蝴蝶蘭無菌播種組培快繁技術(shù)研究

鄭秋樺，黎棟然，潘燁鑫，漆 萍，巫躍君

（1.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.廣東藝景生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 韶關(guān) 512031）

蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬，為附生性蘭花，素有“洋蘭王后”之稱。新春時(shí)節(jié)，蝴蝶蘭植株從葉腋中抽出花梗，開出形如蝴蝶的花朵，獨(dú)特而優(yōu)美的姿態(tài)深受消費(fèi)者青睞。蝴蝶蘭原產(chǎn)于亞熱帶雨林地區(qū)，分布在印度尼西亞、菲律賓、泰國、馬來西亞及中國臺(tái)灣等地。通過人工調(diào)控各種因素使蝴蝶蘭于春節(jié)前開放，極大地滿足了國內(nèi)年宵花的市場需求。隨著近年來種植面積和產(chǎn)銷量增加，我國蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)得到跨越式發(fā)展，已逐漸成為全球蝴蝶蘭種苗供應(yīng)中心［1］。蝴蝶蘭的種子非常細(xì)小，不含有為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)的胚乳或其他組織，胚發(fā)育不完全，在自然條件下很難萌發(fā)［2］，因此蘭科種子的無菌培養(yǎng)是工廠化生產(chǎn)蘭花種苗的一條重要途徑。

文章在原有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整6-BA濃度，設(shè)置6-BA 濃度梯度，分別培養(yǎng)新雜交品種蝴蝶蘭種子（納博納交櫻桃番茄、納博納交矩寶橘子），研究不同6-BA 濃度下培養(yǎng)基對于誘導(dǎo)蝴蝶蘭種子原球莖形成的作用效果。通過設(shè)置不同6-BA濃度、NAA 濃度及不同添加物組合，探究其對誘導(dǎo)原球莖芽分化的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基的應(yīng)用價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 材料和試劑

材料：納博納交矩寶橘子果莢（取自蝴蝶蘭基地）、納博納交櫻桃番茄果莢（取自蝴蝶蘭基地）、椰子水、土豆、香蕉、蔗糖。

主要試劑：MS 培養(yǎng)基、1 mg/L 6-BA、1 mg/L KT、1 mg/L NAA、瓊脂粉、1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、蒸餾水、75%的酒精、0.1% HgCl2、無菌水、消毒液（工作臺(tái)）。

1.2 儀器和設(shè)備

電子秤、稱量紙、玻璃棒、大燒杯、小燒杯、2 mL移液管、洗耳球、電磁爐、鐵鍋、膠頭滴管、容量瓶、鉛筆、標(biāo)簽紙、量筒、培養(yǎng)瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、pH 試紙、紙巾、超凈工作臺(tái)、高溫消毒器、接種器械（解剖刀、剪刀、鑷子等）、無菌不銹鋼碟子、酒精燈、記號筆等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)試驗(yàn)

配制1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH。稱取MS 培養(yǎng)基粉溶解于蒸餾水后倒入大燒杯，分別量取適量的6-BA、KT、NAA 加入其中。在鍋中加入蒸餾水，蒸餾水潤洗燒杯3 次，中火煮至溶解，慢慢加入瓊脂粉，小火煮開后將蔗糖-瓊脂粉溶液倒入燒杯與其他混合溶液攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH 值。將混合溶液轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶定容，用量筒量取培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中，在標(biāo)簽紙上寫明配制日期、配制人、培養(yǎng)基類型并貼在培養(yǎng)瓶上。準(zhǔn)備好瓶裝蒸餾水、75%酒精、HgCl2和空培養(yǎng)瓶，除了酒精以外，所有培養(yǎng)瓶經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后冷卻待用。

1.3.2 無菌播種

開裂的果莢內(nèi)部往往存在微生物，因此需檢查果莢完整度。若果莢完好無損，則可以作為試驗(yàn)材料；若果莢已經(jīng)開裂或存在破損，則需要更換材料。用自來水沖洗果莢，摘除花瓣和花萼后用洗潔精洗滌，去除表面污漬和灰塵，接著用75%酒精擦拭，放在解剖盤中轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上，用解剖刀切除兩端多余部分后（方便操作，但不能露出內(nèi)部的種子）用鑷子轉(zhuǎn)到無菌瓶中。將75%酒精倒入放置果莢的無菌瓶中浸泡30 s，將果莢轉(zhuǎn)移到裝無菌水的瓶子中沖洗2 次［3］。用0.1%升汞浸泡果莢10～12 min，中途需搖晃瓶身，保證果莢被充分浸泡，用無菌水沖洗8 次后取出蒴果，置于托盤中［4］。取無菌紙將果莢表面的水分吸干，防止種子被粘住而影響播種。用解剖刀縱切，采用撒播法，用鑷子挑出大小一致的棉絮狀物體，將種子均勻撒播在培養(yǎng)基上，蓋好瓶蓋并貼上標(biāo)簽。每個(gè)濃度的培養(yǎng)瓶重復(fù)3 次，將培養(yǎng)基置于溫度26 ℃、光照強(qiáng)度1 500 lx、光照時(shí)長12 h/d 的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.3 原球莖芽分化誘導(dǎo)

