西紅花苷抑制NFATc3 活性促進(jìn)與腫瘤成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞放射敏感性

如桂牙·阿不力孜，薛青芳，加依娜提·熱馬贊

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830054

結(jié)直腸癌已成為全球癌癥相關(guān)死亡的第2 大原因，術(shù)前新輔助放化療和放化療后進(jìn)行全直腸系膜切除術(shù)是晚期局部結(jié)直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[1]。然而，只有大約20%的患者達(dá)到腫瘤完全消退的效果，其余患者仍有病理殘留或?qū)χ委煙o(wú)反應(yīng)，甚至在放療后出現(xiàn)不良反應(yīng)，如放射誘發(fā)的繼發(fā)性腫瘤和放射性腸炎[2]。因此，闡明結(jié)直腸癌耐放射性的潛在機(jī)制并開(kāi)發(fā)安全有效的放射增敏方案是臨床上治療結(jié)直腸癌的重要環(huán)節(jié)。

腫瘤微環(huán)境由細(xì)胞外基質(zhì)和間充質(zhì)細(xì)胞類型組成，包括成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境中的主要基質(zhì)細(xì)胞類型，具有獨(dú)特的致瘤特性，CAFs 以及原發(fā)灶周圍的其他腫瘤基質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性[3-4]。已有研究表明，從CAFs 中分離的外泌體能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性，從而提高其抗放射性，該機(jī)制可能與激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路有關(guān)[5]。

西紅花苷是水溶性類胡蘿卜素，是西紅花的主要成分和主要的暗紅色色素。西紅花具有多種用途，包括排汗、助消化、鎮(zhèn)靜、祛痰以及治療嘔吐、心血管疾病和腫瘤等[6-7]。近年來(lái)，西紅花苷的抗腫瘤作用也被多項(xiàng)研究證實(shí)并報(bào)道，其能夠抑制胃癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病等多種腫瘤發(fā)生與進(jìn)展[8-10]。此外，已有研究表明使用西紅花苷可增加頭頸部癌惡性腫瘤的放射敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。但在與CAFs 共培養(yǎng)下，西紅花苷能否發(fā)揮增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性，目前尚未見(jiàn)報(bào)道?；罨疶 細(xì)胞核因子（NFAT）是一種與人T 細(xì)胞中白細(xì)胞介素-2（IL-2）啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，目前已揭示NFAT 的5 種亞型，包括NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性和腫瘤微環(huán)境均受到NFAT 所調(diào)控[12-13]?；诖?，本研究通過(guò)將結(jié)直腸癌細(xì)胞與CAFs 共培養(yǎng)下給予西紅花苷處理，檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性變化，探究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

CAFs 由本實(shí)驗(yàn)室前期從人結(jié)直腸癌組織中分離、鑒定并培養(yǎng)，人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO均購(gòu)于中科院細(xì)胞研究所，添加含1%青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2 天傳代1 次。

西紅花苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)111588-201704）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，總RNA 抽提試劑盒（批號(hào)15596-026）和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（批號(hào)C28025）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，SYBR Premix Ex Taq 熒光定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)DRR041S）購(gòu)于日本Takara 公司，高效RIPA 細(xì)胞裂解液（批號(hào)R0010）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)AC13858）購(gòu)于上海吉至生化科技有限公司，ECL 顯影液（批號(hào)P0018M）和PVDF 膜（批號(hào)FFP20）購(gòu)于上海碧云天生物研究所，Transwell 小室（批號(hào)3422）購(gòu)于美國(guó)Corning公司，Giemsa 染液（批號(hào)SH-1921）購(gòu)于北京凱詩(shī)源生物科技有限公司，MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)R20228）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI 熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)E-CK-A211）購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，Hoechst 33258 熒光染料（批號(hào)A1371）購(gòu)于北京康瑞納生物科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 抗體（批號(hào)ab205719）與兔多抗 GAPDH 抗體（批號(hào)ab181602）購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司，兔多抗NFATc3抗體（批號(hào)104857-T34）購(gòu)于美國(guó)Abnova 公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）測(cè)定NFATc3mRNA 表達(dá) Trizol 法提取細(xì)胞的總RNA，按照總RNA 抽提試劑盒操作，1%凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度與純度。取濃度、純度符合要求的RNA 樣品，通過(guò)M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)計(jì)NFATc3的上、下游引物進(jìn)行定量擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，引物序列：NFATc3正向5’-TT CGCACATCTTCATTACCTCC-3’；反向5’-CCTCG GCTACCTTCAGTTTCAT-3’；GAPDH正向5’-GAC AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，反向5’-GAGTCAA CGGATTTGGTCGT-3’。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，在ABI 7900 型熒光定量PCR 系統(tǒng)上設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min 預(yù)變性，循環(huán)1 次；95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40 次。重復(fù)3 次，擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析，讀取Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NFATc3mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印記（Western blotting）測(cè)定NFATc3 蛋白表達(dá) RIPA 裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，BCA 法測(cè)量濃度。將等量上樣緩沖液與蛋白混合，100 ℃水浴加熱變性。將40 μg 變性后的蛋白上樣至膠孔內(nèi)，通過(guò)10% SDS-PAGE 凝膠分離，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。以5%脫脂奶粉作為封閉液，將膜浸入封閉液后室溫靜置1 h。再將膜與稀釋后的特異性一抗（1∶1 000）共置于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST 洗膜后，再將膜與對(duì)應(yīng)稀釋后的二抗（1∶5 000）在室溫下共孵育2 h，TBST 再次洗膜，避光環(huán)境下利用ECL 顯影，凝膠成像儀采集圖像，Image J 軟件分析各蛋白灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值來(lái)表示。

