酶水解制備羅非魚皮膠原蛋白肽的工藝優(yōu)化

鄧 云，梁權(quán)瑞，鄧琳琪

（1.茂名市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東茂名 525000；2.廣東石油化工學(xué)院，廣東茂名 525000）

膠原蛋白肽不但具有多肽的一些典型特征[1]（包括分子量小、易吸收，無抗原性、不過敏，安全性高、無副作用，生物活性高、作用準(zhǔn)確、載體運(yùn)輸能力強(qiáng)等） 外，還具備其他多肽沒有的一些優(yōu)點(diǎn)（顯著的美容功效、促進(jìn)骨骼的生長的修復(fù)等），被稱為“皮膚的軟黃金”“膚中之膚、骨中之骨”，廣泛用于化妝品[2-3]、功能性食品[4-5]、醫(yī)用材料及醫(yī)藥中[6-7]。膠原蛋白肽的研究對人類來說是一項(xiàng)非常值得研究的內(nèi)容[8]，羅非魚含有豐富的膠原蛋白，具有很多陸生動(dòng)物膠原蛋白所沒有的優(yōu)點(diǎn)，是提取可溶性膠原蛋白既豐富又經(jīng)濟(jì)的原料[9]。羅非魚加工過程中會舍棄富含膠原蛋白的魚皮，目前只有一小部分用于制作飼料或者肥料，絕大部分當(dāng)作廢物丟棄，從而污染環(huán)境，造成了巨大資源浪費(fèi)。希望能夠?yàn)榱_非魚皮的膠原蛋白肽提取方法和價(jià)值提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 酶的選擇

胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme） 是蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原被合成后，作為胰液的成分而分泌，受腸激酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，其不僅起消化酶的作用，還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用，是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，成為不可缺少的工具。胰蛋白酶在生活中也較容易得到，性價(jià)比較高。同時(shí)，胰蛋白酶的最適pH 值為7.0～8.5，最適溫度為40～70 ℃，上述條件在實(shí)驗(yàn)室均比較容易達(dá)到，所以此次羅非魚魚皮明膠酶解選取胰蛋白酶。

1.2 材料和試劑

1.2.1 材料

羅非魚皮明膠液體（質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為6%），廣東百維生物科技有限公司提供；胰蛋白酶（酶活力為265 U/mg），上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2.2 試劑

無水硫酸銅（AR），廣東光華科技股份有限公司提供；三氯乙酸（AR），永華化學(xué)科技（江蘇） 有限公司提供；磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鈉（AR），天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；氫氧化鈉（AR）、酒石酸鉀鈉（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；鹽酸（AR），西隴化工股份有限公司提供。

1.3 儀器及設(shè)備

UV-2600 型紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器（江蘇） 有限公司產(chǎn)品；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-10 型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；BSS224S 型電子分析天平，北京賽爾多斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；80-2 型電動(dòng)離心機(jī)，天津市永常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品；pHS-2F 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；1515 GPC 型凝膠色譜柱、717plus 型自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent 1260 型示差檢測器，美國Waters 產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)流程及操作要點(diǎn)

1.4.1 試驗(yàn)流程

6%的明膠液→放進(jìn)冰箱急凍層凍結(jié)后→凍結(jié)后切塊再放進(jìn)去凍結(jié)→凍結(jié)后放進(jìn)冷凍干燥機(jī)干燥→電子天平稱質(zhì)量→加緩沖液溶解→加入胰蛋白酶反應(yīng)→取樣加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)→靜置10 min 后離心→上清液取樣加TCA 和雙縮脲試劑→加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值→在分光光度計(jì)測量吸光度→數(shù)據(jù)處理。

1.4.2 操作要點(diǎn)

（1） 明膠稱質(zhì)量。選取完全干燥的明膠固體置于干凈的100 mL 燒杯中，準(zhǔn)確稱取所需質(zhì)量的明膠，誤差不要超過0.01 g。

（2） 加緩沖液溶解。以30 mL 作為體系，向稱好干燥明膠的小燒杯中加入緩沖溶液，用保鮮膜蓋住燒杯口，放置于水浴鍋中完全溶解。

（3） 加胰蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)。加入酶液的第一時(shí)間開始計(jì)時(shí)，在確定的時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)確對反應(yīng)溶液進(jìn)行取樣，并且在第一時(shí)間加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的TCA（三氯乙酸） 終止反應(yīng)，靜置10 min 沉淀。

