基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接的通絡化濁丸 治療高脂血癥作用機制研究

彭麗琪,姚昆鵬,蔡虎志,張小琴,朱智顯,劉越美,陳青揚,陳新宇

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

高脂血癥(Hyperlipidemia,HPL)是血漿中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)以及低密度脂蛋白(LDL)含量過高或高密度脂蛋白(HDL)含量過低的代謝性疾病[1]。隨著人類生活質量不斷提高以及飲食結構的改變,HPL患病率逐年上升,并呈現(xiàn)出患病群體年輕化的趨勢。據(jù)統(tǒng)計,我國成年HPL患者人數(shù)約占1/3,城市患病率明顯高于農村[2]。常用他汀類藥物具有修復血管、抗炎、營養(yǎng)神經(jīng)等作用,但也存在風險,如升高轉氨酶、溶解橫紋肌、誘發(fā)白內障、加劇胰島素抵抗等[3-4]。長期HPL易誘發(fā)冠心病、腦卒中等主要心腦血管事件,嚴重影響人類健康。因此,加強對HPL的預防和治療,尋找長期使用、副作用小、能有效控制血脂的藥物,便成為當務之急。中醫(yī)藥具有多維度、多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特征,療效較之于他汀類藥物更加安全、可靠。深入探索低毒、高效、價廉的治療HPL的療法是目前亟待解決的臨床問題。

通絡化濁丸(原名降脂通絡方)是陳新宇教授總結長期臨床經(jīng)驗所研制的湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑,由丹參、西洋參、茯苓、三七、薏苡仁、山楂、川芎、決明子組成,具有降脂化濁、活血通絡、行氣散瘀之效。在前期的基礎研究[5]中,發(fā)現(xiàn)通絡化濁丸能夠上調TC轉運過程的關鍵蛋白ABCA1、apoA-1和 LCAT的表達,從而調控成熟HDL-C的形成。但是,由于通絡化濁丸成分復雜,對其有效的藥物組成和作用機制尚未形成科學的認識,制約在臨床上的應用和推廣。網(wǎng)絡藥理學具備良好的綜合性和系統(tǒng)性,為復雜中藥防治疾病、降低中藥毒性、藥物再利用等方面的研究開辟新的途徑[6]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學、分子對接技術,對通絡化濁丸防治HPL的有效成分和主要靶標進行初步探索,以期能為HPL的防治、新藥研發(fā)及闡述中藥作用機制的科學內涵等提供參考。

1 材料與方法

1.1 通絡化濁丸活性成分及靶點的檢索

通過TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫檢索中藥活性成分及其靶點(篩選標準為“OB≥30%,DL≥0.18”)。利用UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將靶點命名轉換為基因符號,創(chuàng)建“藥物-活性成分-靶點”數(shù)據(jù)集。

1.2 HPL疾病靶點的篩選

通過TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)數(shù)據(jù)庫篩選HPL疾病靶點。

1.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡的繪制

將中藥靶點與疾病靶點取交集,繪制韋恩圖。導入篩選好的藥物、成分以及靶標蛋白,借助Cytoscape_v3.8.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡拓撲圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡的構建

將交集靶點導入STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,構建PPI蛋白互作網(wǎng)絡。運用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件計算節(jié)點BC、CC、DC、EC、LAC、NC數(shù)值。每次篩選均選擇每項數(shù)值大于中位值的節(jié)點,最終確定PPI網(wǎng)絡中的核心靶點。利用MCODE插件分析PPI網(wǎng)絡的核心模塊,將核心靶標蛋白的關系進行可視化處理。

1.5 GO富集和KEGG通路分析

利用R語言編輯腳本文件,對交集靶點進行生物功能富集分析。選取GO功能中分子功能(MF)、生物過程(BP)、細胞組成(CC)排名前10的結果和KEGG通路富集中排名前30的結果,并以氣泡圖的形式直觀地展示。

1.6 分子對接

從“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡中篩選出Degree值排名前10的靶點。依據(jù)小分子配體與靶點之間的對應關系將二者配對,進行計算機模擬對接以驗證網(wǎng)絡藥理學預測的結果。利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫查找配體2D結構,再借助ChemBio3D軟件轉化為“最小自由能”優(yōu)化后的3D結構。通過PDB(https://www.pdbus.org/)數(shù)據(jù)庫搜索靶點的3D結構。利用PyMOL和AutoDock軟件將靶點和小分子配體轉化為“pdbqt”格式后進行模擬計算,運用PyMOL軟件確定分子間氫鍵、對接位點及氫鍵長度,選擇結合能低的對接構象進行可視化。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)平臺繪制分子對接結合能熱圖。

