蟲草扶正方協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用研究

蔣均才,康小燕,陳 坤,武萬興,汪小東,李 潤(rùn)*,梅全喜

(1.宜昌東陽光長(zhǎng)江藥業(yè)股份有限公司,湖北 宜昌 443300;2.東莞市東陽光冬蟲夏草 研發(fā)有限公司,廣東 東莞 523000;3.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院,廣東 深圳 518000)

《素問·刺法論》提出“正氣存內(nèi),邪不可干”,如果體內(nèi)正氣充沛,外界致病之邪氣就不能侵襲機(jī)體。正氣是人體內(nèi)部各個(gè)系統(tǒng)協(xié)調(diào)運(yùn)作、維持身體平衡穩(wěn)定狀態(tài)的基礎(chǔ)。免疫力則是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的概念,是機(jī)體對(duì)外界病原體、抗原等異物的識(shí)別和排除反應(yīng)的能力,是人體自身防御機(jī)制的一種重要表現(xiàn)。在概念和功能上,中醫(yī)的“正氣”理論與免疫有很多相似之處,正氣和免疫力都是機(jī)體正常生理功能,共同發(fā)揮防御、自穩(wěn)、監(jiān)視作用。因此,增強(qiáng)正氣,或者增強(qiáng)機(jī)體的免疫力,提高機(jī)體自我調(diào)節(jié)能力,以預(yù)防疾患發(fā)生,維護(hù)身心健康[1]。

蟲草扶正方由冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂組成,具有扶正固本,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,調(diào)整機(jī)體亞健康狀態(tài)的作用。方中冬蟲夏草與西洋參、北沙參同用,具有補(bǔ)肺益腎、益氣養(yǎng)陰的功效,稍佐以肉桂鼓舞正氣,增強(qiáng)冬蟲夏草培補(bǔ)下元的作用。全方性味平和,陰陽雙補(bǔ),可調(diào)和肺、腎等臟腑功能,提高免疫力,增強(qiáng)身體機(jī)能?，F(xiàn)代研究表明,冬蟲夏草、西洋參、北沙參能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[2-11],但三者配伍增強(qiáng)免疫力的研究尚未見報(bào)道。為此,參考國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局《保健食品功能評(píng)價(jià)方法(2020年版)(征求意見稿)》,對(duì)以冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂為原料配伍的蟲草扶正方進(jìn)行免疫力功能試驗(yàn)研究,探討其機(jī)制,為后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠,體質(zhì)量18～22g,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(湘)2015-0016,檢疫合格。

1.2 藥品與試劑

蟲草扶正方組成:冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂,采用已上市HEC牌冬蟲夏草經(jīng)典復(fù)方膠囊,由東莞市東陽光冬蟲夏草研發(fā)有限公司提供(批號(hào):H0408BU),冬蟲夏草粉(批號(hào):BJ20190117)由東莞市東陽光冬蟲夏草研發(fā)有限公司提供,肉桂(批號(hào):XC20190215)由西安小草植物科技有限責(zé)任公司提供,北沙參(批號(hào):DJC13)和西洋參(批號(hào):DED30)由順天本草股份有限公司提供,藥材均符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)標(biāo)準(zhǔn)[12]。

刀豆蛋白A(批號(hào):C5272-0019)購自Sigma;噻唑藍(lán)(批號(hào):190213)購自上海源葉生物科技有限公司;0.9%氯化鈉注射液(批號(hào):A19021103)購自湖南康源制藥有限公司;SA緩沖液(批號(hào):S31106)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;都氏液(批號(hào):D190417)購自路非凡生物科技有限公司;綿羊血紅細(xì)胞SRBC(批號(hào):YC-X00106)購自鄭州百基生物技術(shù)有限公司;CCK-8試劑盒(批號(hào):FK774)購自日本同仁化學(xué);LDH試劑盒(批號(hào):GL19302)購自東仁化學(xué);印度墨汁(批號(hào):P0544-0012)購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

HERAcell?150i型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司);ST16型離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司);DJB系列不銹鋼流架(蘇州市蘇杭科技器材有限公司);SW-CJ型超凈操作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);PHERAstarFS型酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG LABTECH GMbH公司);ME403E/02型梅特勒天平(美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