（4） 離心。離心后取上清液3 mL 置于一次性杯子中，加入15 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%的TCA 溶液（再次加入TCA 是為了保證體系內(nèi)沒有受到胰蛋白酶的影響） 和12 mL 現(xiàn)配的雙縮脲試劑。

（5） 測量。用氫氧化鈉溶液把該體系的pH 值調(diào)至12.5，并盡快對其進(jìn)行吸光值測量，要求平行測量3 次后取平均值。

1.5 魚皮明膠酶解條件優(yōu)化

采取單因素試驗(yàn)，在其他條件不變的情況下，分別研究明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、胰蛋白酶用量、反應(yīng)環(huán)境pH 值和反應(yīng)環(huán)境溫度4 個(gè)因素對胰蛋白酶酶解羅非魚魚皮酶解的影響。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素中選取5 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)。根據(jù)響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果來分析，并找出胰蛋白酶酶解羅非魚魚皮明膠的最優(yōu)條件。

1.5.1 單因素試驗(yàn)

（1） 最適明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，取1.5 g 干燥后的明膠置于1 號、2 號燒杯中，2 個(gè)燒杯中各加入28 mL pH 值7.4 緩沖液。溶解后向2 號燒杯加入2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL（對應(yīng)的就是體系中用量0.033 0 mg/g），混勻后置于60 ℃的溫度水浴鍋中反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)至10，20，30，40，60，90，120 min 時(shí)取樣測量，測量方法參考改良雙縮脲法測量多肽含量。其余明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是6%，7%，8%，9%，10%，分別對應(yīng)的明膠用量為1.8，2.1，2.4，2.7，3.0 g，對應(yīng)的緩沖液分別是27.7，27.4，27.1，26.8，26.5 mL，測定方法與質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%明膠一致。

（2） 最適酶用量。明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取7%，體系確定是30 mL，取2.1 g 干燥后的明膠置于1 號，2 號燒杯中，酶液用量換成液0.1，0.3，0.4，1.2，2.0 mg/mL的胰蛋白酶液0.50 mL（對應(yīng)體系中的酶用量是0.001 7，0.005 0，0.006 7，0.020 0，0.033 0 mg/g），于60 ℃的溫度水浴鍋中反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)至10，20，30，40，60，90，120，150，180，210 min時(shí)取樣測量，測量方法參考改良雙縮脲法測量多肽含量。

（3） 最適反應(yīng)溫度。明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取7%，酶用量選取2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL，在40 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)至10，20，30，40，60，90，120，150，190 min 時(shí)取樣測量，測量方法參考2.6.3 的改良雙縮脲法測量多肽含量。其余反應(yīng)溫度分別是50，60，70，80 ℃，測定方法同測40 ℃的方法一致。

（4） 最適反應(yīng)pH 值。明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取7%，酶用量選取2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL，反應(yīng)溫度選取40 ℃，換用pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）緩沖液，于最適溫度下反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)至10，20，30，40，60，90，120，150，190，230 min 時(shí)取樣測量，測量方法參考改良雙縮脲法測量多肽含量。

1.5.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

由于單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到，明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、酶用量和緩沖溶液pH 值這4 個(gè)因素對明膠酶解后的肽得率的影響較明顯。故選取明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、酶用量、緩沖溶液pH 值及不同反應(yīng)時(shí)間這5 個(gè)因素，利用Design Expert 10.0 這個(gè)軟件進(jìn)行五因素五水平的響應(yīng)面法設(shè)計(jì)。