2 結果

2.1 通絡化濁丸活性成分和靶點

根據(jù)設定的篩選條件,共檢索出100種有效活性成分。通過UniProt數(shù)據(jù)庫對8味中藥藥物靶點進行了規(guī)范化的篩選,最終獲得244個靶標蛋白,見表1。

表1 通絡化濁丸治療HPL的活性成分及作用靶點

2.2 通絡化濁丸治療HPL的作用靶點

依據(jù)5個疾病數(shù)據(jù)庫的檢索結果,匯總去重后得到508個HPL疾病靶點。利用在線工具Venny 2.1.0將藥物靶點和HPL疾病靶點進行韋恩分析。兩者取交集后得到68個共同靶點,即為通絡化濁丸治療HPL的關鍵作用靶點。

2.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡

將中藥、活性成分和交集靶點按照節(jié)點屬性進行分類,并將其導入Cytoscape_v3.8.2軟件,建立“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡。經(jīng)計算,網(wǎng)絡圖中共有158個節(jié)點和433條邊,其中,節(jié)點大小與其Degree值成正比,節(jié)點間的連線代表相互作用關系。淡紫色節(jié)點代表通絡化濁丸中包含的6種有效活性成分,淺綠色節(jié)點代表通絡化濁丸治療HPL的68個潛在作用靶點,粉色節(jié)點代表復方中的8味中草藥,見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡分析

設定篩選條件為“Minimum Required Interaction Score>0.40”,繪制交集靶點的PPI網(wǎng)絡。經(jīng)計算,PPI網(wǎng)絡有68個節(jié)點和712條邊,平均節(jié)點度為20.9,平均局部集聚系數(shù)為0.654,見圖2。經(jīng)兩輪拓撲分析后得到PPI網(wǎng)絡中的10個核心靶點,即VEGFA、IL1B、MMP9、EGFR、CCL2、EGF、ICAM1、IL6、SERPINE1、TNF。第一輪篩選得到23個核心靶點。第二輪篩選得到10個核心靶點,核心靶點關系見圖3。運用STRING數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行可視化處理。靶點的顏色、大小與其度值數(shù)值的大小成正相關。靶點的顏色越深,度值越大,說明發(fā)揮的作用越大。

圖3 核心靶點關系

2.5 GO和KEGG富集分析

根據(jù)-LogP值和Count值進行排序,分別取GO功能和KEGG富集結果前30個條目繪制氣泡圖。生物功能富集分析結果見圖4、圖5。圖中用GeneRatio表示該GO功能或KEGG通路富集的基因數(shù)量,用氣泡顏色代表其顯著性高低。在“P<0.05”的篩選條件下,GO功能富集分析得到1 799個條目(其中BP條目1 666個,CC條目30個,MF條目103個),KEGG通路富集分析得到105個條目。

圖4 GO功能分析

由圖可知,BP涉及脂多糖的反應、細菌來源分子的反應、類固醇激素反應、活性氧代謝過程、營養(yǎng)水平反應等。CC與膜筏、膜微結構域、質膜筏、小窩、神經(jīng)元細胞膜等密切相關。MF包括核受體的活動、配體激活的轉錄因子活性、受體配體活動、信號受體激活物活性、類固醇激素受體活性等。關鍵靶點富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化、化學致癌-受體活化、TNF信號通路等。脂質與動脈粥樣硬化(NO.hsa05417)信號通路上存在較多的富集靶點基因,這可能是通絡化濁丸治療HPL的重要作用機制。圖6中白色代表信號通路中的正?；?紅色代表通絡化濁丸在HPL防治中的功能基因。

圖6 功能基因在信號通路上的分布

2.6 分子對接

選取VEGFA、IL1B、MMP9、EGFR、CCL2、EGF、ICAM1、IL6、SERPINE1、TNF作為模擬對接靶點。結合“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡的從屬關系,獲得6個對應的配體:蘆薈大黃素、槲皮素、人參皂苷Rh2、丹參酮、山柰酚和隱丹參酮。將篩選出的前10個潛在靶點和6個小分子配體通過PyMOL和AutoDock軟件進行對接驗證。結合能的高低與對接構象的穩(wěn)定性成反比,能量越低,表明小分子配體和靶點蛋白的結合效果越好[7]。結果顯示,小分子配體與核心靶點最低結合能均<-5.0kcal·mol-1,可認為結合活性較強,篩選結果可靠。6種關鍵活性成分與10個核心靶點的結合活性均優(yōu)于內源性配體,說明關鍵活性成分對核心靶點有良好的選擇性和穩(wěn)定性。靶標蛋白與關鍵活性成分、內源性配體的結合能見表2、圖7,分子對接結果見圖8。

