單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長性能、抗氧化能力和腸道形態(tài)結構的影響

徐朋濤 陳亞兵 陳 靖 何 來 劉誠傲 郭雙雙 張正帆** 丁斌鷹**

(1.武漢輕工大學,農副產品蛋白質飼料資源教育部工程研究中心,動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室,武漢 430023;2.天門市農業(yè)農村局,天門 431700)

壞死性腸炎是肉雞養(yǎng)殖中常見的傳染性消化道疾病,主要由A型和G型產氣莢膜梭菌引起,通常與球蟲病一起發(fā)生或由球蟲病繼發(fā)感染,造成肉雞食欲減退、腸道出血和潰瘍、腹瀉率增加,生長性能下降,急性感染可導致雞群大量死亡,造成巨大經濟損失[1-3]。在我國飼料禁抗、養(yǎng)殖過程限抗和減抗的時代背景下,尋找天然、綠色的飼料添加劑防控家禽壞死性腸炎迫在眉睫。單寧酸(tannic acid,TA)是一類多酚類化合物,廣泛存在于五倍子、栗木和高粱等植物中,具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腹瀉等多種功效[4]。研究表明,飼糧中添加水解單寧酸可通過改善營養(yǎng)物質消化吸收率提高飼料轉化效率,改善肉雞生長性能,還可以通過清除自由基降低氧化應激,提高肉雞抗氧化能力,并能夠防止肝臟代償性增大[5-8]。但是單寧酸是否能通過促進腸道發(fā)育和提高抗氧化能力改善球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染引起的壞死性腸炎尚不明確。因此,本研究旨在探討單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長性能、器官指數(shù)、血清生化指標、血清和肝臟抗氧化指標以及腸道形態(tài)結構的影響,為單寧酸對肉雞壞死性腸炎的防護提供一定數(shù)據(jù)參考和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

產氣莢膜梭菌由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC2030)提供。球蟲四價活疫苗購自佛山市某生物技術有限公司。水解單寧酸(含量≥80%)由湖北省某生物科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素完全隨機設計,選取平均體重為(46.40±0.40) g的1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞294只,隨機分為3組,分別為對照組(CON組)、混合感染組(CCP組)和單寧酸+感染組(CTA組),每組7個重復,每個重復14只,公母各占1/2。CON組、CCP組飼喂基礎飼糧,CTA組在基礎飼糧中添加1 000 mg/kg水解單寧酸,試驗期為28 d?；A飼糧參照《Arbor Acres Broiler Nutrition Specifications(2019)》并結合實際配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。其中,粗蛋白質(CP)、鈣(Ca)含量分別參照GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018的方法測定;分別參照GB/T 6437—2018與蘇琪等[9]的方法測定總磷(TP)和植酸磷(PP)含量,計算得出非植酸磷(NPP)含量;代謝能(ME)和可消化氨基酸含量根據(jù)《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2021年第32版)》中數(shù)據(jù)計算得出。在第7天和第10天,CCP組和CTA組每只雞按照球蟲疫苗制造商推薦劑量的30倍灌服1 mL球蟲懸液(滅菌生理鹽水配制,含3×104個孢子囊/mL),CON組灌服1 mL滅菌生理鹽水。試驗第16～20天,CCP組和CTA組每只雞每天灌服1 mL產氣莢膜梭菌新鮮菌液(活菌數(shù)為1×108CFU/mL),CON組灌服1 mL滅菌皰肉培養(yǎng)基。肉雞自由采食,充足飲水,按正常免疫程序進行免疫接種。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 樣品采集

試驗第14、21和28天從每個重復隨機選取接近平均體重的2只雞,用抗凝的真空采血管[抗凝劑:乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素鈉]翅下靜脈采血5 mL,采血后頸動脈放血致死。將血液常溫送至實驗室,4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min,取上清分裝于干凈的EP管中,置于-80 ℃冰箱冷凍儲存;使用剪刀和鑷子打開腹腔進行屠宰取樣,解剖分離出肝臟、脾臟、十二指腸、空腸、回腸、胸腺和法氏囊,將肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊剔除脂肪后進行稱重;再取十二指腸、空腸、回腸中段1 cm的腸段置于4%的多聚甲醛液中進行固定,然后將樣品送至武漢博士德生物工程有限公司進行組織石蠟包埋,制成蘇木精-伊紅(HE)染色切片;將剩余的十二指腸、空腸、回腸和肝臟樣品剪碎,用滅菌錫箔紙包好,標記后放入液氮速凍,之后取出保存于實驗室-80 ℃冰箱備用。

1.4 檢測指標和方法

1.4.1 生長性能

試驗期間每日以重復為單位記錄采食量和死亡情況,分別于14、21和28日齡以重復為單位稱取空腹狀態(tài)下肉雞體重,計算各重復的平均體重(ABW)、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。計算公式如下:

ABW=每階段肉雞總末重/雞數(shù);
ADFI=總采食量/試驗天數(shù);
ADG=總增重/試驗天數(shù);
F/G=ADFI/ADG。

1.4.2 器官指數(shù)