1.6 羅非魚魚皮明膠分子量分布的檢測

1.6.1 測定方法

采用凝膠滲透色譜（GPC） 測定。流動(dòng)相為0.1 mol/L 的KNO3水溶液，凝膠柱為WATERS Ultrahydrogel 500 column（7.8 mm×300 mm）、WATERS Ultrahydrogel 250 column（7.8 mm×300 mm） 和WATERS Ultrahydrogel 120 column（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)合用，流速為1.0 mL/min，Agilent 1260 示差檢測器，柱溫40 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)品：已知分子量（Mw） 的聚乙二醇，分子量分別為152 000，78 300，44 000，32 600，25 300，20 600，12 600，7 130，4 290，1 960，1 400，430，202 Da。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以流動(dòng)相為溶劑將其溶解為2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm 的膜過濾后，用高效凝膠色譜（GPC） 系統(tǒng)進(jìn)行檢驗(yàn)分析，OPEN LAB CDS 數(shù)據(jù)處理軟件處理數(shù)據(jù)。以標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)（LogMw） 對洗脫體積（V） 建立回歸方程，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 樣品測試

將明膠樣品用流動(dòng)相溶解，終質(zhì)量濃度為2～3 mg/mL，0.45 μm 的膜過濾后，進(jìn)樣量40 μL，運(yùn)行時(shí)間40 min，記錄圖譜，在OPEN LAB CDS 數(shù)據(jù)處理軟件中用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行積分，可得明膠樣品的分子量大小及分布。

1.7 肽得率的計(jì)算

1.7.1 雙縮脲溶液的配制

取10%氫氧化鈉溶液300 mL，另取3.0 g 無水硫酸銅和6.4 g 酒石酸鉀鈉加蒸餾水溶解定容至500 mL，在攪拌中加入氫氧化鈉，后定容至1 000 mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.7.2 明膠酶解肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用標(biāo)稱分子量為3 kDa 的羅非魚魚皮膠原蛋白肽配置成5 mg/mL 的肽液，分別取1.2，2.4，3.6，4.8，6.0 mL 于50 mL 的燒杯中，再分別加入8.8，7.6，6.4，5.2，4.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%的TCA 溶液，然后加入8 mL 雙縮脲試劑，使體系肽的質(zhì)量濃度為0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mg/mL（控制多肽和TCA 溶液的總體積與雙縮脲溶液體積比為3∶2）。將溶液的酸堿度調(diào)至pH 值至10.5，立即于波長545 nm 處測定吸光度，以肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參比液為空白溶液，做3 組平行試驗(yàn)。按照同樣的方法分別測出溶液pH 值為11.0，11.5，12.0，12.5，13.0，13.5 的對應(yīng)溶液的回歸方程。

根據(jù)回歸方程的相關(guān)系數(shù)的平方和試驗(yàn)測得數(shù)據(jù)來選取最后的溶液pH 值，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)和相關(guān)系數(shù)R2的大小，最后選取的是溶液pH 值是12.5，回歸方程是：

式中：A——樣品吸光度。

1.7.3 改良雙縮脲法測量多肽含量[11]

干燥的明膠經(jīng)過加入緩沖液溶解，再加入指定的胰蛋白酶液經(jīng)過一定的時(shí)間反應(yīng)后，取出的1 mL樣液于離心管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的三氯乙酸溶液10 mL 后，靜置10 min 后以轉(zhuǎn)速3 250 r/min離心15 min，直至沉淀完全。取上清液3 mL 加入100 mL 燒杯中，加入TCA 溶液15 mL，加入雙縮脲試劑10 mL，在這時(shí)要提前半個(gè)小時(shí)去預(yù)熱分光光度計(jì)，然后對溶液進(jìn)行調(diào)pH 值至12.50，并立即于波長545 處測吸光度。要求每次都要重復(fù)試驗(yàn)3 次，取平均值。

