基于“傳統(tǒng)+分子生物學”聯(lián)用技術(shù)鑒定 云南華寧產(chǎn)四數(shù)九里香藥材

周永福,姚如杰,黎學明

(1.重慶工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 應用技術(shù)推廣中心,重慶 401120;2.重慶紫光化工股份 有限公司 技術(shù)中心,重慶 401121;3.重慶大學 化學化工學院,重慶 400044)

民族藥“一物多名”“同名異物”“一藥多原”現(xiàn)象突出。四數(shù)九里香(MurrayatetrameraHuang)為蕓香科(Rutaceae)九里香屬(Murraya)植物,主要分布于云南、廣西、廣東、湖南;藥用記載始于《文山中草藥》,后作為民族藥收載于《中國民族藥志要》[1]中,民族藥名為千只眼。《云南省中藥材標準》記載:“本品為蕓香科植物千只眼MurrayatetrameraHuang的干燥葉和帶葉嫩枝;夏、秋季采集,陰干;性辛,溫;歸肺、肝經(jīng)?！庇徐铒L解表、行氣止痛、活血散瘀的功效,用于治療感冒發(fā)熱、咳嗽、目赤澀痛、皮膚瘙癢、濕疹、風濕麻木、筋骨疼痛、瘀血腫痛。近期研究表明,四數(shù)九里香具有良好的藥理活性及較高的藥用價值[2],目前,因其富含生物堿且具有多種藥理作用,有希望成為抗腫瘤新藥[3]而備受關(guān)注。

然而,關(guān)于四數(shù)九里香的分類學長期存在爭議[4]。原因有以下幾點:一是四數(shù)九里香別名多,如滿山香、滿天香、過山香、千只眼、四數(shù)花九里香、臭漆、透光草、穿花針,存在與其他種共用別名現(xiàn)象;二是部分處方所用藥為替代品,如中成藥“三九胃泰”的主藥之一,有文獻報道的是九里香[5],學名為Murrayaexotica(L.),有的報道是四數(shù)九里香[6-7],學名為MurrayatetrameraC.C.Huang;三是四數(shù)九里香學名不統(tǒng)一,如有MurrayatetrameraC.C.Huang[8]、MurrayatetrameraHuang in Acta Phytotax.Sin[9]、MurrayatetrameraHuang[10];四是學名一致,但因揮發(fā)油成分不一,導致對四數(shù)九里香的分類存在爭議[11-13]。

近年來,由于PCR技術(shù)的快速發(fā)展,使得分子鑒定技術(shù)正逐漸成為中藥鑒定的主要手段[14-15]。DNA條形碼作為分子鑒定技術(shù)的一種方法,早在2003年由加拿大生物學家Paul Hebert教授提出,因其具有種內(nèi)變異小、種間變異大及變異區(qū)兩端序列高度保守等特點,被用于物種的鑒定和識別[16-18]。ITS2序列作為DNA條形碼具有獨特優(yōu)勢:通用性強,種間變異高于種內(nèi)變異,擴增片段長度適宜,擴增效率高[19]。陳士林[20]對6 000余份藥用植物樣本進行DNA條形碼序列探索和研究,結(jié)果表明ITS2序列的鑒定能力優(yōu)于國際條形碼協(xié)會植物工作組提出的matK和rbcL組合,故首次提出將ITS2作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。

本文為有效解決四數(shù)九里香分類學存在的問題,課題組結(jié)合現(xiàn)代生物學技術(shù),提出采用“傳統(tǒng)+分子生物學”技術(shù)聯(lián)用鑒定云南華寧產(chǎn)四數(shù)九里香的方法,從植物來源、外觀評價、顯微鑒定、理化鑒定、薄層色譜鑒定、分子生物學6個方面系統(tǒng)鑒定本地四數(shù)九里香植物,以期為該民族藥分類學研究提供參考。

1 實驗材料

藥材來源于蕓香科(Rutaceae)九里香屬(Murraya)四數(shù)九里香M.tetrameraHuang的干燥葉,2016年2月采自于云南省華寧縣。鑒定彝藥千只眼所涉及到的實驗材料見表1。序列的Genbank登錄號見表2。

