白 晨 張 昊 盛宇飛 哈斯額爾敦* 敖長(zhǎng)金 張喜勝
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018;2.錫林浩特市鼎安生物科技有限公司,錫林浩特 026000)
在畜禽營(yíng)養(yǎng)研究中,飼用肽類(lèi)的研究主要集中于植物源肽(如大豆肽等)或動(dòng)物源肽對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃的調(diào)控以及對(duì)單胃動(dòng)物免疫和抗氧化能力的調(diào)控等方面,并證實(shí)其具有抗菌、抗炎、提高生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì)等作用[1-5]。作為小麥蛋白的深加工產(chǎn)品,小麥低聚肽含有較高含量的谷氨酸和較為豐富的支鏈氨基酸,具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、提高肉羊生長(zhǎng)性能等作用[6-8],是一種較好的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)劑。本課題前期研究表明,小麥低聚肽可以提高肉羊的日增重、降低料重比、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、改變小腸形態(tài)結(jié)構(gòu),并從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的角度探討了小麥低聚肽對(duì)肉羊生長(zhǎng)性能的影>響[8]。另有體外試驗(yàn)表明,瘤胃液中添加小麥低聚肽可以提高氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白濃度,促進(jìn)瘤胃發(fā)酵,提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率[9]。瘤胃微生物的群落變化直接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化,進(jìn)而影響肉羊的肉品質(zhì)、屠宰性能等重要指標(biāo),然而目前關(guān)于小麥低聚肽對(duì)肉羊瘤胃微生物群落的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)分析飼喂小麥低聚肽對(duì)肉羊瘤胃微生物群落的改變,觀測(cè)其對(duì)屠宰性能和肉品質(zhì)的影響,旨在完善肉羊飼糧添加小麥低聚肽的系統(tǒng)性研究,為肉羊養(yǎng)殖中小麥低聚肽的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
飼養(yǎng)試驗(yàn)于2021年11月至2022年1月進(jìn)行。采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),選取4月齡、檢疫合格、平均體重35 kg、健康的小尾寒羊公羊30只,隨機(jī)分為2組,即對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)飼糧)和試驗(yàn)組(飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.3%小麥低聚肽),每組15只。飼喂量依據(jù)本課題組呂可欣等[9]的研究結(jié)果確定。羊只每日晨飼前將小麥低聚肽混于少量全混合日糧(TMR)中優(yōu)先飼喂,待采食完成后再補(bǔ)齊剩余TMR。試驗(yàn)期共75 d,包括預(yù)試期15 d,正試期60 d。
試驗(yàn)所用小麥低聚肽是以谷朊粉為原料進(jìn)行酶解制備的成品,由錫林浩特市某公司提供,主要含有谷氨酸(28.78%)、亮氨酸(5.14%)、異亮氨酸(2.54%)、蛋氨酸(1.16%)、纈氨酸(2.82%)、苯丙氨酸(3.91%)、賴(lài)氨酸(1.14%)、甘氨酸(2.64%)。
試驗(yàn)開(kāi)始前,對(duì)羊舍進(jìn)行分隔、消殺、清潔料槽、安裝飲水裝置,確保分圈飼養(yǎng)的2組條件、環(huán)境等一致。羊只每日08:00和16:00各飼喂1次,根據(jù)剩料情況及時(shí)調(diào)整下次供料量,羊只自由飲水。試驗(yàn)期所用飼糧采用TMR形式進(jìn)行飼喂,基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1,飼糧營(yíng)養(yǎng)水平符合《肉羊營(yíng)養(yǎng)需要量》(NY/T 816—2021)的要求,飼糧中的粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)、總磷(TP)含量的測(cè)定依據(jù)《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[10]。試驗(yàn)期每天清理羊舍、料槽、水槽,早、晚各換水1次,保證羊舍衛(wèi)生條件和試驗(yàn)羊只健康狀況。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %
在正試期第60天,每組選擇6只檢疫合格、體況相近的肉羊,禁食、稱(chēng)重后屠宰。屠宰后稱(chēng)胴體重,測(cè)定背膘厚度,描繪并計(jì)算眼肌面積,測(cè)定背最長(zhǎng)肌pH。另取100 g左右的背最長(zhǎng)肌樣品用于檢測(cè)其他肉品質(zhì)指標(biāo)。羊只屠宰后取瘤胃內(nèi)容物,用4層紗布過(guò)濾得到瘤胃液,取20 mL瘤胃液分裝于2個(gè)10 mL凍存管內(nèi),迅速放入液氮保存,帶回實(shí)驗(yàn)室后存放入-80 ℃冰箱保存,用于測(cè)定瘤胃菌群結(jié)構(gòu)。
1.3.1 屠宰性能測(cè)定
羊只禁食12 h后屠宰,屠宰前稱(chēng)重為宰前活重(kg);羊只屠宰放血后剝?nèi)ッ?去除頭、蹄和臟器,保留腎臟及腎周脂肪后稱(chēng)重為胴體重(kg);屠宰率為胴體重和宰前活重之比,即:屠宰率(%)=胴體重/宰前活重×100;采用游標(biāo)卡尺測(cè)定第12~13根肋骨間眼肌中部正上方脂肪組織厚度,即為背膘厚度(mm);采用硫酸紙畫(huà)出胴體第12~13根肋骨間對(duì)應(yīng)的腰椎橫斷面眼肌的輪廓,再計(jì)算輪廓面積,即為眼肌面積(cm2)。