1.7.4 明膠酶解后肽得率的計(jì)算

式中：A——樣品吸光度；

31.8——體系溶液30 mL 中經(jīng)過調(diào)完pH 值后的體積，mL；

11——1 mL 樣液+10 mL 的14%的TCA，mL；

M——干燥明膠的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠分子量分布結(jié)果

羅非魚皮明膠凝膠色譜圖見圖1，羅非魚魚皮明膠GPC 結(jié)果參數(shù)見表1。

圖1 羅非魚皮明膠凝膠色譜圖

由圖1 和表1 可知，羅非魚皮明膠的凝膠色譜圖的Mw（重均分子量） = 27 759 Da，Mn（數(shù)均分子量） =16 578 Da，Mp（質(zhì)均分子量） =36 524 Da，Mw/Mn（多分散系數(shù)） =1.674 5。由此可得，羅非魚皮明膠的分子量比較集中，羅非魚皮明膠不是一個(gè)均一的分子量聚合物，分子量寬度還可接受，分散程度不是很大。

2.2 羅非魚明膠水解工藝單因素結(jié)果及分析

2.2.1 酶解明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對膠原蛋白肽得率的影響

酶解明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對膠原蛋白肽得率的影響見圖2。

圖2 酶解明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對膠原蛋白肽得率的影響

由圖2 可知，羅非魚魚皮明膠同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)下隨酶解時(shí)間的延長，肽得率隨之增大，最后會趨于穩(wěn)定。而在相同時(shí)間內(nèi)，明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，肽得率先增大后減小，在明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過7%后，肽得率下降可能是膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，導(dǎo)致溶液黏稠度增大、流動(dòng)性降低，減少了酶與明膠底物的接觸，導(dǎo)致明膠酶解率降低，肽得率下降，與Motero P 等人[12]的研究結(jié)果相似。

2.2.2 酶解酶用量對膠原蛋白肽得率的影響

酶解酶用量對膠原蛋白肽得率的影響見圖3。

圖3 酶解酶用量對膠原蛋白肽得率的影響

由圖3 可知，羅非魚魚皮明膠在不同酶用量、相同時(shí)間下通過酶解提取的蛋白肽含量不同。同一酶用量下隨著酶解時(shí)間延長，肽得率增大，最后趨于穩(wěn)定，并且在20.0 μg/g 時(shí)得到最大肽得率，在繼續(xù)增加酶用量的情況下，肽得率不會增加，可能20.0 μg/g 的用酶量就是這個(gè)反應(yīng)體系中酶的最大用量，即在最大用酶量之前，明膠的酶解速率由胰蛋白酶的數(shù)量來控制明膠酶解后的肽得率；當(dāng)超過最大酶用量，由明膠底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)來決定明膠酶解肽得率。

2.2.3 酶解溫度對膠原蛋白肽得率的影響

酶解溫度對膠原蛋白肽得率的影響見圖4。

由圖4 可知，羅非魚魚皮明膠在溫度一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間增大，肽得率也隨之增大，最后趨于穩(wěn)定，其中在70 ℃時(shí)膠原蛋白肽得率可達(dá)到最大，但超過70 ℃后，肽得率反而降低。這是因?yàn)楫?dāng)溫度超過了一定范圍后胰蛋白酶的酶活性會降低，相同時(shí)間內(nèi)酶解效率有所降低，導(dǎo)致肽得率下降。

2.2.4 酶解pH 值對膠原蛋白肽得率的影響酶解pH 值對膠原蛋白肽得率的影響見圖5。

圖5 酶解pH 值對膠原蛋白肽得率的影響

由圖5 可知，羅非魚魚皮明膠在同一pH 值下均隨酶解時(shí)間的增加，肽得率增大，后趨于穩(wěn)定。相同時(shí)間下，隨著pH 值的增大，肽得率是先增大后減小，在pH 值為7.0 時(shí)魚皮明膠酶解后蛋白肽得率達(dá)到最大。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解提取羅非魚皮膠原蛋白的試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果可知，酶用量、酶解溫度、時(shí)間、體系中pH 值及明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肽得率的影響十分顯著。采用Design Expert 10.0 軟件Central composite 設(shè)計(jì)五因素五水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以多肽得率作為響應(yīng)值，應(yīng)用五因素五水平處理，共有32 個(gè)處理試驗(yàn)，其中中心點(diǎn)重復(fù)6 次。

響應(yīng)面中心設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面中心設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過Design Expert 10.0 軟件能夠得到一個(gè)三維的響應(yīng)面，以此分析整體誤差水平，再經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化能得到酶解提取羅非魚皮膠原蛋白肽的最佳工藝條件。以肽得率為響應(yīng)值得到二階多項(xiàng)方程為：

Y=75.14+1.18A+3.11B-3.70C+6.0D+6.91E+3.72AB-2.95AC+2.01AD+1.16AE-1.55BC-1.90BD+2.71BE+2.91CD-0.21CE-0.43DE-12.35A2-7.81B2-2.52C2-2.79D2-4.80E2.

