基于蛋白組學(xué)篩選的外周血蛋白在膿毒癥診斷中的應(yīng)用

王澤田, 齊 越, 唐建國

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院 急危重癥醫(yī)學(xué)科, 上海, 200240)

膿毒癥是導(dǎo)致急危重癥患者死亡的最主要原因[1], 即使在接受積極抗感染、液體復(fù)蘇、多臟器功能支持等治療后,患者病死率仍然很高,因此早期及時(shí)識別膿毒癥對及時(shí)治療膿毒癥、降低病死率、減輕社會負(fù)擔(dān)非常重要[2]。膿毒癥早期癥狀不典型,不容易被及時(shí)識別,因此尋找新的生物標(biāo)志物對早期識別和診斷膿毒癥具有重要作用。生物標(biāo)志物不僅可以用于早期診斷膿毒癥,也可以反映膿毒癥的嚴(yán)重程度[3]。C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、血管生成素、血管內(nèi)皮素(Endocans)、CD64、循環(huán)細(xì)胞游離DNA (cf-DNA)的靈敏度和特異度較差,區(qū)分膿毒癥與其他感染性疾病并不能取得滿意的效果[4]。序貫器官衰竭估計(jì)量表(SOFA)評分和急性生理與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分是評估膿毒癥嚴(yán)重程度的最常用方法,但評分系統(tǒng)易延誤患者治療,有必要尋找更簡便的血清指標(biāo)[5]。前期研究[6]發(fā)現(xiàn),蛋白組學(xué)技術(shù)對膿毒癥患者和健康對照人群的血清進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),人可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)、高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、基質(zhì)金屬蛋白酶-8 (MMP-8)在膿毒癥與健康人群中的表達(dá)水平有顯著差異。本研究評估 sTREM-1、NAGL、HMGB-1和MMP-8在膿毒癥診斷中的價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為單中心、前瞻性研究,選取2020年12月—2021年12月上海市第五人民醫(yī)院中心監(jiān)護(hù)室收治的60例膿毒癥(膿毒癥組)患者,同時(shí)選取60例同期住院的非膿毒癥感染患者為對照組。本研究已獲得上海市第五人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并且所有患者或家屬均簽署了知情同意書(編號2 020.08.10)。膿毒癥組患者納入標(biāo)準(zhǔn): 膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2016年2月第3次《膿毒癥和膿毒癥休克定義的國際共識診斷標(biāo)準(zhǔn)(Sepsis-3)》[7], 明確感染證據(jù)和入院后SOFA評分變化≥2分者; 年齡≥18歲,且病歷資料完整的患者。排除標(biāo)準(zhǔn): 年齡未滿18歲、存在自身免疫性疾病、粒細(xì)胞缺乏(粒細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.5×109/L)、持續(xù)腎替代治療、慢性髓系白血病、惡性腫瘤、ICU住院時(shí)間少于72 h、研究過程中死亡患者。

1.2 觀察指標(biāo)

患者入選后獲得家屬或本人知情同意后,收集患者性別、年齡、APACHEⅡ評分、SOFA評分、患者28 d病死率、機(jī)械通氣占比、ICU住院時(shí)間等?；颊呷虢M1 h內(nèi)抽血送至上海市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、白細(xì)胞介素-6、降鈣素原等感染指標(biāo)。同時(shí)收集外周靜脈血2 mL進(jìn)行抗凝處理,于-80 ℃下保存血清待測,采用上海溢川生物科技有限公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀(型號為ST-380)檢測sTREM-1、HMGB-1、NGAL、MMP-8的含量,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較各變量在診斷或預(yù)后上的差異,正態(tài)性方差齊性能滿足時(shí), 2個(gè)獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)。HMGB-1、NGAL、MMP-8、sTREM-1水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。對所有自變量進(jìn)行共線性分析,以消除方差膨脹系數(shù)(VIF)>10的變量。使用單因素Logistic分析和多因素Logistic回歸分析來確定影響因素。為了評估血漿各標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確度,采用受試者工作特征(ROC)曲線和Youden指數(shù)來計(jì)算cut off值、靈敏度和特異度。采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較