1.2.3 細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立與處理 將培養(yǎng)的CAFs 以每孔 1×104個(gè)的密度種植于 6 孔板Transwell 上室，將HCT116 細(xì)胞以每孔3×104個(gè)的密度種植于6 孔板Transwell 下室，構(gòu)建非接觸共培養(yǎng)體系，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置共培養(yǎng)48 h。此外，以Transwell 下室為HCT116 細(xì)胞、上室為基礎(chǔ)培液作為對(duì)照，記為HCT116。收集與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞，分為兩部分，一部分為單純與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞，記為CAFs/HCT116；另一部分與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞再采用200 μmol/L 西紅花苷處理12 h，記為CAFs/HCT116＋西紅花苷，其中西紅花苷給藥依據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道劑量[14]。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞存活分?jǐn)?shù) 收集1.2.3 項(xiàng)下處理后的3 組HCT116 細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后，分別給予0、2、4、6、8 Gy 劑量的X 射線照射（劑量率為2 Gy/min）。照射完畢后，將各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，14 d 左右出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)菌落，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌，加入細(xì)胞固定液固定，再加入Giemsa 染液染色30 min，PBS 再?zèng)_洗，自然晾干，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)含50 個(gè)細(xì)胞以上形成的集落數(shù)目，統(tǒng)計(jì)集落形成率，根據(jù)集落形成率計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF）。

SF＝實(shí)驗(yàn)組集落形成率/對(duì)照組集落形成率

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞分為4 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體分組與處理如下：（1）對(duì)照組，HCT116 細(xì)胞正常培養(yǎng)；（2）6 Gy 組，HCT116細(xì)胞經(jīng)6 Gy 劑量的X 射線照射（劑量率為2 Gy/min）；（3）CAFs/HCT116＋6 Gy 組，與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞經(jīng)6 Gy 劑量的X 射線照射（劑量率為2 Gy/min）；（4）CAFs/HCT116＋西紅花苷＋6 Gy 組，與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞采用200 μmol/L 西紅花苷處理12 h，再經(jīng)6 Gy 劑量的X 射線照射（劑量率為2 Gy/min）。處理結(jié)束后，收集4 組HCT116 細(xì)胞。

1.2.6 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 將HCT116 細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按照1.2.5 項(xiàng)下進(jìn)行分組處理后，每孔加20 μL MTT，處理4 h 后，終止培養(yǎng)。每孔再加入150 μL DMSO，搖床振蕩直至結(jié)晶物充分溶解，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在490 nm 處的吸光度（A）值，檢測(cè)細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝（A實(shí)驗(yàn)－A空白）/（A對(duì)照－A空白）

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集處理后的4 組HCT116 細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化，通過(guò)4 000 r/min 離心5 min，PBS 清洗沉淀，加入1×binding buffer 重懸，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。在流式檢測(cè)管中加入100 μL 細(xì)胞懸液，接著依次加5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，渦旋混勻，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HCT116 細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡率＝Q2 象限百分率＋Q3 象限百分率