1.3.2 羊肉品質(zhì)測(cè)定
pH測(cè)定:羊只屠宰后45 min,選擇每只試驗(yàn)羊背最長(zhǎng)肌相同部位樣品,用無(wú)菌手術(shù)刀在樣品上劃一小口,然后將校準(zhǔn)后的pH計(jì)的玻璃電極插入測(cè)定pH,即pH45 min;將樣品放置于4 ℃的冰箱保存24 h后,采用相同方法測(cè)定相同位置的pH,即pH24 h。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。
肉色分析:取每只試驗(yàn)羊相同部位的背最長(zhǎng)肌,選擇3個(gè)點(diǎn)使用OPTO-STAR肉色測(cè)定儀測(cè)定亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值。各樣品測(cè)定3次后取平均值。
剪切力測(cè)定:采用CL-ML3肌肉嫩度儀進(jìn)行測(cè)定。取各羊只相同部位背最長(zhǎng)肌樣品,置于4 ℃冰箱過(guò)夜后,將筋膜和脂肪除去,切成3 cm3左右的肉塊,在80 ℃水浴鍋中加熱30 min,待中心溫度達(dá)到70 ℃后取出樣品,將表面水分用濾紙吸干并冷卻至室溫,使用圓形取樣器取樣,測(cè)定剪切力。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。
蒸煮損失測(cè)定:取各羊只相同部位背最長(zhǎng)肌30 g左右,將肌外膜和脂肪剔除,稱(chēng)重并記錄。將樣品在80 ℃水浴鍋中加熱30 min,取出樣品冷卻30 min后稱(chēng)重并記錄。按照如下公式計(jì)算蒸煮損失:
蒸煮損失(%)=[(煮前樣品重-煮后
樣品重)/煮前樣品重]×100。
失水率測(cè)定:取各羊只相同部位背最長(zhǎng)肌樣品,平置后用直徑5 cm的圓形取樣器于樣品中心部位取厚約1 cm的樣品,稱(chēng)重并記錄。樣品上下各放置12層中性濾紙,保證樣品處于中央位置,在35 kg的壓力下持續(xù)5 min,撤去外力,稱(chēng)重并記錄。按照如下公式計(jì)算失水率:
失水率(%)=[(樣品重-失水后樣品重)/
樣品重]×100。
1.3.3 瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析
瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析委托上海中科新生命科技有限公司進(jìn)行。對(duì)瘤胃液微生物DNA進(jìn)行提取,并進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。對(duì)選定的V3~V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進(jìn)行質(zhì)檢,文庫(kù)質(zhì)檢合格后,使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2019進(jìn)行初步整理后,使用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性分析,定義P<0.05為差異顯著,0.05≤P≤0.10為差異有顯著的趨勢(shì)。
由表2可知,與對(duì)照組相比,飼糧中添加小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊的宰前活重、胴體重和屠宰率無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組背膘厚度顯著增加(P<0.05),眼肌面積無(wú)顯著變化(P>0.05)。
表2 小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊屠宰性能的影響Table 2 Effects of wheat oligopeptides on slaughter performance of small-tailed Han sheep
由表3可知,試驗(yàn)組背最長(zhǎng)肌肉色b*值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),L*和a*值與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。背最長(zhǎng)肌pH45 min、pH24 h在2組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)照組背最長(zhǎng)肌剪切力和失水率顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05),試驗(yàn)組蒸煮損失有低于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.09)。
表3 小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊肉品質(zhì)的影響Table 3 Effects of wheat oligopeptides on meat quality of small-tailed Han sheep
2.3.1 操作分類(lèi)單元(OTU)維恩(Venn)圖
由圖1可知,在相似度97%的水平下,2組樣品中總共含有2 791個(gè)OTU,其中共有OTU為1 927個(gè),占OTU總數(shù)的69.04%,對(duì)照組獨(dú)有OTU為405個(gè),試驗(yàn)組獨(dú)有OTU為459個(gè),分別占OTU總數(shù)的14.51%和16.45%;相比于對(duì)照組,試驗(yàn)組OTU數(shù)目相對(duì)較多。
C代表對(duì)照組,T代表試驗(yàn)組。C represents the control group, and T represents the experimental group.圖1 操作分類(lèi)單元Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU
2.3.2 alpha多樣性分析
由表4可知,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)均無(wú)顯著變化(P>0.05)。