2組年齡、性別、伴隨疾病(高血壓病、糖尿病、腦血管后遺癥、慢性心臟病)、機(jī)械通氣比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。膿毒癥組腹腔感染患者占比高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。2組肺部感染和尿路感染患者比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。膿毒癥組SOFA評分、APACHEⅡ評分、CRP和PCT水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、ICU住院時(shí)間、多器官功能障礙和28 d病死率高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見表1。膿毒癥組患者血清中sTREM-1、NAGL、HMGB-1和MMP-8的表達(dá)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A: sTREM-1表達(dá)水平; B: NAGL表達(dá)水平; C: HMGB-1表達(dá)水平; D: MMP-8表達(dá)水平。?P<0.05。

表1 膿毒癥組和對照組表達(dá)差異

2.2 共線性分析

共線性分析表明, sTREM-1、NGAL、HMGB-1和MMP-8無共線性(方差膨脹因子, VIF<10), 而C反應(yīng)蛋白、PCT、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、APACHEⅡ評分和SOFA評分有共線性(方差膨脹因子, VIF>10), 見表2。

表2 共線性分析

2.3 單因素Logistic和多因素Logistic分析對膿毒癥危險(xiǎn)因素的分析

單因素Logistic回歸分析顯示, HMGB-1(OR=1.487, 95%CI: 1.224～1.807,P<0.01)、NGAL (OR=1.409, 95%CI: 1.179～1.684,P<0.01)、MMP-8(OR=1.074,95%CI: 1.039～1.111,P<0.01)、sTREM-1(OR=1.058, 95%CI: 1.029～1.088,P<0.01)為影響因素。將單因素分析中P<0.01的變量納入多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示, NGAL (OR=1.427, 95%CI: 0.951～2.141,P<0.05)和MMP-8 (OR=1.099, 95%CI: 0.979～1.234,P<0.05)是膿毒癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見表3。

表3 單因素Logistic回歸和多因素Logistic回歸分析

2.4 ROC曲線分析生物標(biāo)準(zhǔn)物在膿毒癥中的診斷價(jià)值

為了評估指標(biāo)在膿毒癥中的診斷價(jià)值,用ROC曲線分析評估了白細(xì)胞、PCT、NGAL和MMP-8作為預(yù)后生物標(biāo)記物的特異度和敏感度。NGAL臨界值為18.26 ng/mL, 敏感度為89.00%, 特異度為97.00%,AUC為0.95(95%CI: 0.91～0.99)。MMP-8的臨界值為33.41 ng/mL, 其敏感度和特異度分別為72.00%和76.00%,AUC為0.80(95%CI: 0.71～0.89)。白細(xì)胞臨界值為14.87 ng/mL, 其敏感度和特異度分別為81.00%和83.00%,AUC為0.89 (95%CI: 0.85～0.93)。PCT的臨界值為0.84 ng/mL, 其敏感度和特異度分別為81.00%和97.00%,AUC為0.96(95%CI: 0.92～0.99), 見表4、圖2。

圖2 ROC曲線分析生物標(biāo)準(zhǔn)物在膿毒癥中的診斷價(jià)值

表4 ROC曲線分析生物標(biāo)準(zhǔn)物在膿毒癥中的診斷價(jià)值

2.5 NAGL、HMGB-1、sTREM-1、MMP-8與SOFA評分、APACHEⅡ評分、PCT或CRP水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,膿毒癥患者sTREM-1、NAGL、HMGB-1、MMP-8水平均分別與SOFA評分、APACHE Ⅱ評分、PCT、CRP呈正相關(guān),見表5。

表5 HMGB-1、NGAL、MMP-8、sTREM-1與 APACHE-Ⅱ評分、SOFA評分、CRP和PCT的相關(guān)性分析

3 討 論

膿毒癥早期癥狀不明顯,病情進(jìn)展迅速,容易錯過最佳治療時(shí)間[8]。因此,需要快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)來指導(dǎo)臨床抗生素治療。前期蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者血清中的 HMGB-1、NGAL、MMP-8 和 sTREM-1表達(dá)水平高于對照組,應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,驗(yàn)證這些差異蛋白與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性及其在膿毒癥診斷中的價(jià)值。

