遼寧爪鯢(Onychodactylus zhaoermii)與吉林爪鯢(O.zhangyapingi)的遺傳多樣性

欒東岳，原 野，徐 昕，董丙君，楊寶田

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034；2.鞍山市野生動(dòng)植物保護(hù)管理工作站，遼寧鞍山114004)

[通訊作者]楊寶田(1963- )，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事野生動(dòng)物保護(hù)與利用、分子生態(tài)學(xué)研究。

遼寧爪鯢(Onychodactyluszhaoermii)和吉林爪鯢(O.zhangyapingi)隸屬于兩棲綱(Amphibia)有尾目(Caudata)小鯢科(Hynobiidae)爪鯢屬(Onychodactylus)[1]。此兩種爪鯢是Poyarkov et al.(2012)[2]在對(duì)東北亞分布的爪鯢物種形態(tài)和分子數(shù)據(jù)研究基礎(chǔ)上，從原屬于Onychodactylusfischeri[3]中分離出的新物種，目前已知分布在遼寧省(岫巖)和吉林省(渾江、臨江、集安、白河、延吉)的長(zhǎng)白山及其余脈[1]，本研究在遼寧遼陽(yáng)縣甜水滿族鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)有遼寧爪鯢分布。兩種爪鯢棲息地環(huán)境較為相似，均在山高林密，雜草叢生，常年流水的溪流中或其附近。爪鯢多以陸地棲息為主，晝伏夜出，黃昏和雨后活動(dòng)較為頻繁[1,4]，常見(jiàn)于土縫與溪中石縫間。以溪流內(nèi)的小蝦及小昆蟲為食[1,5]。

爪鯢以其指、趾末端具有黑色角質(zhì)爪而得名，與其他小鯢科動(dòng)物的明顯區(qū)別是其無(wú)肺[1]。遼寧爪鯢與吉林爪鯢的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異在于遼寧爪鯢的犁骨齒明顯彎曲，齒數(shù)在16～17個(gè)且沒(méi)有縫隙，而吉林爪鯢的犁骨齒較為平整，齒數(shù)在13～14個(gè)且沒(méi)有明顯縫隙[1-2]。近些年國(guó)內(nèi)有關(guān)爪鯢的研究多集中在形態(tài)與組織解剖學(xué)[6-9]、生理學(xué)[10-11]、保護(hù)生物學(xué)[5,12]和生態(tài)學(xué)[13]等方面。分子方面的相關(guān)文獻(xiàn)多來(lái)自國(guó)外學(xué)者或機(jī)構(gòu)的研究，Yoshikawa et al.(2008)[14]對(duì)爪鯢系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和譜系地理學(xué)進(jìn)行研究，利用線粒體Cytb基因序列對(duì)日本爪鯢種群系統(tǒng)關(guān)系和地理演化進(jìn)行了分析，認(rèn)為日本爪鯢存在4個(gè)支系，地質(zhì)事件(日本海的開(kāi)放)和氣候變化是日本爪鯢種群分化的主要影響因素。

生物多樣性的核心是遺傳多樣性，生物進(jìn)化潛力由種內(nèi)的變異程度決定，物種對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)能力的增強(qiáng)，是由于種內(nèi)的遺傳多樣性豐富度的上升。保護(hù)生物遺傳多樣性的本質(zhì)就是保護(hù)生物多樣性[15]。本研究采用Cytb基因序列分析方法對(duì)分布于我國(guó)的2種爪鯢進(jìn)行種群遺傳學(xué)研究。通過(guò)對(duì)其遺傳多樣性的分析，評(píng)估遺傳多態(tài)性的程度和分布，為爪鯢物種保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本