1.2.8 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 將處理后的4 組HCT116 細(xì)胞進(jìn)行爬片，加入細(xì)胞固定液，置于4 ℃下固定過(guò)夜。次日，棄原液，PBS洗滌細(xì)胞，吸除多余液體，滴加Hoechst 33258 工作液，室溫下染色10 min，PBS 漂洗后，用抗熒光淬滅封片液封片，自然晾干，在熒光顯微鏡觀察各組HCT116 細(xì)胞凋亡形態(tài)并攝取圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NFATc3 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

qRT-PCR 與Western blotting 測(cè)定結(jié)果顯示，相較于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO 中的NFATc3mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1。且HCT116 細(xì)胞中NFATc3mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)水平較高，因此，后續(xù)選擇該細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞系中NFATc3 表達(dá)比較（，n=6）Fig.1 Comparison of NFATc3 expression in human normal colon epithelial cells and colorectal cancer cell lines(,n=6)

2.2 西紅花苷對(duì)與CAFs 共培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并分析各組HCT116 細(xì)胞SF，與HCT116 細(xì)胞比較，經(jīng)過(guò)4、6、8 Gy 劑量的X 射線照射后，與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞SF顯著增高（P＜0.05）。而與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞比較，與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞經(jīng)西紅花苷處理、再通過(guò)4、6、8 Gy 劑量的X 射線照射后，細(xì)胞SF 顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理下HCT116 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比較（，n=6）Fig.2 Comparison of HCT116 cell survival fraction under different treatments (,n=6)

2.3 西紅花苷對(duì)與CAFs 共培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞存活率的影響

MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，6 Gy 組HCT116 細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05）。與6 Gy組比較，CAFs/HCT116＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05）。與CAFs/HCT116＋6 Gy 組比較，CAFs/HCT116＋西紅花苷＋6 Gy 組HCT116細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組HCT116 細(xì)胞存活率比較（，n=6）Fig.3 Comparison of HCT116 cell survival rate among all groups (,n=6)

2.4 西紅花苷對(duì)與CAFs 共培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，6 Gy組HCT116 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。與6 Gy 組比較，CAFs/HCT116＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.05）。與CAFs/HCT116＋6 Gy 組比較，CAFs/HCT116＋西紅花苷＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組HCT116 細(xì)胞凋亡率比較（，n=6）Fig.4 Comparison of apoptosis rate of HCT116 cells in each group (,n=6)

2.5 西紅花苷對(duì)與CAFs 共培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst33258 染色結(jié)果如圖5 所示，對(duì)照組HCT116 細(xì)胞內(nèi)呈彌散均勻的染色，代表細(xì)胞未發(fā)生凋亡；6 Gy 組HCT116 細(xì)胞可見(jiàn)致密濃染的顆粒塊狀熒光，代表細(xì)胞發(fā)生凋亡；CAFs/HCT116＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞內(nèi)染色也較為均勻，未見(jiàn)致密濃染熒光；而CAFs/HCT116＋西紅花苷＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞有較多致密濃染、碎裂熒光塊，代表細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 各組HCT116 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察（Hoechst33258染色，×200）Fig.5 Observation of apoptosis morphology of HCT116 cells in each group (Hoechst33258 staining,×200)

2.6 西紅花苷對(duì)與CAFs 共培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中NFATc3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響

qRT-PCR 與Western blotting 測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，6 Gy 組HCT116 細(xì)胞中NFATc3mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。而與6 Gy組比較，CAFs/HCT116＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞中NFATc3mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05）。與CAFs/HCT116＋6 Gy 組比較，CAFs/HCT116＋西紅花苷＋6 Gy 組HCT116 細(xì)胞中NFATc3mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 各組HCT116 細(xì)胞中NFATc3 表達(dá)水平比較（，n=6）Fig.6 Comparison of NFATc3 expression levels in HCT116 cells in each group (,n=6)

3 討論

近年來(lái)，人們對(duì)中醫(yī)藥的興趣日益濃厚，引發(fā)了在抗腫瘤領(lǐng)域的廣泛研究。中藥能減輕化療不良反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)并預(yù)防復(fù)發(fā)，不僅提高了患者的生活質(zhì)量，而且延長(zhǎng)了患者的生存期。隨著中藥抗腫瘤作用研究的日益加深，研究顯示其還可以提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，這對(duì)于臨床上提高腫瘤放射治療效果來(lái)說(shuō)意義重大。以往多項(xiàng)研究表明，西紅花苷可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明西紅花苷在腫瘤治療中極具潛力。目前，關(guān)于西紅花苷在腫瘤放射治療中的作用也已有報(bào)道，Vali 等[15]研究表明西紅花苷對(duì)放射處理下的人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞具有協(xié)同作用，能夠促使細(xì)胞凋亡，改善乳腺癌的治療效果；Bakshi等[16]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷不僅能夠降低放射下胰腺癌細(xì)胞的活力，并對(duì)放射誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用。由此可見(jiàn)，西紅花苷對(duì)于提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性方面也具有積極作用。