2.1.1 蟲草扶正方拆方協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用 本實(shí)驗(yàn)采用正常小鼠,按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、蟲草扶正方組、冬蟲夏草+北沙參+肉桂組、冬蟲夏草+西洋參+肉桂組、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組、西洋參+北沙參+肉桂組、冬蟲夏草組、西洋參組、北沙參組、肉桂組共10組,每組各10只小鼠。各組小鼠用帶有灌胃針頭的注射器經(jīng)口灌胃給藥,按照體質(zhì)量計(jì)算給藥體積,給藥體積為10mL/kg。給藥劑量如表1所示,正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水,每天給藥1次,連續(xù)給藥30天。

表1 動(dòng)物分組及給藥劑量

供試樣品按照表2中的比例(質(zhì)量百分比)進(jìn)行稱量,經(jīng)粉碎,過80目篩,混合,樣品稱取適量后分別加入相應(yīng)體積的蒸餾水超聲溶解,配置濃度為30mg/mL。

表2 各試驗(yàn)組分組及原料占比情況 (%)

2.1.2 蟲草扶正方不同劑量免疫調(diào)節(jié)作用 本實(shí)驗(yàn)采用正常小鼠,按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、蟲草扶正方100mg/kg組、蟲草扶正方200mg/kg組、蟲草扶正方300mg/kg組、蟲草扶正方400mg/kg組,共5組,每組各10只小鼠。4組蟲草扶正方的給藥劑量分別相當(dāng)于人體推薦量的10倍、20倍、30倍、40倍。各組小鼠用帶有灌胃針頭的注射器經(jīng)口灌胃給藥,按照體質(zhì)量計(jì)算給藥體積,給藥體積為10mL/kg。正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水,每天給藥1次,連續(xù)給藥30天。

2.2 ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)

灌胃給予供試品30天后,用頸椎脫臼法處死小鼠,取脾臟并使用RPMI1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,每一份脾細(xì)胞懸液分2孔加入96孔培養(yǎng)板中,每孔100μL。一孔加10μg/mL的刀豆蛋白A液(ConA液)10μL,另一孔加入等量PBS作為對(duì)照。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加CCK8液,再繼續(xù)培養(yǎng)4h后進(jìn)行檢測(cè)。每孔做3個(gè)平行孔,用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。脾淋巴細(xì)胞的增殖能力用ConA的OD值減去不加ConA的OD值表示。供試樣品組的OD差值顯著高于對(duì)照組的OD值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.3 小鼠碳廓清能力檢測(cè)

連續(xù)灌胃給予供試品30天后,通過尾靜脈注射生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,注射量按10mL/kg體質(zhì)量計(jì)算。在注射后2min、10min從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL,加入到2mL 0.1 % Na2CO3溶液中,用酶標(biāo)儀在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值,并將小鼠處死,取肝臟、脾臟稱質(zhì)量,計(jì)算吞噬指數(shù),以表示小鼠碳廓清的能力。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a,受試樣品的吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組的吞噬指數(shù),可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.4 NK細(xì)胞活性測(cè)定

灌胃給予供試品30天后,用頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液,按乳酸脫氫酶測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定OD值,計(jì)算NK細(xì)胞活性。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性,供試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK細(xì)胞活性,即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

NK細(xì)胞活性(%)=

2.5 血清溶血素試驗(yàn)

各組小鼠按10mL/kg灌胃給予相應(yīng)供試樣品或蒸餾水,1次/天,連續(xù)30天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第5天,每只小鼠腹腔注射0.2mL 2%(v/v)SRBC進(jìn)行免疫。末次給樣1h后,摘眼球取血,收集血清用0.9%氯化鈉注射液稀釋,收集血清用0.9%氯化鈉注射液稀釋,按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)半數(shù)溶血值(HC50)。供試樣品各劑量組與正常對(duì)照組進(jìn)行比較,供試樣品組的HC50顯著高于對(duì)照組,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 蟲草扶正方拆方協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用

3.1.1 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)過程中,所有小鼠活動(dòng)良好,皮毛光滑,飲食和飲水正常,無精神不振情況,蟲草扶正方組及各不同配伍組與正常對(duì)照組的比較,小鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3所示。