表1 千只眼分子生物學鑒定儀器及材料

表2 NCBI數(shù)據(jù)庫中的九里香屬植物ITS2序列 及GenBank登錄號信息

2 實驗方法

2.1 傳統(tǒng)鑒定方法

采用傳統(tǒng)的鑒定方法(植物來源、外觀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別)對四數(shù)九里香藥材進行鑒定。

2.2 分子鑒定方法

2.2.1 RNA提取方法 四數(shù)九里香葉片總RNA的提取步驟及方法按北京天根生化科技(北京)有限公司植物基因組試劑盒提取。四數(shù)九里香葉片組織經(jīng)過無水乙醇清洗干凈后,取植物組織(干重)約30mg,加入液氮、碾磨;將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預先裝有700μL,65℃預熱緩沖液GP1的離心管中(實驗前在預熱的GP1加入巰基乙醇使其終濃度為1%),迅速顛倒混勻后,將離心管放于65℃水浴20min,水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次;加入700μL氯仿,充分混勻,12 000rpm (～13 400×g) 離心5min;小心地將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中,加入700μL緩沖液GP2,充分混勻;將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中,12 000rpm (～13 400×g) 離心30sec,棄掉廢液;向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12 000rpm(～13 400×g)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中;向吸附柱CB3中 加入600μL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12 000rpm(～13 400×g)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中;將吸附柱CB3放回收集管中,12 000rpm(～13 400×g)離心2min,倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200μL洗脫緩沖液TE,室溫放置2～5min,12 000rpm(～13 400×g)離心2min,將溶液收集到離心管中。

2.2.2 PCR擴增方法 根據(jù)GenBank登錄的九里香屬ITS2序列保守區(qū)域設(shè)計一對擴增引物,引物序列見表3,由成都擎科偉業(yè)有限公司提供。PCR反應體系及擴增條件見表4、表5。

表3 四數(shù)九里香ITS2基因的擴增引物

表4 擴增引物反應體系

表5 PCR 擴增儀擴增條件

根據(jù)計算,按照一定比例配制足量的PCR反應體系,體系包括ddH2O8.5μL,正反向引物各1.0μL,I-5TM2x High-Fidelity Master Mix 12.5μL,模板DNA 2μL,為25μL。

擴增程序:預變性:98℃、2min;循環(huán):98℃、10s;退火:55℃、30s;延伸:72℃、30s;循環(huán)35次;末次延伸為72℃、5min,4℃,5min。PCR反應設(shè)置不含DNA模板的溶液作為空白對照。

2.2.3 凝膠電泳方法 取0.2g的瓊脂糖粉末,置于150mL錐形瓶中,加入適量的電泳緩沖溶液TBE,制得1.5%瓊脂糖凝膠液,冷卻、制得支持物,根據(jù)擴增產(chǎn)物的位點,用相應的酶切。取PCR擴增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂凝膠電泳檢測,在150V、100mA的電場強度下,通過分子篩效應篩選20min,觀察溴酚藍帶的移動現(xiàn)象,待電泳分離后,于紫外透視儀觀察圖譜,獲得符合理論的雙向測序片段。

2.2.4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 將測序所得的文件用軟件對測序結(jié)果校對和拼接,直接將四數(shù)九里香的ITS2基因核苷酸序列(450bp),拼接結(jié)果與表2(序列的GenBank登錄號)進行Blast比對,計算K2P遺傳距離,再構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

3 實驗結(jié)果

3.1 藥材來源

2016年2月,課題組在云南苗嶺山莊藥業(yè)股份有限責任公司專家周玉忠(苗藥專家)的指導和帶領(lǐng)下,親赴云南省華寧縣青龍鎮(zhèn)馬鹿塘村委會馬鞍山村(民族村)的河谷(當?shù)亟邢埠谏焦?采樣。四數(shù)九里香被當?shù)孛褡?苗族)稱為“蒙鼻諸第日”,而貴州松桃地區(qū)苗人稱為“Ndutjeub”。樣品后經(jīng)成都中醫(yī)藥大學陳新教授鑒定為蕓香科(Rutaceae)九里香屬(Murraya)四數(shù)九里香M.tetrameraHuang植物。目前,標本保存于重慶工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院藥物化學研究所,見圖1。

