基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)的蕓香科屬間系統(tǒng)發(fā)育初步分析

劉 涵,孫 沖,吳 杰,黃 威,黃勤琴,劉 霞,4*

(1 重慶文理學(xué)院 園林與生命科學(xué)學(xué)院,重慶 402160;2 重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,重慶 404000;3 長江大學(xué) 園藝與園林學(xué)院,湖北荊州 434025;4 西南大學(xué) 園藝與園林學(xué)院,重慶 400799)

蕓香科(Rutaceae)中許多植物以具重要的藥用、經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值而聞名,如花椒屬(ZanthoxylumL.)物種[1]。蕓香科從屬于蕓香目(Rutales),約150屬,1 600種,分布于世界各地,中國有28屬,約151種,28變種,主要分布在中國西南和南方地區(qū)[2]?；诜肿酉到y(tǒng)研究結(jié)果表明,蕓香科是單系類群[3];然而,蕓香科下亞科的劃分爭議較大。被子植物分類系統(tǒng)(angiosperm phylogeny group,APG)將蕓香科劃分為蕓香亞科(Rutoideae)、柑橘亞科(Aurantioideae)、戟葉橄欖亞科(Cneoroideae)和脂檀亞科(Amyridoideae)4個(gè)亞科。根據(jù)果實(shí)和雌蕊形態(tài),Engler系統(tǒng)將該科細(xì)分為蕓香亞科、柑橘亞科、飛龍掌血亞科(Toddalioideae)、巨盤木亞科(Flindersioideae)、Rhabdodendroideae、Dictyolomatoideae和Spathelioideae 7個(gè)亞科[4],其中僅前4個(gè)亞科在中國有分布。

前人研究表明,物種多樣性最高的蕓香亞科和飛龍掌血亞科物種關(guān)系很大程度上是混雜的,蕓香科的模式屬蕓香屬與柑橘亞科關(guān)系更為密切[5-6]。Poon等[7]通過2個(gè)葉綠體片段和核基因標(biāo)記表明吳茱萸屬(TetradiumLour.)、黃檗屬(PhellodendronRupr.)和飛龍掌血屬(ToddaliaJuss.)是花椒屬的近親屬。Poon等[7]和Groppo等[8-9]發(fā)現(xiàn)花椒屬與飛龍掌血屬為姊妹類群,而黃檗屬則嵌套在吳茱萸屬中。Appelhans等[1]根據(jù)5個(gè)葉綠體和核基因標(biāo)記,認(rèn)為飛龍掌血屬可能嵌套在花椒屬內(nèi)。盡管前人對蕓香科植物做了大量的研究,但僅使用有限數(shù)量的葉綠體和核基因標(biāo)記來推斷該科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,系統(tǒng)發(fā)育樹中一些重要節(jié)點(diǎn)的分辨率較低。目前,在更廣泛的分類群采集和大量分子數(shù)據(jù)使用的基礎(chǔ)上,尚沒有得到1個(gè)完整的蕓香科系統(tǒng)發(fā)育樹框架。此外,由于系統(tǒng)發(fā)育樹支持率較低,以及在以往研究中使用的分子標(biāo)記有限,花椒的近親屬還有待進(jìn)一步闡明。完整的葉綠體基因組(chloroplast DNA, cpDNA)序列為系統(tǒng)發(fā)育特征提供了豐富的生物信息,有助于深入了解蕓香科亞科之間以及花椒屬及其近緣屬之間的進(jìn)化關(guān)系。

葉綠體基因組大小適中,基因含量和結(jié)構(gòu)相對保守,核苷酸替代率低,為植物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了充足的資源[10],已有研究證明葉綠體基因組序列具有在不同分類水平上解決系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的潛力[11]。近年來,葉綠體基因組被用于不同分類水平的分析,例如,李巖等[12]基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)比較分析了十字花科(Brassicaceae Burnett)22個(gè)屬22個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,結(jié)果表明利用葉綠體基因組數(shù)據(jù)可以解決十字花科植物的系統(tǒng)分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。路東曄等[13]分析了臭柏(JuniperussabinaL.)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,豐富了臭柏的遺傳信息。Xu等[14]基于葉綠體基因組序列建立了風(fēng)毛菊屬(SaussureaDC.)系統(tǒng)發(fā)育框架,各分支具有較高支持率。Zong等[15]利用葉綠體基因組序列解析了楊屬(PopulusL.)物種的親緣關(guān)系。段義忠和張凱[16]對沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]和矮沙冬青[Ammopiptanthusnanus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]葉綠體基因組進(jìn)行了測序,分析了其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為沙冬青屬的種間鑒別和分子標(biāo)記的開發(fā)等奠定了理論基礎(chǔ)。馬孟莉等[17]對姜科(Zingiberaceae)豆蔻屬(AmomumRoxb.)陽春砂(AmomumvillosumLour.)葉綠體基因組進(jìn)行了測序,揭示了陽春砂與其他姜科植物的進(jìn)化關(guān)系。Wen等[18]報(bào)道了野木瓜(StauntoniachinensisDC.)葉綠體基因組序列,并對木通亞科(Lardizabaloideae)植物的葉綠體基因組進(jìn)行比較分析,揭示了其適應(yīng)性進(jìn)化。本研究對蕓香科中12個(gè)物種進(jìn)行了葉綠體基因組測序,組裝和注釋,獲得其葉綠體全基因組序列,結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已公布的蕓香科物種的葉綠體基因組序列,共46個(gè)物種,選擇苦木科(Simaroubaceae)和橄欖科(Burseraceae)共3個(gè)物種作為外類群,對分布于中國的蕓香科植物進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析。由于巨盤木亞科物種材料和葉綠體全基因組數(shù)據(jù)的缺乏,該亞科未納入本研究中。利用葉綠體基因組數(shù)據(jù)對中國蕓香科屬水平的親緣關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育重建,有助于加深理解中國蕓香科屬間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,同時(shí)明確花椒屬的近緣屬類群,為下一步進(jìn)行花椒屬種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究選擇合適外類群提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究共獲得蕓香科46個(gè)物種的葉綠體全基因組序列,其中12個(gè)物種為本研究新測序獲得,序列登錄號及詳細(xì)的樣品信息見表1。