表3 各組受試物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

3.1.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 如表4所示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方組、冬蟲夏草+北沙參+肉桂組及冬蟲夏草+西洋參+北沙參組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖活性在ConA誘導(dǎo)下顯著增加(P<0.01),而其他組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖活性無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 蟲草扶正方及不同配伍對(duì)小鼠免疫功能的影響

3.1.3 小鼠碳廓清能力試驗(yàn) 如表4所示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高(P<0.01),冬蟲夏草+西洋參+北沙參組及冬蟲夏草組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高(P<0.05),而其他組別小鼠的吞噬指數(shù)無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.1.4 NK細(xì)胞活性測(cè)定 如表4所示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方組、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組及冬蟲夏草組小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性顯著增加(P<0.01),而其他組小鼠的NK細(xì)胞較正常對(duì)照組相比無顯著變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方組(冬蟲夏草+西洋參+北沙參+肉桂)、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組小鼠的脾淋巴細(xì)胞ConA誘導(dǎo)下增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞殺傷活性均顯著增強(qiáng)(P<0.01或P<0.05),冬蟲夏草組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞殺傷活性均顯著增強(qiáng)(P<0.01或P<0.05)。根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法(2020年版)(征求意見稿)》中增強(qiáng)免疫力指導(dǎo)原則,這3組受試樣品均具有增強(qiáng)免疫力作用,其中,蟲草扶正方組的效果要優(yōu)于冬蟲夏草+西洋參+北沙參組,冬蟲夏草+西洋參+北沙參組的效果優(yōu)于冬蟲夏草組。與正常對(duì)照組相比,冬蟲夏草+北沙參+肉桂組小鼠的脾淋巴細(xì)胞ConA誘導(dǎo)下增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.01),巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及NK細(xì)胞活性均無明顯變化。與正常對(duì)照組相比,其他5組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及NK細(xì)胞活性均無明顯變化。

3.2 蟲草扶正方不同劑量免疫調(diào)節(jié)作用

3.2.1 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)過程中,所有小鼠活動(dòng)良好,皮毛光滑,飲食和飲水正常,無精神不振情況,蟲草扶正方組及各對(duì)比例組小鼠的體質(zhì)量與正常對(duì)照組的比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表5所示。

表5 各組受試物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

3.2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 當(dāng)淋巴細(xì)胞受ConA刺激后淋巴母細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng),淋巴細(xì)胞數(shù)目增加。CCK8檢測(cè)ConA刺激后淋巴細(xì)胞增殖細(xì)胞數(shù)量即可反映出淋巴細(xì)胞受抗原刺激后機(jī)體的免疫力強(qiáng)弱。如表6所示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方1組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05),蟲草扶正方2組、3組和4組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.01),判定蟲草扶正方各劑量組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性。

表6 蟲草扶正方各劑量組對(duì)小鼠免疫功能的影響

3.2.3 小鼠碳廓清能力試驗(yàn) 巨噬細(xì)胞的吞噬功能是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo),當(dāng)小鼠尾靜脈注射墨汁后,外周血中的巨噬細(xì)胞會(huì)吞噬異物顆粒,檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)a的大小能夠反映出機(jī)體巨噬細(xì)胞吞噬功能的高低。如表6所示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方2組和蟲草扶正方4組小鼠的吞噬指數(shù)顯著升高(P<0.05),蟲草扶正方3組小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高(P<0.01),而蟲草扶正方1組單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力與正常對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),判定蟲草扶正方2組、3組、4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性,蟲草扶正方1組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3.2.4 NK細(xì)胞活性測(cè)定 NK細(xì)胞是一類具有殺傷作用的天然免疫細(xì)胞群,NK細(xì)胞殺傷活性是機(jī)體非特異性免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。NK細(xì)胞與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)條件下,靶細(xì)胞被NK細(xì)胞殺傷,并釋放出LDH(乳酸脫氫酶)到細(xì)胞外。因此用LDH細(xì)胞毒試劑盒檢測(cè)LDH釋放量即可反映出NK細(xì)胞的殺傷活性,進(jìn)而反應(yīng)機(jī)體免疫功能。如表6所示,與正常對(duì)照組相比蟲草扶正方3組NK細(xì)胞殺傷活性極顯著增強(qiáng)(P<0.01),而蟲草扶正方1組、2組和4組NK細(xì)胞殺傷活性與正常對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),判定蟲草扶正方3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性,蟲草扶正方1組、2組和4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3.2.5 血清溶血素試驗(yàn) 用綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠,可引發(fā)小鼠血清中的特異性抗綿羊紅細(xì)胞抗體的產(chǎn)生,該抗體是一種溶血素,能夠溶解綿羊紅細(xì)胞。如表6所示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方各劑量組半數(shù)溶血值無顯著性差異(P>0.05)。