分別于14、21和28日齡屠宰肉雞,分離肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊,剔除周邊組織和脂肪,用濾紙擦干血水進行稱重,并計算器官指數(shù),計算公式為:

器官指數(shù)(%)=[器官重量(g)/

雞體重(g)]×100。

1.4.3 血清生化指標

使用日立7100全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、葡萄糖(glucose,GLU)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、鈣、磷、尿酸(uric acid,UA)含量以及γ-谷氨酰轉移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。

1.4.4 血清和肝臟抗氧化指標

采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒使用多功能酶標儀(Spectra Max M5,Molecular Devices,美國)測定血清和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(hydrogen peroxidase,CAT)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性和總抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)含量。

1.4.5 腸道形態(tài)結構

使用OLYMPSBX-41TF型光學顯微鏡對腸道組織切片進行觀察,應用HPISA-1000高清彩色病理圖文報告系統(tǒng)分析。每張腸道組織切片選取8～10個不同走向且相對完整的絨毛,測量該絨毛高度(VH)及其隱窩深度(CD),取平均值作為最終測量值,并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析,當組間差異顯著時,采用Duncan氏多重比較法進行組間差異顯著性分析。試驗結果以平均值±標準差表示,P<0.05表示差異顯著,0.05≤P<0.10表示差異有顯著的趨勢。

2 結果與分析

2.1 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長性能的影響

由表2可知,與CON組相比,球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染顯著降低了肉雞14、21和28日齡的ABW以及1～14日齡、15～21日齡和1～28日齡的ADG和ADFI(P<0.05),顯著提高了1～14日齡、15～21日齡和1～28日齡的F/G(P<0.05)。與CCP組相比,飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染造成的肉雞各階段生長性能下降無顯著改善作用(P>0.05)。

2.2 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞器官指數(shù)的影響

由表3可知,14日齡時,與CON組相比,CCP組肉雞肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05),胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著降低(P<0.05);CTA組肉雞各器官指數(shù)與CCP組差異不顯著(P>0.05)。21日齡時,CCP組肉雞胸腺指數(shù)顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。28日齡時,CCP組和CTA組肉雞脾臟指數(shù)顯著高于CON組(P<0.05);與CON組和CCP組相比,CTA組肉雞肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)。

表3 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞器官指數(shù)的影響 Table 3 Effects of tannic acid on organ indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens %

2.3 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清生化指標的影響

由表4可知,與CON組相比,CCP組肉雞14日齡血清ALB、TC和HDL含量顯著降低(P<0.05),21日齡血清GLU、HDL和Ca含量以及28日齡血清HDL含量顯著降低(P<0.05),21日齡血清GGT和LDH活性與28日齡血清磷(P)含量顯著升高(P<0.05)。CTA組對肉雞各日齡血清生化指標與CCP組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表4 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清生化指標的影響Table 4 Effects of tannic acid on serum biochemical indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

2.4 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清和肝臟抗氧化指標的影響

由表5可知,CCP組肉雞14日齡血清GSH-Px、CAT和T-SOD活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。與CON組相比,CCP組肉雞21日齡血清GSH-Px和CAT活性顯著降低(P<0.05);與CCP組相比,CTA組肉雞21日齡血清GSH-Px、CAT和T-SOD活性顯著升高(P<0.05)。CCP組肉雞28日齡血清CAT活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP組肉雞14和28日齡血清H2O2含量顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。

表5 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清抗氧化指標的影響Table 5 Effects of tannic acid on serum antioxidant indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

由表6可知,CCP組肉雞14日齡肝臟CAT活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05),同時肝臟MDA含量顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP肉雞組21日齡肝臟CAT和T-SOD活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP組肉雞28日齡肝臟T-SOD活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP組肉雞各日齡肝臟H2O2含量均顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。

表6 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞肝臟抗氧化指標的影響Table 6 Effects of tannic acid on liver antioxidant indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

2.5 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞腸道形態(tài)結構的影響

由表7可知,CTA組肉雞14日齡十二指腸VH和V/C顯著高于CON組和CCP組(P<0.05),同時十二指腸和空腸CD顯著低于CON組和CCP組(P<0.05)。與CON組,CCP組肉雞21和28日齡十二指腸、空腸、回腸VH和V/C顯著降低(P<0.05),同時十二指腸和空腸CD顯著增加(P<0.05);與CCP組相比,CTA組肉雞腸道形態(tài)結構得到改善。

表7 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞腸道形態(tài)結構的影響Table 7 Effects of tannic acid on intestinal morphology of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