在一定閾值內(nèi)，低濃度6-BA 和高濃度的NAA有利于誘導(dǎo)原球莖產(chǎn)生叢生芽［5］，因此就6-BA 和NAA 濃度設(shè)置了12 個(gè)對照組，如表1所示。

表1 原球莖芽誘導(dǎo)劑中不同6-BA和NAA濃度正交試驗(yàn)對照組

不同添加物對于原球莖的叢生芽誘導(dǎo)影響可能存在差異，設(shè)置4 個(gè)對照組可以降低成本，提高芽誘導(dǎo)效率，如表2所示。

表2 原球莖芽誘導(dǎo)劑中不同添加物對照組

在試驗(yàn)前分別配制各組培養(yǎng)基，高壓滅菌后放置冷卻備用。在無菌操作下用鑷子將母瓶中的原球莖轉(zhuǎn)移到無菌解剖盤中，由于每個(gè)無菌播種培養(yǎng)瓶中原球莖數(shù)量較多，完成一次母瓶的接種時(shí)間較長，且超凈工作室風(fēng)速較大，一次取出過多原球莖會(huì)導(dǎo)致部分原球莖失水粘住解剖盤，失去利用價(jià)值，因此接種時(shí)每次應(yīng)取出適量原球莖，一個(gè)母瓶中的原球莖分多次取出接種。分別將原球莖接種到各培養(yǎng)瓶中，每組接5 瓶，每瓶30 個(gè)原球莖，重復(fù)12 次。接種時(shí)應(yīng)將原球莖的突起一端朝下，凹陷或非突起的一端朝上，否則會(huì)導(dǎo)致原球莖長勢不佳，容易產(chǎn)生較多醌類物質(zhì)，導(dǎo)致原球莖壞死。將完成接種的培養(yǎng)瓶放置在溫度為26 ℃、光照強(qiáng)度1 500 lx、光照時(shí)長12 h/d 的環(huán)境中培養(yǎng)，觀察原球莖的生長狀態(tài)以及是否發(fā)生污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌播種原球莖誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果與分析

在一定范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中6-BA 濃度的提高，納博納交矩寶橘子蝴蝶蘭雜交種子萌發(fā)率也會(huì)有所提高。其中種子萌發(fā)的最適6-BA 濃度為≥4.5 mg/L。不同6-BA 濃度的培養(yǎng)基中原球莖中產(chǎn)生的醌類物質(zhì)明顯不同，除了4.0、4.5 mg/L 濃度6-BA 培養(yǎng)基外，其他濃度6-BA 培養(yǎng)基中原球莖都產(chǎn)生了較多醌類物質(zhì)。其中，添加1.5、2.0 mg/L 濃度的6-BA 培養(yǎng)基中的原球莖產(chǎn)生的醌類物質(zhì)最多，這些培養(yǎng)基中產(chǎn)生的醌類物質(zhì)能夠隨著時(shí)間的推移擴(kuò)散，短期內(nèi)不會(huì)對原球莖產(chǎn)生毒害。

該試驗(yàn)中，播種后4 d 內(nèi)種子膨大，50 d 后納博納交櫻桃番茄蝴蝶蘭雜交種子的萌發(fā)率依舊為0，經(jīng)過一段時(shí)間暗處理后出現(xiàn)零星的原球莖。推測可能是由于種子發(fā)育不良導(dǎo)致原球莖產(chǎn)生速度緩慢，或是該雜交品種蝴蝶蘭種子的萌發(fā)需要進(jìn)行暗處理。

2.2 原球莖芽分化誘導(dǎo)劑正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在一定濃度范圍內(nèi)，濃度較低的NAA 有利于納博納交矩寶橘子蝴蝶蘭雜交新品種原球莖的芽分化，其中最適NAA 濃度值為3.0 mg/L。本試驗(yàn)中設(shè)置不同6-BA 濃度的培養(yǎng)基中原球莖芽分化的情況大致表現(xiàn)為6-BA 濃度越高原球莖芽分化率越高，即促進(jìn)原球莖芽分化的最適6-BA 濃度≥0.5 mg/L。