蟲草扶正方由冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂組成,本試驗(yàn)從細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性等方面研究蟲草扶正方的免疫調(diào)節(jié)功能。根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法(2020年版)(征求意見稿)》中增強(qiáng)免疫力指導(dǎo)原則,在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面中任兩個(gè)方面結(jié)果陽性,可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用。表6實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方劑量2組、3組、4組均具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能,其中最低有效作用劑量為200mg/kg。

4 結(jié)果與討論

研究結(jié)果表明,組成蟲草扶正方的各味藥材間(冬蟲夏草、西洋參、北沙參、肉桂)存在免疫協(xié)同作用,在同等劑量條件下復(fù)方的免疫協(xié)調(diào)作用明顯優(yōu)于單味藥材或部分藥材組合;且蟲草扶正方在不同劑量條件下(200、300、400mg/kg)具有脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性、NK細(xì)胞殺傷活性和巨噬細(xì)胞吞噬活性,根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法(2020年版)(征求意見稿)》評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定:蟲草扶正方具有增強(qiáng)免疫力的作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,冬蟲夏草、西洋參及北沙參具有增強(qiáng)免疫力的功能[2-11],其中冬蟲夏草增強(qiáng)免疫力的最低有效作用劑量為200mg/kg[13],西洋參增強(qiáng)免疫力的最低有效作用劑量為550mg/kg[14-15],北沙參增強(qiáng)免疫力的最低有效作用劑量為2 000mg/kg[16],而肉桂未見有增強(qiáng)免疫力方面的報(bào)道。蟲草扶正方不同劑量實(shí)驗(yàn)中,蟲草扶正方增強(qiáng)免疫力的最低有效作用劑量為200mg/kg,整體配方最低有效作用劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道中西洋參及北沙參等單味藥材的最低有效作用劑量,說明蟲草扶正方各味藥材具有協(xié)同免疫的作用。

在蟲草扶正方拆方配伍協(xié)同作用試驗(yàn)中,同等劑量(300mg/kg)條件下,與正常對(duì)照組相比,冬蟲夏草組具有增強(qiáng)免疫力的作用,冬蟲夏草組的試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道吻合,西洋參及北沙參組由于供試樣品劑量未達(dá)到最低起效劑量,故未體現(xiàn)出提高免疫力的效果。與正常對(duì)照組相比,冬蟲夏草+西洋參+北沙參組具有明顯的增強(qiáng)免疫力的作用,冬蟲夏草+北沙參+肉桂組、冬蟲夏草+西洋參+肉桂組及西洋參+北沙參+肉桂組未體現(xiàn)增強(qiáng)免疫力的作用,說明冬蟲夏草、西洋參、北沙參三者的合理配比具有提高免疫力的效果,其他三味藥材的組合未體現(xiàn)明顯效果。與正常對(duì)照組相比,蟲草扶正方組(冬蟲夏草+西洋參+北沙參+肉桂)、冬蟲夏草+西洋參+北沙參組具有明顯的增強(qiáng)免疫力的作用,且蟲草扶正方組的效果優(yōu)于冬蟲夏草+西洋參+北沙參組,說明添加肉桂強(qiáng)化了冬蟲夏草、西洋參、北沙參的提高免疫力的效果,進(jìn)一步說明冬蟲夏草、西洋參、北沙參及肉桂具有協(xié)同提高免疫力的作用。

蟲草扶正方組將冬蟲夏草、西洋參、北沙參合理配伍,加強(qiáng)整體配方增強(qiáng)免疫力的功能。本研究證明蟲草扶正方能夠促進(jìn)機(jī)體的免疫功能且具有協(xié)同作用,但未深入探究蟲草扶正方增強(qiáng)免疫功能的分子作用機(jī)制,有必要在今后對(duì)其作用機(jī)制及其他功效作進(jìn)一步探討,從而為此類復(fù)合物的應(yīng)用研究提供更全面的參考信息。