注:該圖為2016年2月周永福攝于云南華寧。

經(jīng)采樣現(xiàn)場勘查,該植物群落生長在伴有石灰?guī)r的斜坡環(huán)境中,植株根系發(fā)達,個體高、葉茂盛;該植物群落大、棚數(shù)多,占地面積達20公頃,生產(chǎn)年限久遠。課題組在采樣后,樣品經(jīng)當?shù)鼐用袷褂抿咇R馱運至機動車能到達處。

3.2 外觀鑒別

該植物生長于伴有石灰?guī)r的斜坡中,喜溫濕氣候,高1～7m;葉片呈披針形或卵形,單數(shù)羽狀復葉,小葉5～9片,長0.8～2.5cm,寬0.8～2.0cm,先端鈍尖,基部楔形,見圖2、圖3、圖4,新鮮葉為深綠色,氣味濃,表面有色澤,干燥后呈暗綠色。

圖2 四數(shù)九里香干燥葉外觀性狀

圖3 四數(shù)九里香生境(二)

圖4 四數(shù)九里香莖外觀性狀

3.3 顯微鑒別

四數(shù)九里香葉粉末呈現(xiàn)綠褐色,表皮細胞呈不規(guī)則形,氣孔多數(shù)不定式;非腺毛單細胞長30～100μm,壁厚;葉肉組織成晶纖維;柵欄組織細胞排列成行,含草酸鈣方晶;油室直徑60～120μm,呈圓形,有的內(nèi)含黃色油滴。

3.4 理化鑒別

取四數(shù)九里香粗粉2g(20目),加乙醇20mL,回流提取30min,冷卻、濾過;取濾液5mL,蒸干,殘渣加乙酸乙酯2mL溶解,置試管中,加新制的7%鹽酸羥胺-甲醇溶液與10%氫氧化鉀-甲醇溶液各2～3滴,搖勻,微熱,放冷,加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3～4,加1% TeCl3-CH3CH2OH溶液,反應現(xiàn)象為紫紅色。

3.5 色譜鑒別

取四數(shù)九里香粗粉2g(20目),加乙醇20mL,回流提取30min,冷卻、濾過、蒸干,殘渣加甲醇2mL溶解,置樣品瓶中,用毛細管取樣、點板,在展開槽中進行展開,展開劑為丙酮比二氯甲烷=1∶1,在254nm波長處觀察,存在斑點。

3.6 分子鑒定結(jié)果

3.6.1 樣品總RNA提取 按照北京天根生化科技(北京)有限公司植物基因組試劑盒提取步驟及方法提取四數(shù)九里香葉片總RNA,結(jié)果顯示,提取的總RNA質(zhì)量好,條帶清晰,無明顯降解。

3.6.2 PCR擴增結(jié)果 利用所設(shè)計的成熟酶K基因擴增引物F1/R2對四數(shù)九里香葉的cDNA進行PCR擴增,經(jīng)擴增之后,采用瓊脂糖凝膠電泳分析方法在150V、100mA 的條件下分析20min,四數(shù)九里香的PCR電泳結(jié)果顯示亮條帶,得長度約為450bp的擴增片段,PCR產(chǎn)物雙向測序結(jié)果見圖5、圖6。測序結(jié)果表明該基因為四數(shù)九里香的ITS2基因序列。經(jīng)過NCBI序列相似性比對(Blastn),發(fā)現(xiàn)該植物基因核苷酸序列與GenBank中的Murraya tetramera(登錄號:KR532413)的matK基因核苷酸序列一致。

注:M為DL2000 Marker,I為樣本擴增電泳結(jié)果。

圖6 樣本測序峰圖(部分)