在不同6-BA 和NAA 濃度組合的培養(yǎng)基中，原球莖中產(chǎn)生的醌類物質(zhì)的量存在差別。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色來看，本試驗(yàn)設(shè)置的組合中較低濃度的NAA 和6-BA 組合容易使原球莖產(chǎn)生有毒的醌類物質(zhì)。不同濃度6-BA 中原球莖產(chǎn)生的醌類物質(zhì)并無太大區(qū)別，結(jié)合第1 階段培養(yǎng)現(xiàn)象，推斷第2 階段中出現(xiàn)的現(xiàn)象是由于該培養(yǎng)階段培養(yǎng)基中6-BA 濃度梯度設(shè)置較小。不同濃度NAA 中原球莖產(chǎn)生的醌類物質(zhì)的區(qū)分較為明顯，低濃度的NAA 易使原球莖產(chǎn)生更多的醌類物質(zhì)，這些醌類物質(zhì)難以在培養(yǎng)基中擴(kuò)散開，對原球莖具有毒害作用，少數(shù)原球莖經(jīng)過30 d 培養(yǎng)后褐化死亡。由此得出，在誘導(dǎo)該新雜交品種蝴蝶蘭原球莖芽分化時(shí)需關(guān)注醌類物質(zhì)的產(chǎn)生情況，及時(shí)轉(zhuǎn)移原球莖。

2.3 原球莖芽誘導(dǎo)劑中加入不同添加物試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)表2 的試驗(yàn)條件依次進(jìn)行正交試驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 原球莖芽誘導(dǎo)劑中加入不同添加物試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可以得出，與空白對照組相比，添加了土豆、香蕉汁或椰子水的培養(yǎng)基會(huì)對原球莖芽形成產(chǎn)生促進(jìn)作用。其中，椰子水與土豆、香蕉汁相比促進(jìn)效果更為明顯。在這組試驗(yàn)中，香蕉汁、土豆和空白對照組中培養(yǎng)基未見顯色物質(zhì)，推測未產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量醌類物質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過配置含不同激素水平及添加物的培養(yǎng)基對納博納交櫻桃番茄和納博納交矩寶橘子2 種新雜交品種蝴蝶蘭種子和原球莖進(jìn)行階段性培養(yǎng)，探究不同6-BA 濃度對于誘導(dǎo)新雜交品種蝴蝶蘭種子形成原球莖的影響，6-BA、NAA 濃度以及香蕉汁、椰子水與土豆對于原球莖芽分化的影響。

在植物生長調(diào)節(jié)劑添加方面，納博納交櫻桃番茄蝴蝶蘭雜交種子最終長出了零星的原球莖，推測可能是由于種子發(fā)育不良導(dǎo)致原球莖產(chǎn)生速度緩慢，或是該雜交品種蝴蝶蘭種子的萌發(fā)需要進(jìn)行暗處理。第1 階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最適NAA 濃度值約為3.0 mg/L，符合前人的研究。第2 階段試驗(yàn)結(jié)果可以得出，納博納交矩寶橘子原球莖芽誘導(dǎo)最適NAA 濃度為3.0 mg/L，最適6-BA 濃度為0.25 mg/L，當(dāng)6-BA 濃度高于或低于該值時(shí)，原球莖的芽分化率會(huì)下降。在添加物方面，添加了土豆、香蕉汁或椰子水的培養(yǎng)基對原球莖芽誘導(dǎo)產(chǎn)生促進(jìn)作用。在添加物方面，椰子水與土豆、香蕉汁相比促進(jìn)效果更為明顯。

此外，本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了一些現(xiàn)象。在種子萌發(fā)形成原球莖階段，低濃度6-BA 的環(huán)境會(huì)使原球莖產(chǎn)生較多的醌類物質(zhì)，但短期內(nèi)不會(huì)對其成活造成影響，后期保留觀察的無菌播種培養(yǎng)瓶中原球莖長勢良好，大部分分化出芽，但與芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中原球莖分化出的芽相比，無菌播種培養(yǎng)基中的芽個(gè)體明顯較小。同時(shí)，培養(yǎng)基褐色變淡，推測可能是這一階段醌類物質(zhì)含量會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移減少。在誘導(dǎo)原球莖芽分化階段，由于芽分化比較緩慢，在接種后30 d 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)出的數(shù)據(jù)規(guī)律性不強(qiáng)，難以體現(xiàn)出不同組合培養(yǎng)基對于蝴蝶蘭原球莖芽誘導(dǎo)影響的差別；在接種后45 d 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得到同一組內(nèi)數(shù)據(jù)的可信度較高，不同組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，由此推斷蝴蝶蘭原球莖芽誘導(dǎo)劑最佳數(shù)據(jù)收集時(shí)間應(yīng)≥45 d。由于6-BA 濃度梯度設(shè)置較窄，整體看來在這一階段低濃度的6-BA不會(huì)使原球莖產(chǎn)生大量醌類物質(zhì)；低濃度的NAA 會(huì)使原球莖產(chǎn)生醌類物質(zhì)的量明顯增加，能夠在短期內(nèi)對原球莖產(chǎn)生毒害作用，若要保證芽分化的效率需關(guān)注醌類物質(zhì)的產(chǎn)生情況并及時(shí)轉(zhuǎn)移原球莖。在不同添加物對照試驗(yàn)中，香蕉汁、土豆和空白對照組中沒有或僅有極少量醌類物質(zhì)產(chǎn)生。