本研究野外采集樣本共計(jì)73個(gè)(表1)，其中吉林爪鯢43個(gè)，遼寧爪鯢30個(gè)。野外樣本分別來(lái)自吉林省集安市五女峰(8個(gè))、通化市石湖鎮(zhèn)(18個(gè))、通化市老嶺(17個(gè))，遼寧省岫巖縣三家子(26個(gè))、遼陽(yáng)縣大黑山(4個(gè))等5個(gè)地理種群。采集爪鯢樣本取后尾部末端組織或肢趾尖，放置于無(wú)水乙醇中固定帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-25℃冰箱中，樣本采集后爪鯢個(gè)體放生。此外，在GenBank下載線粒體Cytb基因序列15條，來(lái)自遼寧爪鯢8條，其中2條來(lái)自吉林通化老嶺；來(lái)自吉林爪鯢序列7條，其中4條來(lái)自吉林臨江(JLLJ)。用以分析的線粒體Cytb基因序列共計(jì)88條。

表1 采集的樣本信息

1.2 總DNA提取、Cytb基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取基因組DNA，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。提取的DNA存放在-20℃冰箱內(nèi)保存待用。線粒體Cytb基因DNA擴(kuò)增所用引物如表2，引物由北京華大基因有限公司合成。線粒體Cytb基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，10×Buffer 2.5μL；MgCl22.5μL；dNTP 2μL(10mmol/L)；引物 2μL(10pmol/μL)，上下游引物各1μL(10pmol/μL)；TaqDNA聚合酶1U，模版DNA 100ng/2μL；加雙蒸水至25μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性8min，之后94℃變性30sec，51～57℃退火30sec，72℃延伸45sec，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10min。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems Inc. 2720 PCR儀或Applied Biosystems Inc. 9902 PCR儀中進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后由北京華大基因有限公司測(cè)序。

表2 用于爪鯢線粒體Cytb基因擴(kuò)增的引物

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將所測(cè)得的Cytb基因片段首先進(jìn)行Blast搜索，驗(yàn)證其可靠性；然后用Lasergene v.7.0對(duì)DNA片段進(jìn)行拼接和手工編輯校正；再利用Clustal X[16]對(duì)拼接好的基因序列進(jìn)行比對(duì)；最后采用脊椎動(dòng)物線粒體遺傳密碼子進(jìn)行序列翻譯，以排除假基因的存在并證明其準(zhǔn)確性。用DAMBE[17]檢測(cè)Cytb基因序列的堿基替換模式，以檢驗(yàn)它們是否發(fā)生堿基替換飽和效應(yīng)。用DNAsp 5.10[18]軟件計(jì)算單倍型多態(tài)性和核苷酸多樣性等遺傳多樣性指數(shù)，同時(shí)進(jìn)行中性(Tajima’s Test; Fu and Li’s Tests)檢測(cè)和連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium)檢測(cè)。用MEGA 6.0[19]軟件分析不同樣本序列間的堿基組成和變異位點(diǎn)，并計(jì)算基于Kimura雙參數(shù)模型的遺傳距離、構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。利用Arlequin 3.5[20]軟件進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析和分子方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)。單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖用TCS 1.20[21]軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體Cytb基因序列特征

兩種爪鯢線粒體DNA Cytb基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的序列長(zhǎng)度有所不同，遼寧爪鯢Cytb基因長(zhǎng)度為1146bp，吉林爪鯢Cytb基因長(zhǎng)度為1149bp。相對(duì)于吉林爪鯢Cytb基因，遼寧爪鯢Cytb基因在1098-1100bp處存在“GTT”3個(gè)堿基的缺失。將所獲得的Ctyb基因序列通過(guò)進(jìn)行Blast同源性搜索以確定其可靠性。Cytb基因?yàn)榘被峋幋a基因，我們采用脊椎動(dòng)物線粒體遺傳密碼子進(jìn)行序列翻譯，以排除假基因的存在并證明其準(zhǔn)確性。在Cytb基因序列中，遼寧爪鯢樣本A+T含量為68.1%，吉林爪鯢樣本的A+T含量為67.7%，二者非常接近，都明顯高于G+C的含量，此數(shù)據(jù)符合脊椎動(dòng)物線粒體堿基組成的基本特征。

