淫羊藿苷通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

徐拓， 王潔， 韋小畢， 陸儒鳳

（1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 百色 533000；2右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy）是糖尿病常見且危害嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，當(dāng)前我國成年糖尿病人群中約20%~40%合并有糖尿病腎病，其已發(fā)展為慢性腎臟病和終末期腎病的主要病因，嚴(yán)重危害人類生命健康［1-2］。糖尿病腎病的主要病理改變包括腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小管間質(zhì)纖維化等。在糖尿病腎病的病理過程中，腎小管上皮細(xì)胞在持續(xù)高糖（high glucose， HG）環(huán)境下形態(tài)受損，出現(xiàn)細(xì)胞表型改變即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）促使腎小管間質(zhì)纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生和沉積，影響腎臟正常功能［3-4］。因此，深入研究糖尿病腎病中腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

淫羊藿苷（icariin， ICA）取自中藥淫羊藿，是其關(guān)鍵活性成分之一，具備補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕及活絡(luò)氣血等功效［3-4］。研究表明，其對心肝腎等多器官保護(hù)作用顯著，在腎纖維化防治方面療效確切［6］。目前尚未見ICA對HG誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞作用及機(jī)制的研究報(bào)道。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)功能的重要信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)，HG環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT通路可被激活，促進(jìn)EMT發(fā)生［7］。ICA能否通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響HG誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT過程及EMT介導(dǎo)的糖尿病腎病發(fā)生，目前尚不清楚。因此，本研究擬通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討ICA對HG誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞EMT的作用及其與PI3K/AKT通路的關(guān)系。

材料和方法

1 細(xì)胞和主要試劑

人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2（CL-0109）和胎牛血清（貨號(hào)164210）購于武漢普諾賽有限公司；CCK-8試劑盒（貨號(hào)HY-K0301）、ICA（貨號(hào)HY-N0014）和PI3K抑制劑LY294002（貨號(hào)HY-10108）購于Med-ChemExpress；AKT激活劑SC79（貨號(hào)SF2730）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)液（Gibco）；D-葡萄糖（貨號(hào)A600219）購于上海生工股份有限公司；BCA試劑盒（貨號(hào)HRX0121）和ECL試劑盒（貨號(hào)HRD0815）購于福建荷瑞生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)MR05101M）和RT-qPCR試劑盒（貨號(hào)MQ10301S）購于莫納生物科技有限公司；RIPA裂解液（貨號(hào)R0010）購于北京索萊寶公司；通用型抗體稀釋液（貨號(hào)PS119）和SDS-PAGE試劑盒（貨號(hào)PG211）購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）抗體（貨號(hào)AF1032）、上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體（貨號(hào)AF0131）、AKT抗體（貨號(hào)AF6261）和p-AKT抗體（貨號(hào)AF0016）購于江蘇親科生物研究中心有限公司；PI3K抗體（貨號(hào)T40115F）和p-PI3K抗體（貨號(hào)T40116F）購于上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司；βactin抗體（貨號(hào)GB15003）和IgG Ⅱ抗（貨號(hào)GB23303）購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的HK-2細(xì)胞接種在裝有DMEM低糖培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右融合時(shí)開始傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 HK-2細(xì)胞于6孔板貼壁后，生長至70%~80%融合時(shí)，進(jìn)行無血清培養(yǎng)液同步化處理，將細(xì)胞分為正常對照（normal control， NC）組（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、高滲（hyperosmolarity， OSM）組（5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇）、HG組（30 mmol/L D-葡萄糖）、低劑量ICA（low-dose ICA， LICA）組（30 mmol/L D-葡萄糖+10 μmol/L ICA）、高劑量ICA（high-dose ICA， H-ICA）組（30 mmol/L D-葡萄糖+40 μmol/L ICA）、H-ICA+SC79組（30 mmol/L D-葡萄糖+40 μmol/L ICA+10 μmol/L SC79）和LY294002組（30 mmol/L D-葡萄糖+10 μmol/L LY294002）。各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞加入96孔板中，每孔100 μL（約3 000個(gè)細(xì)胞）。放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)液進(jìn)行同步化饑餓處理，按NC組、OSM組、HG組、L-ICA組和H-ICA組進(jìn)行分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組藥物干預(yù)48 h后，加入CCK-8溶液（每孔10 μL），37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長檢測各孔吸光度。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞生長至70%~80%融合時(shí)更換無血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓處理，按2.3分成5組。各組藥物干預(yù)48 h，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 待接種至6孔板內(nèi)細(xì)胞生長密度達(dá)90%融合時(shí)，于6孔板內(nèi)中間位置用10 μL槍頭尖部從孔一端向另一端垂直劃痕，PBS洗去脫壁細(xì)胞確保劃痕間隙清晰。按2.3分成5組，各組藥物干預(yù)24 h，倒置顯微鏡觀察0和24 h的劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