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

由表4 可知，5 個(gè)因素對羅非魚魚皮明膠酶解后膠原蛋白含量影響順序?yàn)镋＞D＞C＞B＞A，在5 個(gè)因素中，酶用量（D） 和時(shí)間（E） 的p 值（p＜0.000 1），說明這2 個(gè)因素對魚皮明膠酶解肽得率中具有極其顯著的影響。失擬項(xiàng)p=0.063 4＞0.05 不顯著，沒有失擬因素存在，對模型是有利的。校正決定系數(shù)R2Adj=0.928 2＞0.80 和CV=9.11%＜10%，擬合的回歸方程符合實(shí)際要求，適應(yīng)性較好，可以代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)分析。

2.3.2 模型的響應(yīng)曲面與等高線

根據(jù)Design Expert 10.0 軟件可以得到根據(jù)二次方程模型分別做出的試驗(yàn)因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖，2 種圖能夠考查在某個(gè)因素固定中心值不變的情況下，其他2 個(gè)因素的交互作用對肽得率的影響。

酶解溫度和體系pH 值對肽得率的交互影響3D圖和交互影響等高線圖見圖6，酶解溫度和明膠底物濃度對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖7。

圖7 酶解溫度和明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

響應(yīng)曲面的傾斜度確定兩者對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著；等高線的形狀為橢圓形表示因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[29]。由圖6 可知，酶解溫度和pH 值交互作用顯著，但酶解溫度的等高線更為緊密，故反應(yīng)體系溫度對肽得率的影響更大。由圖7 可知，酶解溫度和明膠底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肽得率的交互作用顯著，但明膠底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的等高線更為緊密，即明膠底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肽得率的影響更大。等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)為響應(yīng)面最高點(diǎn)。

酶解溫度和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖8，反應(yīng)體系pH 值和反應(yīng)時(shí)間對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖9。

圖8 酶解溫度和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

圖9 反應(yīng)體系pH 值和反應(yīng)時(shí)間對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

由圖8 可知，酶解溫度和酶用量對肽得率的交互影響顯著，其中酶用量的等高線更為緊密，即反應(yīng)酶用量對肽得率的影響更大。由圖9 可知，pH 值和時(shí)間對肽得率的交互影響較顯著，其中反應(yīng)時(shí)間的等高線更為緊密，即反應(yīng)時(shí)間對肽得率的影響更大。

明膠底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖10。

圖10 明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

由圖10 可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶用量對肽得率的交互影響顯著，其中酶用量的等高線更為緊密，即酶用量對肽得率的影響更大。

3 結(jié)論

通過五因素五水平的中心組合設(shè)計(jì)，分析響應(yīng)面的曲面和等高線的分布圖得出各因素對肽得率的影響大小為時(shí)間＞酶用量＞明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解pH值＞溫度。由響應(yīng)面的優(yōu)化分析可以得到最佳酶解工藝條件為明膠膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶用量15.1 μg/g，酶解溫度70.0 ℃，pH 值7.63 和時(shí)間69.99 min，在此最佳工藝條件下酶解羅非魚皮明膠肽得率76.54%?？紤]到實(shí)際操作的方便性和可操作性，將提取工藝條件改為酶解溫度70.0 ℃，明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%，反應(yīng)pH 值8.00，時(shí)間70.0 min，酶用量為20.0 μg/g時(shí)，明膠酶解的實(shí)際肽得率是77.72%。通過比較，實(shí)際得出的結(jié)果和理論值十分吻合，該模型的可靠性較高。