2.2 線粒體Cytb基因遺傳變異

結(jié)合GenBank下載數(shù)據(jù)，遼寧爪鯢共38條Cytb基因序列，存在16個(gè)變異位點(diǎn)，其中有8個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(k)分別為0.00265和3.3037(表3)。定義單倍型(h)9個(gè)(單倍型多樣度Hd=0.721)(表4)。

表3 兩種爪鯢Cytb基因遺傳多樣性參數(shù)

注:圓括號(hào)內(nèi)數(shù)字為標(biāo)準(zhǔn)誤差。

表4 遼寧爪鯢線粒體Cytb單倍型及變異位點(diǎn)分布

吉林爪鯢的50條Cytb基因序列存在21個(gè)變異位點(diǎn)，其中有19個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(k)分別為0.00480和4.2210(表3)。定義單倍型(h)7個(gè)(單倍型多樣度Hd=0.571)(表5)。

表5 吉林爪鯢線粒體Cytb單倍型及變異位點(diǎn)分布

采用Kimura-2計(jì)算的種群內(nèi)平均遺傳距離(表6中對(duì)角線數(shù)據(jù))表明種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳距離非常小，最大的為JLTH種群(0.0041)，最小的為JLLJ和JLLL兩個(gè)種群(0.0000)。遼寧爪鯢種群內(nèi)平均遺傳距離為0.00266±0.00254，吉林爪鯢為0.00486±0.00100。

單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)顯示單倍型間無(wú)對(duì)應(yīng)種群分支結(jié)構(gòu)，單倍型間接近，突變步數(shù)較少。

圖1 單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

注:每個(gè)橢圓形代表一個(gè)定義的單倍型，橢圓的大小表示該單倍型的頻率。“○”表示理論分析得出、但沒(méi)有實(shí)際觀測(cè)到的單倍型。單倍型間的每一連線代表一個(gè)突變步驟。

2.3 種群分歧與遺傳結(jié)構(gòu)分析

用MEGA軟件計(jì)算的線粒體Cytb基因序列種群內(nèi)和種群間的遺傳距離結(jié)果(表6)顯示，兩個(gè)爪鯢物種種群間的遺傳距離非常小，大多數(shù)種群間的遺傳距離都小于1%，只有吉林爪鯢的臨江種群與其他種群的遺傳距離大于1%(1.9%～2.1%)。

表6 種群內(nèi)和種群間Cytb基因序列遺傳距離分析

注:下三角為遺傳距離，上三角為標(biāo)準(zhǔn)誤，對(duì)角線為種群內(nèi)平均遺傳距離。

遺傳分化指數(shù)(FST)分析顯示(表7)，遼寧爪鯢種群間分化狀況不平衡，JLLL種群與LNXY種群和LNDHS種群分化明顯(p<0.05)，而LNXY種群與LNDHS種群則無(wú)明顯遺傳分化(p≥0.05)。對(duì)遼寧爪鯢種群間基因流(Nm=0.91,Nei 1982)分析可以看出種群間基因交流程度不高。

表7 遼寧爪鯢種群間FST

注:下三角為FST值；上三角為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)p值，*為p<0.05水平差異顯著。

對(duì)遼寧爪鯢進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，將遼寧的兩個(gè)種群劃為一組，吉林的遼寧爪鯢(JLLL)劃為另一組，分析結(jié)果顯示2個(gè)分組之間的變異在總變異中占到65.91%，而組內(nèi)種群間的變異占比非常小，只有0.56%(表8)。結(jié)合種群間FST分析(表7)可以看出，這種占比特征主要是JLLL種群與其他種群差異引起。

FST=0.66478(p<0.05)。

對(duì)吉林爪鯢的遺傳分化指數(shù)(FST)分析，吉林爪鯢除吉林臨江種群與其他種群存在較大分化外(p<0.05)，其余種群間均無(wú)明顯遺傳分化(p≥0.05)(表9)。吉林爪鯢種群間基因流Nm=0.18(Nei 1982)。