表1 研究所用樣本的信息

其余物種包括3個(gè)外類群物種的葉綠體全基因組序列均從GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)數(shù)據(jù)庫獲得。植物標(biāo)本存放于重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取和測序

采用CTAB法[19]或植物基因組DNA植物試劑盒(天根生化科技有限公司)提取植物硅膠干燥葉片的總基因組DNA。質(zhì)檢合格后的DNA,送廣州佰數(shù)生物科技有限公司在BGISEQ-500平臺進(jìn)行測序,雙末端測序讀取長度為150 bp。

1.2.2 葉綠體全基因組的組裝和注釋

為保證后續(xù)組裝質(zhì)量,對測序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行過濾,去掉帶接頭的reads,去掉N含量超過10%的短序列,過濾測序質(zhì)量值小于Q20,對過濾后的reads用SPAdes Assembler v3.9.0軟件[20]組裝葉綠體基因組,使用GapCloser v1.12軟件對組裝后的結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)洞和堿基校正,在Chlorobox[21]中使用CpGAVAS[22]軟件進(jìn)行基因組注釋。使用MAFFT v7.0軟件[23]進(jìn)行序列比對。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

系統(tǒng)發(fā)育樹重建分別采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和貝葉斯法(bayesian inference,BI),ML分析用RAxML v 8.2.12軟件[24]進(jìn)行,使用jModeltest 2.0軟件[25]確定最佳核苷酸替代模型為GTR+G+I,按照AIC(Akaike information Criterion)信息標(biāo)準(zhǔn)檢測模型對數(shù)數(shù)據(jù)的擬合程度。采用MrBayes v.3.2.1[26]進(jìn)行BI分析。馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)算法運(yùn)行1 000萬代,每1 000代取樣1次,運(yùn)行結(jié)果前25%作為burn-in,其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體全基因組特征

新測序的花椒屬物種組裝好的葉綠體基因組全長范圍在157 304(兩面針)～159 072 bp(野花椒)之間,具有典型的四分體結(jié)構(gòu),包括大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)?；ń穼傥锓N葉綠體基因組除川陜花椒包含133個(gè)基因,其余均包含132個(gè)基因,GC含量均大于38%,柑橘、吳茱萸和川黃檗葉綠體基因組長度分別為160 698 bp、158 762 bp和158 490 bp。對所獲得的49個(gè)物種的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對,用于進(jìn)化分析的葉綠體基因組序列總長度為196 641 bp,葉綠體基因組序列具有26 747個(gè)變異位點(diǎn),其中12 670個(gè)是簡約性信息位點(diǎn)。

2.2 蕓香科間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

2種方法ML和BI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),僅在某些進(jìn)化支的支持率(PP/BS)上存在差異(圖1)。基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹各分支分辨率較高,這可能與葉綠體基因組序列含有較高的生物信息位點(diǎn)有關(guān),從而獲得了蕓香科物種間穩(wěn)健的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。蕓香科物種聚為1個(gè)單系類群,科下物種進(jìn)一步分為兩大分支,其中單系的柑橘亞科與蕓香亞科的蕓香屬聚為1個(gè)分支,蕓香亞科和飛龍掌血亞科聚為另一分支,該兩亞科均不是單系,其中飛龍掌血亞科的香肉果屬,茵芋屬與蕓香亞科的白鮮屬,臭常山屬是最早分化出來的類群,其次是蜜茱萸屬和山油柑屬。

支持率(BS/PP)<100或<1顯示在分支的上方。圖1 基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)重建的蕓香科系統(tǒng)發(fā)育樹Support values (BS/PP) either <100 or <1 are shown above the branches.Fig.1 Phylogenetic tree of the Rutacese based on the chloroplast genome data

蕓香亞科和飛龍掌血亞科之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系很大程度上是混合的,模式屬蕓香屬既不屬于蕓香亞科也不屬于飛龍掌血亞科,而是與柑橘亞科的關(guān)系更為密切,這與其他的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果基本一致。