3 討 論

3.1 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長性能的影響

球蟲感染可導致肉雞腸道黏膜損傷,破壞腸道穩(wěn)態(tài),易繼發(fā)感染產氣莢膜梭菌[2,10-11]。產氣莢膜梭菌可產生多種毒素,最終引起雞壞死性腸炎,導致營養(yǎng)物質消化利用率下降,飼料轉化率和體重降低[12-13]。本研究結果表明,混合感染球蟲和產氣莢膜梭菌后,肉雞生長性能下降,說明腸道損傷模型構建成功[14-15]。研究表明,飼糧中添加10～300 mg/kg原花青素、葡萄籽提取物和五倍子單寧酸能顯著改善肉雞的生長性能[16-18]。但也有研究表明1 000 ～2 000 mg/kg單寧酸會顯著降低肉雞的日增重和飼料轉化效率[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),1 000 mg/kg單寧酸不能改善球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染引起的肉雞生長性能下降,這與Choi等[21]和Xu等[22]的報道結果不一致。這些結果表明單寧酸的生物學效價可能呈劑量依賴效應,和單寧酸種類、提取工藝和飼糧結構密切相關。

3.2 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽的主要免疫器官,肝臟是機體脂肪代謝的重要場所。研究表明,球蟲感染和壞死性腸炎會導致肉雞腸黏膜損傷,引起肉雞腸道功能紊亂,使腸道細菌及其代謝產物易位進入肝臟[23-24]。Daneshmand等[25]研究發(fā)現(xiàn),產氣莢膜梭菌會刺激脾細胞導致T細胞繁殖發(fā)育。本試驗表明,球蟲感染后肉雞肝臟指數(shù)提高,法氏囊指數(shù)和胸腺指數(shù)降低,可能導致肉雞免疫力下降。本結果與童玉鑫等[7]的研究結果一致。而產氣莢膜梭菌感染顯著提高了肉雞胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),這與張元可[26]和陳鎖[27]的研究結果不一致。其原因可能是產氣莢膜梭菌刺激了胸腺和脾臟淋巴細胞繁殖發(fā)育,引起了肉雞的代償性調節(jié)。

3.3 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清生化指標的影響

血清TC、TG、LDL和HDL含量可以反映機體脂質代謝情況,過高或過低均會引起血脂異常,導致疾病發(fā)生[28]。本試驗中,混合感染球蟲和產氣莢膜梭菌顯著降低了肉雞血清TC和HDL含量,表明球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞后可能導致脂質代謝紊亂。LDH與細胞能量代謝和ATP的產生有關,細胞受損會使LDH釋放到細胞外,降低能量利用率[29]。本研究結果表明,球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染引起肉雞腸道炎癥,可能導致腸上皮細胞和免疫細胞損傷,從而導致LDH釋放增加。血清GGT活性能一定程度反映肝臟健康狀況,肝臟受損導致肝細胞細胞膜通透性增加,GGT活性升高[30-31]。本試驗結果表明,球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染可能引起肉雞肝功能紊亂,影響肝臟代謝和物質轉運,從而導致生長性能下降。此外,球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染降低了肉雞血清GLU和Ca含量,導致機體糖代謝紊亂,可能是肝臟功能、腎臟功能紊亂和壞死性腸炎引起的[32]。

3.4 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞抗氧化能力的影響

動物體內抗氧化酶活性和MDA含量可反映機體抗氧化能力強弱。已有研究證明,球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染可增加肉雞體內活性氧的產生,引起機體氧化應激[22]。Li等[33]和Zhao等[34]報道,球蟲和產莢膜梭菌感染肉雞血清和肝臟中CAT、SOD和GSH-Px等酶活性降低。與前人報道一致,本試驗結果表明,球蟲和產莢膜梭菌混合感染顯著降低了肉雞血清和肝臟GSH、CAT和T-SOD活性,提高了血清和肝臟MDA和H2O2含量。Zhang等[35]研究表明,250和500 mg/kg五倍子單寧酸改善了黃曲霉毒素B1感染肉雞的抗氧化能力。Xi等[5]研究發(fā)現(xiàn),250 mg/kg單寧酸可以降低黃曲霉毒素B1感染肉雞血清MDA含量,提高血清CAT和GSH-Px活性。結合以上研究結果可知,飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸可以改善球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染引起的肉雞抗氧化能力下降。

3.5 單寧酸對球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞腸道形態(tài)結構的影響

研究表明,球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染會造成肉雞小腸形態(tài)結構損傷,引起營養(yǎng)物質的消化吸收率下降[22,35-37]。李軍輝等[6]報道,飼糧中添加水解單寧酸顯著提高了肉雞十二指腸和空腸VH和V/C,降低了CD。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加17 mg/kg葡萄原花青素顯著改善了肉仔雞空腸形態(tài)結構。與前人報道一致,本研究發(fā)現(xiàn)球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染造成肉雞小腸形態(tài)結構受損,并且飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸能明顯改善球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞小腸形態(tài)結構。

4 結 論

球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染會造成肉雞生長性能下降、抗氧化能力降低和腸道形態(tài)結構損壞,盡管飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸不能改善球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染造成的肉雞生長性能下降,但是可以提高球蟲和產氣莢膜梭菌混合感染肉雞的抗氧化能力,修復腸道形態(tài)結構損傷。