圖7 分子對接結合能熱圖

注:A.TNF與丹參酮;B.SERPINE1與人參皂苷Rh2;C.VEGFA與人參皂苷Rh2;D.EGFR與丹參酮;E.IL1B與丹參酮;F.MMP9與山柰酚;G.CCL2與人參皂苷Rh2;H.IL6與丹參酮。

表2 分子對接結合能 (kcal·mol-1)

圖8中藍色代表小分子配體,綠色代表靶點蛋白,黃色虛線代表分子間氫鍵。由圖8所示,小分子配體主要通過氫鍵作用和靶點蛋白發(fā)生相互作用,體現(xiàn)出較強的結合能力。TNF與丹參酮在TYR-151、TYR-119處形成氫鍵。SERPINE1與人參皂苷Rh2在TYR-210、THR-267、THR-211、GLU-212處形成氫鍵。VEGFA與人參皂苷Rh2在GLU-64、LYS-107、ASP-63、ASN-62、CYS-61、GLY-59、SER-50、LEU-32。EGFR與丹參酮在MET-793處形成氫鍵。IL1B與丹參酮在SER-125處形成氫鍵。MMP9與山柰酚在GLU-47、ARG-51、TYR-52、THR-96、ASP-182處形成氫鍵。CCL2與人參皂苷Rh2在TYR-28、ARG-30、THR-10處形成氫鍵。IL6與丹參酮在GLN-76處形成氫鍵。

3 討論

高脂血癥為現(xiàn)代醫(yī)學疾病名稱,在古代典籍中尚未提及。雖然中醫(yī)典籍中未曾明確提出脂質的概念,但是《黃帝內經(jīng)》中有關于“膏”“脂”的論述與現(xiàn)代醫(yī)學中提出的“血脂”類似[8]?！鹅`樞·五癃津液別》云:“五谷之津液和合而為膏者,內滲于骨空,補益腦髓,而下流于陰股?！备嘀从谒染?隨津液運行流動于周身,具有維持體溫、儲存能量、保護臟器等重要作用。在病理情況下,各種致病因素直接或間接影響臟腑,機體氣血津液運行失調,膏脂代謝紊亂,形成痰濁、瘀血等病理產物,壅塞脈道而成本病[9]。高脂血癥為本虛標實之候,以痰濕、瘀血為本,以脾、腎虧虛為標,病位在血脈,治宜健脾除濕、理氣活血、祛痰化瘀。通絡化濁丸由8味中藥組成,方中丹參、三七、川芎活血化瘀,共為君藥;山楂、決明子為臣藥,協(xié)同發(fā)揮消食導滯、降脂化濁之效;配合佐藥茯苓、薏苡仁健脾滲濕,使藥西洋參補氣養(yǎng)陰、清熱生津。數(shù)藥合用,故能復其氣機以升清,降其凝脂以化濁,通其經(jīng)絡以生新。

經(jīng)臨床與科學研究證實,通絡化濁丸具有降低血脂含量、減輕脂肪肝、減少心腦血管不良事件發(fā)生的作用,其組成合理,配伍嚴謹,療效確切。丹參、山楂提取液可顯著降低血清膽固醇、甘油三酯、LDL-C含量,進而降低HPL患者肝臟質量[10]。有關研究[11]指出,復方三七護脈湯具有良好的降壓、降脂功效,在治療高血壓伴血管性動脈硬化方面療效顯著。山楂、決明子提取液具有抑制HMGCR基因表達、降低血脂、減輕肝組織脂肪變性的作用[12]。此外,茯苓被證實能夠作用于HPL內源性產物生成和代謝途徑,有效調節(jié)脂質代謝紊亂[13]。氣血并治方(含川芎)能顯著降低TC、LDL-C、TG含量,在脂質代謝、血小板聚集、活化分子表達等方面發(fā)揮出重要作用[14]。降脂方主要由薏苡仁、山楂、丹參、決明子等組成,具有健脾補腎、清熱祛濕的功效[15]。相關研究表明,西洋參提取液能減少膽固醇的合成,并能有效控制動脈粥樣硬化[16]。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法對通絡化濁丸防治HPL的有效組分進行初步篩選,得到6種活性成分:槲皮素,蘆薈大黃素,人參皂苷Rh2,丹參酮,山柰酚,隱丹參酮。槲皮素能降低成脂基因的表達水平,可抑制腸內膽固醇的吸收,減少氧化應激[17]。蘆薈大黃素能選擇性地抑制前蛋白轉化酶-枯草素9/LDL受體途徑,從而降低膽固醇含量[18]。有關研究顯示,人參皂苷Rh2可降低血漿IL-6含量,并可抑制TIMP-1、VEGFA的表達,從而發(fā)揮防治動脈粥樣硬化的作用[19]。丹參酮IIA具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等作用,能有效減少肝臟脂質沉積[20]。山柰酚能抑制PKB和提高過氧化物酶體增殖劑活化受體,從而起到降TG的作用[21]。隱丹參酮可通過激活腺苷酸激活蛋白激酶AMPK來改善胰島素敏感性,進而調控體內脂類代謝異常[22]。綜上,通絡化濁丸可能通過這些活性成分表現(xiàn)出防治HPL的作用,包括抑制脂質吸收、抗氧化應激反應、抗動脈硬化、抗炎等,體現(xiàn)出通絡化濁丸所含活性成分治療HPL的有效性和多樣性。