表4 小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群alpha多樣性的影響Table 4 Effects of wheat oligopeptides on rumen microflora alpha diversity of small-tailed Han sheep
2.3.3 小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群組成的影響
從本試驗(yàn)樣本細(xì)菌中共檢出21個(gè)門(mén)、32個(gè)綱、59個(gè)目、107個(gè)科、235個(gè)屬、115個(gè)種。
由表5可知,在細(xì)菌門(mén)水平上,對(duì)照組相對(duì)豐度占比在1%以上的菌門(mén)有擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria),試驗(yàn)組相對(duì)豐度在1%以上的菌門(mén)有擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和螺旋體門(mén);試驗(yàn)組擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.08),藍(lán)菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其余菌門(mén)的相對(duì)豐度在2組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表5 小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊瘤胃主要菌門(mén)相對(duì)豐度的影響Table 5 Effects of wheat oligopeptides on relative abundances of major bacterial phyla in rumen of small-tailed Han sheep %
由表6可知,在細(xì)菌屬水平上,對(duì)照組和試驗(yàn)組相對(duì)豐度較高的菌屬均是理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae RC9 gut group)和普雷沃氏菌屬1(Prevotella1);試驗(yàn)組丁酸弧菌屬2(Butyrivibrio2)的相對(duì)豐度有低于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.10),其他菌屬的相對(duì)豐度在2組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表6 小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊瘤胃主要菌屬相對(duì)豐度的影響Table 6 Effects of wheat oligopeptides on relative abundances of major bacterial genera in rumen of small-tailed Han sheep %
低聚肽類(lèi)物質(zhì)含有2~10氨基酸,由于分子質(zhì)量較小,易于消化[11],是提高飼料利用效率、促進(jìn)高精料條件下反芻動(dòng)物瘤胃微生物活性的有效飼料添加劑[3]。目前關(guān)于植物來(lái)源肽的研究較為廣泛。前人研究表明,棉籽蛋白來(lái)源肽顯著提高了育肥牦牛的平均日增重,顯著降低了料重比[5];大豆肽顯著提高了泌乳奶牛的產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量[2];大豆肽還顯著提高了肉雞胸肌的pH,降低了失水率,改善了肉色[12]。小麥低聚肽具有較好的調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)等作用[6,13]。本研究結(jié)果表明,小麥低聚肽具有改善小尾寒羊屠宰性能與肉品質(zhì)的作用。
本試驗(yàn)中,飼喂小麥低聚肽雖沒(méi)有顯著影響小尾寒羊的宰前活重、胴體重、屠宰率,但顯著增加了背膘厚度。此外,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組小尾寒羊背最長(zhǎng)肌蒸煮損失有降低的趨勢(shì),失水率顯著降低,綜合失水率與蒸煮損失指標(biāo)可以反映肌肉的保水能力[14],說(shuō)明小麥低聚肽增強(qiáng)了肌肉的保水能力,對(duì)肉的保鮮具有促進(jìn)作用。包志碧[15]指出,肉羊胴體背膘厚度的增加有助于降低肌肉水分的流失,本試驗(yàn)結(jié)果也間接證明了此觀點(diǎn)。失水率也是反映肉風(fēng)味的重要指標(biāo),失水率升高導(dǎo)致水分流失增加,則會(huì)降低肉的風(fēng)味[16]。剪切力是反映肉嫩度的指標(biāo),也與肉的保水能力相關(guān),剪切力降低則嫩度提高。研究表明,飼糧添加8 g/d抗菌肽顯著降低了荷斯坦公牛背最長(zhǎng)肌的剪切力[17]。本試驗(yàn)中,飼喂小麥低聚肽顯著降低了小尾寒羊背最長(zhǎng)肌的剪切力,說(shuō)明小麥低聚肽有助于提高羊肉的嫩度。
肉色指標(biāo)不僅體現(xiàn)了肌肉的外觀及理化特性,還可反映肌肉的營(yíng)養(yǎng)特性。肉色指標(biāo)中的L*值反映了肌肉的光澤、亮度,并與肌肉的保水性呈負(fù)相關(guān)[18],a*值反映了肌肉中肌紅蛋白的含量,b*值反映了肌肉中脂肪以及色素的沉積情況。本試驗(yàn)中,飼喂小麥低聚肽并未顯著改變小尾寒羊背最長(zhǎng)肌的L*值,但其在數(shù)值上有降低的趨勢(shì),可能與肌肉的保水性增加有關(guān)。背最長(zhǎng)肌a*值未發(fā)生顯著變化但b*值顯著增加,提示小麥低聚肽雖未影響肌肉肌紅蛋白的代謝,但可能影響肌肉脂肪酸的氧化,從而降低羊肉品質(zhì);羊肉pH45 min未受飼喂小麥低聚肽的影響,且2組羊肉的pH45 min均在正常剛屠宰肉的pH范圍內(nèi)[19],同時(shí)小麥低聚肽并未影響羊肉的pH24 h,且2組羊肉的pH24 h均符合屠宰24 h時(shí)pH的正常范圍[20]。
