瘠的巖石表面,其對有機質的需求和養(yǎng)分吸收方式可能與土生直立蘚不同,所以沒有呈現(xiàn)出一致的促生效果。另一方面,沼澤紅假單胞菌的添加會促進放線菌生長[26],羽枝青蘚的優(yōu)勢內生菌也是放線菌[32],而放線菌可產生抗生素裂解綠藻[33],所以小球藻可能因被抑殺而沒有體現(xiàn)出應有的促生效果。此外,藻類過度繁殖時,其對苔蘚的促生作用就會轉化為競爭關系[20],也可能是小球藻對羽枝青蘚促生效果不明顯的原因。在以往的研究中,小球藻的施加時間均為種源播撒時或播撒后,提前施加小球藻可改善養(yǎng)分環(huán)境,也可避免苔蘚與藻類的競爭,可能會達到較為理想的效果。

3.3 菌藻交互作用對羽枝青蘚生長的影響

微生物間的營養(yǎng)互作、信號交流等都在同時進行[34],與單一微生物培養(yǎng)體系相比,多種微生物共生體系具有更豐富的物種多樣性,更有利于培養(yǎng)體系的穩(wěn)定和持續(xù)運行[35]。如張娜等人[36]的研究表明,沼澤紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌混施比2種微生物單施對水稻產量和結實率的增產效果更好。但本研究表明,菌藻混施促生效果不如單獨施加沼澤紅假單胞菌,這可能與小球藻和沼澤紅假單胞菌的生理特性有關。放線菌可產生抗生素裂解綠藻[33],光合細菌的添加又可顯著提高土壤中放線菌的含量[37]。意味著同時添加沼澤紅假單胞菌和小球藻會增強放線菌對小球藻的抑殺作用。沼澤紅假單胞菌可以提高土壤中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷的含量,促進植物生長[38],而綠藻會爭奪這些養(yǎng)分合成細胞[21],其常被用于處理富營養(yǎng)化的水體,也是利用了這一生理習性。因此,光合細菌的添加對綠藻可能存在抑制作用,綠藻也可能會限制光合細菌對植物的促生效果,二者間的關系變化自然會影響其對植物促生效果的呈現(xiàn)。

除二者間相互作用外,二者對羽枝青蘚單獨的作用效果也會因濃度及施用量的改變而異。李靖宇等人[39]的研究表明在藻結皮向蘚結皮演替的過程中,部分放線菌相對豐度出現(xiàn)顯著下降,這意味著隨著結皮演替,苔蘚與放線菌之間可能會出現(xiàn)競爭關系。說明光合細菌對放線菌的促生作用過強會對苔蘚產生不利影響。藻類過度繁殖時,其對苔蘚的促生作用也會轉化為競爭關系[20]。因此,找出適宜的濃度配比才能更好地協(xié)調菌藻的關系,實現(xiàn)二者對植物促生效果的最大化。

菌藻交互作用對羽枝青蘚的新發(fā)芽數(shù)和莖長均無顯著影響,但對羽枝青蘚的蓋度有顯著影響。這可能與蓋度的計算規(guī)則有關,本研究蓋度的計算依靠新發(fā)芽數(shù)情況進行判定,對蓋度有影響只能說明菌藻混施處理的羽枝青蘚發(fā)芽比較均勻,但不代表發(fā)芽數(shù)多,苔蘚結皮的生長狀況還要考慮新發(fā)芽數(shù)和莖長進行綜合評價。可能的原因是藻類利用了高濃度菌產生的養(yǎng)分,抑制了過剩的養(yǎng)分對羽枝青蘚的不利作用,使二者混施對羽枝青蘚的促生效果更顯著。

4 結 論

沼澤紅假單胞菌的添加對羽枝青蘚各項生長指標(蓋度、新發(fā)芽數(shù)、新發(fā)芽莖長)均有顯著的促進作用。單獨添加小球藻對羽枝青蘚的生長無顯著影響,但和沼澤紅假單胞菌混施可提高結皮蓋度。羽枝青蘚擴繁的最優(yōu)處理為“添加低濃度(OD600=3.231,12 mL/L)沼澤紅假單胞菌”。人工氣候室條件下(溫度20 ℃、空氣濕度80%、光照強度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/8 h(晝/夜))培育32 d后,最優(yōu)處理相比對照可將蓋度提高14.3%,新發(fā)芽數(shù)增加61.2%,新發(fā)芽莖長增長34.0%。沼澤紅假單胞菌可顯著促進羽枝青蘚生長發(fā)育,建議在后期石生苔蘚結皮種源擴繁實踐中多加考慮和借鑒。