蛋白互作網(wǎng)絡拓撲分析結果顯示,通絡化濁丸與HPL關聯(lián)密切的核心靶點有VEGFA、IL1B、MMP9、EGFR、CCL2、ICAM1、EGF、SERPINE1、TNF、IL6。VEGFA通過調節(jié)LDL-C、HDL-C,導致炎癥細胞浸潤,并誘導新生血管生成,從而加速動脈粥樣硬化的損害[23]。IL6通過影響TC、LDL-C、HDL-C的含量,增加血液黏滯度,在炎癥反應、動脈粥樣硬化、血栓形成中起著關鍵作用[24]。研究表明,IL1B在高膽固醇血癥的脂肪變性及肝纖維化中扮演重要角色[25]。MMP9是HPL患者早期動脈粥樣硬化的一個重要血清學指標,MMP9的表達水平與頸動脈中膜厚度有顯著的相關性[26]。EGFR抑制劑可明顯降低血清LDL、TCH、TG的含量,并能明顯減輕肥胖引起的心肌損傷[27]。有關研究顯示,CCL2在不同類型肝損傷中表達增高,并可能參與肝組織的炎癥反應,對HPL的發(fā)生和肝脂肪變性有重要影響[28]。ICAM-1基因活化后,可使單核細胞聚集并遷移至血管內皮細胞,并能增強炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡、動脈硬化及血栓形成[29]。SERPINE1是一種普遍存在于糖-脂代謝疾病中的生物標志物,參與脂肪和能量代謝。有關研究指出,TNF-α是一種非特異性免疫調節(jié)劑,可以直接或間接地影響脂肪細胞內脂類物質的合成及降解[30]。綜合以上研究發(fā)現(xiàn),通絡化濁丸在防治HPL中具有抗氧化應激、抑制炎癥反應、抗動脈粥樣硬化、減少血栓形成等多重作用。

通過GO功能和KEGG富集分析,本研究發(fā)現(xiàn)關鍵靶點在HPL相關的生物功能和信號途徑上表現(xiàn)出明顯的富集。通絡化濁丸治療HPL的作用機制主要包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化、化學致癌-受體活化、TNF信號通路、HIF-1信號通路等。AGE-RAGE信號通路在調節(jié)糖尿病血管重塑中起著重要作用,可以通過AGE受體的傳遞而誘導血糖、血脂和血壓的增高,從而促進動脈粥樣硬化[31]。大量研究顯示,流體剪切應力能夠通過調控基因表型,影響血管內皮的結構與功能,進而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[32]。有關研究指出,TNF信號通路的下調可以抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變所致的血管炎癥反應,并能抑制脂肪細胞miRNA的轉錄[33-34]。HIF-1α不僅可以通過上調VEGF的表達來促進血管新生,還能通過調節(jié)CXCL1的表達來增加脂質在局部的蓄積,從而提高脂質含量[35-36]。據(jù)此,通絡化濁丸具有抗炎、保護內皮細胞的作用,并通過抑制血管新生來防止HPL的發(fā)生。

本研究在網(wǎng)絡藥理學方法的基礎上,初步確定通絡化濁丸治療HPL的主要活性成分及核心靶點,并進一步證實其在HPL的治療中具有多組分、多靶點、多途徑的作用特點。通過計算機模擬分子對接,證明通絡化濁丸的主要活性成分與核心靶標之間具有較強的結合活性,為進一步的動物及細胞實驗研究奠定基礎。