本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序共得到1 154 592條序列,序列平均長(zhǎng)度為420 bp,試驗(yàn)組與對(duì)照組的Coverage指數(shù)均超過(guò)了99%,說(shuō)明測(cè)序深度合理,能夠準(zhǔn)確地反映出瘤胃中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和種類(lèi)的多樣性[21]。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以用來(lái)評(píng)價(jià)瘤胃菌群的多樣性,Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可以用來(lái)評(píng)價(jià)瘤胃菌群的豐富度。本試驗(yàn)結(jié)果提示,飼喂小麥低聚肽對(duì)小尾寒羊瘤胃菌群的alpha多樣性無(wú)顯著影響。這與前人研究結(jié)果相近,黎凌鑠等[22]利用小肽與酵母培養(yǎng)物飼喂牦牛,對(duì)牦牛瘤胃微生物Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)無(wú)顯著影響。
擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是反芻動(dòng)物瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[1,23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)均為各組小尾寒羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),說(shuō)明小麥低聚肽并未改變小尾寒羊瘤胃優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的構(gòu)成。擬桿菌門(mén)對(duì)瘤胃內(nèi)非纖維物質(zhì)降解具有重要作用[24],飼喂小麥低聚肽使瘤胃中擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì),推測(cè)小麥低聚肽可能具有促進(jìn)飼糧中非纖維物質(zhì)降解的作用。陳蕓[25]在山羊飼糧中添加復(fù)合菌肽,發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌肽能夠通過(guò)提高擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度,綜合提高瘤胃對(duì)飼料的降解率。有研究指出,與蛋白質(zhì)和碳水化合物降解有關(guān)的普雷沃氏菌屬是瘤胃中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬[26]。本試驗(yàn)中,對(duì)照組與試驗(yàn)組小尾寒羊瘤胃內(nèi)的第一優(yōu)勢(shì)菌屬均為理研菌科RC9腸道群,第二優(yōu)勢(shì)菌屬均為普雷沃氏菌屬1。該結(jié)果與杜紅喜[27]的研究發(fā)現(xiàn)一致,即小尾寒羊瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬為理研菌科RC9腸道群和普雷沃氏菌屬1。此外,小麥低聚肽并未改變小尾寒羊瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度和順序。但有研究表明,飼糧中添加大豆肽顯著增加了奶牛瘤胃中理研菌科RC9腸道群的相對(duì)豐度[2]。另有研究指出,在育肥湖羊飼糧中添加800 g/t蜜蜂肽,瘤胃內(nèi)的第一優(yōu)勢(shì)菌屬由普雷沃氏菌屬1變?yōu)槔硌芯芌C9腸道群,而低劑量(200和400 g/t)添加800 g/t蜜蜂肽并無(wú)此現(xiàn)象[28]。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果不一致的可能原因是肽的來(lái)源與氨基酸組成不同。
瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的變化與畜禽生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)的改變緊密相關(guān)[14]。理研菌科RC9腸道群是促乙酸產(chǎn)生菌,與結(jié)構(gòu)性碳水化合物發(fā)酵相關(guān)[29]。本試驗(yàn)中,添加小麥低聚肽后,小尾寒羊瘤胃中理研菌科RC9腸道群的相對(duì)豐度未發(fā)生顯著變化,加之?dāng)M桿菌門(mén)的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì),表明小麥低聚肽可能通過(guò)調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)來(lái)加強(qiáng)瘤胃對(duì)非纖維類(lèi)物質(zhì)的消化。結(jié)合本課題前期研究發(fā)現(xiàn)的小麥低聚肽可提高小尾寒羊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率,增加育肥前期的平均日增重并降低料重比[8],加之本試驗(yàn)中小麥低聚肽的添加增加了背膘厚度,而背膘厚度體現(xiàn)了機(jī)體脂肪的沉積情況,與機(jī)體瘦肉率呈負(fù)相關(guān),提示小麥低聚肽可能通過(guò)調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善小尾寒羊的生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沉積代謝規(guī)律。由于本試驗(yàn)未觀測(cè)機(jī)體脂肪沉積情況,因此上述推測(cè)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
飼糧中添加小麥低聚肽可增加小尾寒羊的背膘厚度,改善羊肉的嫩度和保水能力,同時(shí)有提高瘤胃中擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度的趨勢(shì)。
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2023年11期