研究[9]發(fā)現(xiàn), HMGB-1在人外周血單核細(xì)胞中能促進(jìn)TNF-α、IL-1β的釋放。釋放的促炎介質(zhì)又可使活化的單核巨噬細(xì)胞釋放 HMGB-1, 從而形成正反饋,維持并延長了膿毒癥病理過程。研究[10]發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者血液中 HMGB-1表達(dá)水平較非感染組升高,與本研究結(jié)果一致。NGAL是腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)的小分子蛋白,其水平可在腎損傷的2 h內(nèi)升高,是腎功能損傷早期的生物標(biāo)志物[11]。在膿毒癥小鼠模型中, NGAL的表達(dá)水平也明顯升高,進(jìn)一步研究[12]發(fā)現(xiàn), NGAL主要在肺和肝巨噬細(xì)胞以及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)。研究[13]發(fā)現(xiàn), NGAL在重癥患者中的表達(dá)水平高于非感染患者,與本研究結(jié)果一致。因此, NGAL可能是膿毒癥診斷的潛在候選標(biāo)志物。為了更好理解 NGAL 在膿毒癥中的意義,還需要更多的臨床研究。MMP-8是一組含有活性Zn2+的蛋白水解酶,參與了許多與自身穩(wěn)定相關(guān)的功能,例如組織修復(fù)、免疫及病理過程,包括腫瘤、纖維化和感染[14]。非感染情況下MMP-8含量極低,感染情況下其表達(dá)增加,且MMP-8可以反映膿毒癥嚴(yán)重程度,與本研究結(jié)果相似[15]。sTREM-1主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、CD14+單核/巨噬細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員,與膿毒癥密切相關(guān)。研究[16]發(fā)現(xiàn), sTREM-1在膿毒癥發(fā)病早期表達(dá)水平明顯升高, 3 d達(dá)高峰后逐漸降低; sTREM-1與APACHEⅡ評分呈正相關(guān),可作為評價(jià)膿毒癥患者預(yù)后的死亡危險(xiǎn)因素。

本研究發(fā)現(xiàn), HMGB-1、NGAL、MMP-8、sTREM-1在膿毒癥組中的表達(dá)水平高于對照組。共線診斷顯示, STREM-1、NGAL、HMGB-1和MMP8無共線性。單因素和多因素Logistic回歸分析顯示, NGAL和MMP-8是膿毒癥的獨(dú)立預(yù)測因素。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn), NGAL和MMP-8與PCT和白細(xì)胞一樣對膿毒癥血癥具有一定的診斷價(jià)值。MMP-8與膿毒癥嚴(yán)重程度有相關(guān)性,但無更多研究報(bào)道其在膿毒癥中的診斷價(jià)值。本研究為單中心研究,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心研究,充分論證HMGB-1、NGAL、MMP-8、sTREM-1與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性、在膿毒癥疾病發(fā)生中的作用機(jī)制和對膿毒癥的診斷價(jià)值。蛋白質(zhì)組學(xué)是目前尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)的有效方法之一,對癌癥、早老性癡呆等重大疾病的診斷和治療也具有潛在的前景[17]。因此,許多大型藥物公司正在投入大量資源進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究,但是目前蛋白組學(xué)在疾病診斷中的研究只處于基礎(chǔ)階段,尚未完全應(yīng)用于臨床,因?yàn)椴捎玫鞍捉M學(xué)技術(shù)尋找膿毒癥生物標(biāo)志物需要進(jìn)一步去驗(yàn)證和研究。

綜上所述,血清蛋白NAGL、sTREM-1、HMGB-1 和 MMP-8與膿毒癥嚴(yán)重程度有相關(guān)性,并初步驗(yàn)證NAGL和MMP-8在膿毒癥診斷中的作用,但是需要進(jìn)一步進(jìn)行多中心研究并擴(kuò)大樣本量,進(jìn)一步為膿毒癥的早期識別提供新的有效依據(jù)。