3.6.3 Matk拼接結(jié)果 經(jīng)過軟件拼接之后,獲得完整的四數(shù)九里香高質(zhì)量DNA序列圖譜;結(jié)果為GAAGTAAATATTTGACTCGATACAAACTCTTTT TTGTTGAAGATCCGCTGTAATAATGAGAAAGA TTTCTGCATATACGCACAAATCGGTCGATAAGA TGAGAATCAGAGAAATCGGCCCAGGTCGACTT ACTGATGGGATGCCCTAATGCGTTACAAAACCG CGCCTTAGTCAATGATCCAATCAGATGAATAAT GGGAACGGTCGTATCGACCTTCTTCCTAGAATT ACCTATTAGAAATGAATTTTCTAGCATTTGACT CCGTACCAACAAAGAATTGAGTCGCACACCGG AAAGATAGCCCAGAAAGTTAATAGCGTACTTGC CTAAATATAAGTGGTTTAGCTGAACCCTTCCTGGTCGAGAAGACACGTGAAAATGCCATTGCCATA AACCGACAAGGTAATATTTCCATTTATTCATCAG AAGAGGCGTATCCTTTGAAGCCAAAATGGATTT TCCTTGATATCTAACATAATGCATGAAAGGATCC TTGAACAACCCTAAGATGTCCGGAAAATCTTTA GCAACATCTTCGACAAGATGTTCGACTTTTCCA TAGAAATACATTCGCTCAACGAGGACTCGAGAG GATGTTGATTGTAAATGAGATGCTTGGTTACAG AGAAAAAAGAGGATGGATTCATATTCATATACAT GAGAATTATATAGAAACAATAACAATCTTGGATT ACTTTTTAAAAAAACAGAAATAGAGTTCTTTG GAGTAATAAGACTGTTCGAATTAAAATACTCGT GGAGAAAGAACCGTAATAAATGTAAAGAAGAG GCATCCTTTACCCAGTCGCGAAGGGTTTGAAC CAGGATTTCGGGACAAGTGGGGTGGGGTATTC GTACATCTAACACATAATTTAAATGGGACAATT TATCC。該研究結(jié)果為云南華寧產(chǎn)四數(shù)九里香提供分子生物學鑒定依據(jù)。

3.6.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 對四數(shù)九里香的ITS2基因進行測序獲得其高質(zhì)量的DNA序列,利用MEGA6.0軟件與GenBank中下載的九里香屬植物ITS2序列鄰接、構(gòu)建聚類系統(tǒng)發(fā)育樹,見表6、圖7。從構(gòu)建的NJ樹可以看出,所分析樣品與GenBank中的四數(shù)九里香聚為一支,說明可以將所分析的樣品與四數(shù)九里香歸為一個種,因此,ITS2序列作為條形碼可以快速準確鑒別民族藥四數(shù)九里香及其同屬植物,這一結(jié)論與外觀評價一致,為外觀評價準確性提供分子證據(jù)。

注:*YB為四數(shù)九里香植物樣本,下同。

表6 九里香屬植物ITS2序列遺傳距離分析

3.6.5 遺傳距離 將各序列用Mega 6.0軟件進行樣本序列比對之后,與NCBI數(shù)據(jù)庫中九里香屬植物ITS2序列的K2P遺傳距離進行對比,結(jié)果見表6,發(fā)現(xiàn)樣本與九里香屬植物的K2P遺傳距離介于0.017～0.048之間,其中與四數(shù)九里香(M.tetramera)K2P的遺傳距離最小為0.017,與小葉九里香(M.microphylla)和調(diào)料九里香(M.koenigii)K2P遺傳距離最大均為0.048。

4 討論與結(jié)論

近年來,關(guān)于民族藥四數(shù)九里香的研究和報道主要集中在化學成分及其藥理作用方面,而針對于其物種鑒別鮮有報道。隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展,分子鑒定技術(shù)已經(jīng)成為中草藥鑒定的主要手段,本文從藥材來源、外觀評價、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒定、分子生物學鑒定六個層面系統(tǒng)地對民族藥四數(shù)九里香進行鑒定研究。采用Mega 6.0軟件計算檢測四數(shù)九里香DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中九里香屬植物ITS2序列的K2P遺傳距離,并進行了比對,發(fā)現(xiàn)民族藥四數(shù)九里香與數(shù)據(jù)庫中的K2P遺傳距離最小,為0.017;同時采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹發(fā)現(xiàn)檢測樣本與四數(shù)九里香聚為一致;此結(jié)果為民族藥四數(shù)九里香在基原及品種鑒定上提供了依據(jù)。