2.6 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至6孔板中，按照NC組、OSM組、HG組、L-ICA組和HICA組5組，以及NC組、HG組、H-ICA組、H-ICA+SC79組和LY294002組5組，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。藥物干預(yù)48 h后收集各組細(xì)胞，通過Trizol試劑分別提取各組總RNA并測算濃度；溶解稀釋引物，實(shí)驗(yàn)所用PCR引物序列見表1；使用Monad公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，通過RT-qPCR擴(kuò)增目的片段，其中逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增均采用20 μL反應(yīng)體系，選擇β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參照，mRNA表達(dá)量均以2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表1 PCR引物序列Table 1. PCR primer sequences

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至6孔板中，按2.6分組實(shí)驗(yàn)，藥物干預(yù)48 h后收集各組細(xì)胞，冰上提取各組總蛋白并通過BCA法檢測蛋白總濃度。取變性后蛋白30 μg上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉液封閉30 min后加入稀釋的Ⅰ抗（E-cadherin、α-SMA、AKT、p-AKT、和β-actin抗體，1∶1 000；PI3K和p-PI3K抗體，1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后放入稀釋的Ⅱ抗中室溫孵育2 h。將ECL顯示液滴在膜上，通過凝膠成像系統(tǒng)顯影獲取圖像，使用ImageJ軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ICA對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，OSM組細(xì)胞活力無顯著改變，而HG組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05），表明HG能顯著抑制HK-2細(xì)胞活力；與HG組比較，不同劑量ICA組細(xì)胞活力均顯著升高（P<0.05）；而H-ICA組相較于L-ICA組，細(xì)胞活力更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力的影響Table 2. Effect of icariin（ICA） on the viability of high glucose（HG）-treated HK-2 cells （Mean±SD. n=3）

2 ICA對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖1可見，NC組細(xì)胞形態(tài)似橢圓形或圓形，細(xì)胞間連接緊密，呈鋪路石樣；HG組部分細(xì)胞呈長梭狀，細(xì)胞間隙明顯變大；經(jīng)不同劑量ICA干預(yù)后，長梭狀細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向于正常。

Figure 1. Effect of icariin （ICA） on the morphology of high glucose （HG）-treated HK-2 cells （×100）.圖1 淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響

3 ICA對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞遷移能力的影響

由圖2可見，與NC組比較，HG組HK-2細(xì)胞遷移率顯著增加（P<0.05）；與HG組比較，不同劑量ICA組細(xì)胞遷移率均顯著降低（P<0.05）；H-ICA組相較于L-ICA組，細(xì)胞遷移率更低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Figure 2. Effect of icariin （ICA） on the migration ability of high glucose （HG）-treated HK-2 cells （×40）. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group； △P<0.05 vs L-ICA group.圖2 淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞遷移能力的影響

4 ICA對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響

由圖3可見，與NC組比較，HG組細(xì)胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與HG組比較，不同劑量ICA均可下調(diào)HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)，并上調(diào)細(xì)胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05）；與L-ICA組比較，H-ICA組細(xì)胞中α-SMA和E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Figure 3. Effect of icariin （ICA） on the mRNA and protein expression of epithelial-mesenchymal transition-related indicators in high glucose （HG）-treated HK-2 cells. A： RT-qPCR detection of the relative mRNA expression of α-smooth muscle actin （α-SMA）and E-cadherin； B： Western blot detection of the protein expression of α-SMA and E-cadherin. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group； △P<0.05 vs L-ICA group.圖3 淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

5 ICA對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

如圖4所示，與NC組比較，HG組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白水平升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著升高（P<0.05）；與HG組相比，不同劑量ICA干預(yù)后，細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著下降（P<0.05）；與L-ICA組比較，H-ICA組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Figure 4. Effect of icariin （ICA） on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in high glucose （HG）-treated HK-2 cells.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group； △P<0.05 vs L-ICA group.圖4 淫羊藿苷對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

6 AKT激活劑SC79和PI3K抑制劑LY294002對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響

與H-ICA組比較，H-ICA+SC79組細(xì)胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.05），表明AKT通路激活劑逆轉(zhuǎn)了ICA對細(xì)胞EMT的阻斷作用；與HG組比較，LY294002組細(xì)胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見圖5。