作為實(shí)體瘤中主要的基質(zhì)細(xì)胞亞型之一，CAFs占腫瘤體積的50%～70%，相較于正常未激活的成纖維細(xì)胞，CAFs 有助于腫瘤細(xì)胞的多種惡性行為進(jìn)展，包括增殖、遷移、侵襲、血管生成、誘導(dǎo)化學(xué)抵抗和逃避免疫介導(dǎo)的殺傷。除此之外，CAFs 還與放療治療失敗以及患者不良臨床結(jié)局有關(guān)[17]。一方面，CAFs 通過(guò)分泌趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及調(diào)控相關(guān)信號(hào)途徑，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受放射造成的DNA 損傷，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；另一方面，活化的CAFs 可以重新編程腫瘤細(xì)胞代謝以維持腫瘤細(xì)胞存活并保護(hù)其免受藥物或放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。Huang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)CAFs 誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞放射抗性的形成，通過(guò)白細(xì)胞介素-8（IL-8）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）途徑在放射后促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞存活，以減少照射誘導(dǎo)的DNA 損傷；Meng 等[20]研究表明CAFs 通過(guò)蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和放射抗性形成，而靶向誘導(dǎo)CAFs 凋亡顯著提高了放射治療效果，并緩解了放射誘導(dǎo)的肺纖維化；Kitamura 等[21]研究報(bào)道指出CAFs 分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）以激活c-Met 信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的放射抗性。在本研究中，將結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞與CAFs 共培養(yǎng)后，再經(jīng)過(guò)4、6、8 Gy 劑量的X射線照射，HCT116 細(xì)胞的SF 顯著增高；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于單獨(dú)經(jīng)6 Gy 劑量X 射線照射的HCT116 細(xì)胞，與CAFs 共培養(yǎng)后再經(jīng)6 Gy 劑量X 射線照射的HCT116 細(xì)胞存活率較高，細(xì)胞凋亡率下降，未見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，該結(jié)果同樣表明，CAFs 能夠降低HCT116 細(xì)胞對(duì)放射的敏感性，抑制細(xì)胞凋亡。而與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞經(jīng)西紅花苷處理再通過(guò)4、6、8 Gy 劑量的X射線照射后，細(xì)胞SF 顯著降低，其中，在6 Gy 劑量的X 射線照射下細(xì)胞SF 接近于50%，因此后續(xù)選擇該劑量進(jìn)行研究。此外，本研究還顯示，HCT116 細(xì)胞與CAFs 共培養(yǎng)后，采用西紅花苷處理HCT116細(xì)胞再經(jīng)6 Gy劑量X射線照射，HCT116細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡率升高，出現(xiàn)較多致密濃染、碎裂的凋亡狀細(xì)胞，這說(shuō)明西紅花苷能夠促進(jìn)與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞放射敏感性，從而提高結(jié)直腸癌的放療效果。

NFATc3 作為NFAT 的重要亞型之一，研究表明，NFATc3 參與潰瘍性結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，下調(diào)NFATc3 可以抑制潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低促炎細(xì)胞因子的水平，減少中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的結(jié)腸浸潤(rùn)，改善黏膜損傷，并抑制腫瘤形成與生長(zhǎng)[22]。此外，NFATc3 在替莫唑胺耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 細(xì)胞中的表達(dá)水平要顯著高于替莫唑胺敏感膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 細(xì)胞[23]。但關(guān)于NFATc3 與放射敏感性之間的關(guān)系尚未報(bào)道。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于單獨(dú)經(jīng)6 Gy 劑量X 射線照射的HCT116 細(xì)胞，與CAFs 共培養(yǎng)后再經(jīng)6 Gy劑量X 射線照射的HCT116 細(xì)胞中NFATc3 表達(dá)顯著上調(diào)，而HCT116 細(xì)胞與CAFs 共培養(yǎng)后，經(jīng)西紅花苷處理再以6 Gy 劑量X 射線照射的HCT116細(xì)胞中NFATc3 表達(dá)顯著下調(diào)，由此推測(cè)，西紅花苷提高與CAFs 共培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞放射敏感性的作用可能與抑制NFATc3 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，西紅花苷能夠提高與CAFs 共培養(yǎng)下的結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞的放射敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，該作用可能與抑制NFATc3 水平有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突