2.3 花椒屬及其近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

所有的花椒屬物種聚為1個(gè)單系(BS=100%,PP=1)。黃檗屬和吳茱萸屬與花椒屬(Zanthoxylum)類群形成姊妹關(guān)系(BS=100%,PP=1),飛龍掌血嵌套于花椒屬內(nèi),這與Appelhans等[1]研究結(jié)果一致,2個(gè)屬應(yīng)該進(jìn)行合并。來自印度洋群島的2個(gè)花椒物種(Z.madagascariense和Z.paniculatum)最早分化出來,為花椒屬物種的基部類群,飛龍掌血屬物種飛龍掌血嵌套于花椒屬分支中,與尖葉花椒、石山花椒、青花椒和來自南太平洋群島湯加的Z.pinnatum物種形成姊妹關(guān)系。來自南太平洋群島的Z.tragodes位于另1個(gè)亞分支的基部,與其他花椒物種形成姊妹關(guān)系,各分支有較高的支持率。

3 討 論

根據(jù)進(jìn)化樹,蕓香亞科和飛龍掌血亞科之間的關(guān)系很大程度上是混合的,模式屬蕓香屬不屬于蕓香亞科和飛龍掌血亞科,而與柑橘亞科關(guān)系更密切(圖1)。蕓香亞科、飛龍掌血亞科和柑橘亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系很大程度上不符合根據(jù)形態(tài)來定義蕓香科植物的恩格勒分類體系[4]。該研究的結(jié)果與最近基于幾個(gè)葉綠體和核基因標(biāo)記重建的蕓香科系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果[5-6]基本一致,但該研究的系統(tǒng)發(fā)育樹具有相對較高的支持率。因此,傳統(tǒng)的亞科分類并不能反映蕓香科的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。最近,有研究學(xué)者提出將柑橘亞科、巨盤木亞科、蕓香亞科和飛龍掌血亞科合并。其中,柑橘亞科、蕓香亞科和飛龍掌血亞科之間的關(guān)系非常密切,該研究的分子系統(tǒng)研究證實(shí)了這一點(diǎn)。遺憾的是,在該研究中沒有收集到巨盤木亞科的材料,為了全面解決中國蕓香科的分類學(xué)問題,在未來的分析中還需要加入巨盤木屬(Flindersia)物種。

黃檗屬(Phellodendron)、吳茱萸屬(Tetradium)和飛龍掌血屬(Toddalia)曾一直被認(rèn)為是花椒屬的近親屬,并形成1個(gè)單系分支[8]。Poon等[7]和Groppo等[8]指出,花椒屬和飛龍掌血屬是姊妹類群關(guān)系,而黃檗屬則嵌套在吳茱萸屬內(nèi)。該研究結(jié)果表明,黃檗屬和吳茱萸屬形成1個(gè)亞分支,彼此形成姊妹關(guān)系。雖然黃檗屬和吳茱萸屬在果實(shí)結(jié)構(gòu)上有很大的不同(前者是開裂的蓇葖果,后者是肉質(zhì)核果),但Hartley[27]發(fā)現(xiàn)根據(jù)植物營養(yǎng)物質(zhì)或雄蕊材料是不可能區(qū)分開這2個(gè)屬。先前的分子研究也表明這2個(gè)屬有密切的親緣關(guān)系[7,28]。在本研究中,基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也支持黃檗屬和吳茱萸屬的姐妹群關(guān)系(BS=100%,PP=1)。花椒屬和單屬單種的飛龍掌血物種形成另1個(gè)亞分支(BS=100%,PP=1)。花椒屬和飛龍掌血屬的相似性不僅得到了分子數(shù)據(jù)的支持,而且化學(xué)特征[7,28]也表明二者具有較近的親緣關(guān)系。在過去的分子系統(tǒng)發(fā)育研究中,飛龍掌血屬被認(rèn)為可能與花椒屬是姊妹關(guān)系,或者嵌套在花椒屬內(nèi)[29]。此外,Appelhans等[29]提出將飛龍掌血(Toddaliaasiatica)的拉丁名改為Zanthoxylumasiatica(L.) Appelhans,Groppo &J.Wen,comb.nov。該研究結(jié)果表明,飛龍掌血(T.asiatica)嵌套在花椒屬內(nèi),證實(shí)了飛龍掌血屬是花椒屬譜系的一部分,支持將這2個(gè)屬合并。

該研究利用高通量測序技術(shù)完成了蕓香科12個(gè)物種葉綠體基因組測序、組裝和注釋,并基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)獲得了高分辨率的蕓香科下及關(guān)鍵屬間的系統(tǒng)發(fā)育樹,雖然豐富了蕓香科的遺傳資源,加深了對蕓香科植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的理解,但遺憾的是,在該研究中未包括巨盤木亞科物種的材料,基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建蕓香科植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系還不夠全面,在以后研究中需要加入該亞科的物種,利用更多的基因組數(shù)據(jù)來挖掘和完善蕓香科的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。