Figure 5. Effects of AKT activator SC79 and PI3K inhibitor LY294002 on the mRNA and protein expression of EMT-related indicators in high glucose （HG）-induced HK-2 cells. A： RT-qPCR detection of the relative mRNA expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and E-cadherin； B： Western blot detection of the protein expression of α-SMA and E-cadherin. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group ； #P<0.05 vs HG group； ☆P<0.05 vs H-ICA group.圖5 AKT激活劑和PI3K抑制劑對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

7 AKT激活劑SC79和PI3K抑制劑LY294002對HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

如圖6所示，與H-ICA組比較，H-ICA+SC79組細(xì)胞中p-AKT/AKT比值顯著升高（P<0.05）；與HG組相比，LY294002組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均顯著下降（P<0.05）。

Figure 6. Effects of AKT activator SC79 and PI3K inhibitor LY294002 on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in high glucose （HG）-induced HK-2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group；☆P<0.05 vs H-ICA group.圖6 AKT激活劑和PI3K抑制劑對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討論

糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，由慢性高血糖損害腎臟引發(fā)，最終導(dǎo)致腎功能下降，伴有高致殘率和致死率［8-9］。腎小管間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病的主要病理改變之一，越來越多證據(jù)顯示腎小管上皮細(xì)胞的EMT在腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。在此過程中，受損的腎小管上皮細(xì)胞失去其上皮表型，并獲得間充質(zhì)細(xì)胞新特征，致使上皮細(xì)胞黏附性降低，α-SMA增多，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑，腎小管基底膜破損，增強(qiáng)了細(xì)胞遷移和侵襲能力［10］。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT體外模型，HG作用細(xì)胞48 h后，與對照組比較，HG組細(xì)胞呈長梭狀，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞增殖水平降低、細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞中α-SMA水平升高，E-cadherin水平降低，表明體外細(xì)胞模型成功建立，腎小管上皮細(xì)胞顯著發(fā)生EMT。

ICA被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞增殖、抗癌和腎臟保護(hù)作用［11-13］。趙錦等［14］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠模型中，ICA可發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，從而減輕腎損傷；Chen等［6］在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的慢性腎纖維化小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)ICA能夠通過抑制促炎因子釋放，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕腎纖維化。既往研究表明，ICA對成骨細(xì)胞、人牙周膜細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對多種腫瘤細(xì)胞如卵巢癌細(xì)胞A2780和骨肉瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用［15］；文艷梅等［16］發(fā)現(xiàn)，ICA能顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，加速細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌功效。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞模型中α-SMA水平升高，E-cadherin水平降低，細(xì)胞形態(tài)趨向長梭狀成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，提示細(xì)胞已發(fā)生EMT。經(jīng)ICA干預(yù)后α-SMA水平下降，E-cadherin水平升高，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向正常，細(xì)胞活力增強(qiáng)，遷移能力受抑制，提示ICA可顯著阻斷HG誘發(fā)的EMT進(jìn)程，由此推測ICA可能通過調(diào)控細(xì)胞活力影響EMT進(jìn)程。

PI3K/AKT通路是體內(nèi)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)功能的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細(xì)胞可響應(yīng)胞外信號(hào)促使PI3K發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步激活其下游因子AKT，通過活化的AKT介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種生理功能［17］。HG環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT和PI3K/Akt通路過度激活密切相關(guān)。胡濤［7］等發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-23b能夠抑制PI3K/AKT通路激活，從而抑制HG誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；孫蘭等［18］通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ促進(jìn)PTEN表達(dá)，抑制PI3K/AKT通路活化，進(jìn)而抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，HG組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高，表明HG刺激會(huì)增加PI3K/AKT信號(hào)通路的磷酸化水平，導(dǎo)致細(xì)胞功能損害。ICA已被證實(shí)與PI3K/AKT信號(hào)通路緊密相關(guān)，可通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路干預(yù)肺纖維化、食管癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［19-20］。本研究中，ICA可使HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著降低，阻斷EMT過程，與上述研究結(jié)果相似，表明在HG誘導(dǎo)的EMT體外模型中，ICA可以調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路。為了明確ICA能否通過調(diào)控PI3K/AKT通路抑制EMT過程。我們加入了通路激活劑SC79和抑制劑LY294002進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示LY294002明顯降低了細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值，顯著阻斷EMT過程；而SC79顯著提升了p-AKT/AKT比值，并逆轉(zhuǎn)了ICA對EMT的阻斷作用。

綜上所述，ICA可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活，抑制HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT進(jìn)程。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性，本次研究未涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將在動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證。