表9 吉林爪鯢種群間FST

注:下三角為FST值；上三角為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)p值，*為p<0.05水平差異顯著。

對(duì)吉林爪鯢進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，由于各樣本采集地相對(duì)比較集中，均屬于長(zhǎng)白山南部山地，因此沒(méi)有將其進(jìn)行分組設(shè)計(jì)，僅對(duì)種群與個(gè)體兩個(gè)階層進(jìn)行分析。結(jié)果顯示種群之間的變異在總變異中占到67.43%，而種群內(nèi)的變異占比相對(duì)較小(32.57%)(表10)。結(jié)合種群間FST分析(表9)可以看出，這種占比特征主要由JLLL種群與其他種群的差異引起。

表10 吉林爪鯢AMOVA分析

FST=0.67435(p<0.05)。

鑒于上述分析中分化程度較大的爪鯢種群來(lái)自Nikolay et al.(2012)[2]的DNA序列，即作為遼寧爪鯢JLLL種群和吉林爪鯢JLLJ種群的樣本，本研究去掉這部分樣本，用自測(cè)的DNA數(shù)據(jù)重新做了遺傳結(jié)構(gòu)分析。在所分析的2個(gè)遼寧爪鯢種群間(LNXY vs LNDHS)的分化指數(shù)(FST)為0.035，而吉林爪鯢的3個(gè)種群(JLSH、JLWNF和JLTH)之間的遺傳分化指數(shù)均為0.000。在沒(méi)有進(jìn)一步對(duì)種群分組的情況下(因采樣種群自然地理區(qū)系相同，地理距離很近)，遼寧爪鯢種群間遺傳變異只占總變異的3.000%，而吉林爪鯢種群間的遺傳變異占比為0.000%。

圖2 用自測(cè)DNA數(shù)據(jù)所做AMOVA分析圖

2.4 線粒體Cytb基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

在GenBank下載線粒體Cytb基因序列116條(Nikolay et al.,2012)[2]，包括O.fischeri、O.koreanus、O.cf.japonicus、O.sp.、O.nipponoborealis等5個(gè)爪鯢物種(或新種)。結(jié)合本研究中自測(cè)的73條序列，共計(jì)189個(gè)爪鯢Cytb基因序列，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出這些爪鯢物種(種群)可以分成3枝，O.cf.japonicus、O.nipponoborealis和O.zhangyapingi聚為一枝，O.koreanus、O.sp.和O.zhaoermii為一枝，O.fischeri單獨(dú)一枝。O.fischeri顯示為較原始類群(物種)，處于系統(tǒng)樹的根部。

注：節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為置信值，沒(méi)有標(biāo)示數(shù)值的節(jié)點(diǎn)置信值低于60。圖3 用7個(gè)爪鯢物種189條Cytb序列構(gòu)建的鄰接樹

3 討論

3.1 兩種爪鯢的遺傳多樣性比較

Cytb基因標(biāo)記結(jié)果顯示遼寧爪鯢和吉林爪鯢遺傳多樣性較低。從變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(k)和單倍型多樣度等多個(gè)遺傳多樣性參數(shù)上可以得出這一結(jié)果。就2個(gè)爪鯢物種進(jìn)行比較，吉林爪鯢在多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)上略高于遼寧爪鯢，但其單倍型數(shù)和單倍型多樣性低于遼寧爪鯢。在種群遺傳多樣性變化趨勢(shì)上，吉林爪鯢的遺傳多樣性高于遼寧爪鯢。在遺傳多樣性研究中分子標(biāo)記的選擇和應(yīng)用對(duì)結(jié)果有十分重要的影響。線粒體DNA分子標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)是不受環(huán)境和其他因素的影響而直接以DNA的形式出現(xiàn)，其具有母系遺傳、選擇中性、進(jìn)化速率快且穩(wěn)定等特點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，種群遺傳多樣性高低受種群自身特點(diǎn)的影響，但動(dòng)物種群線粒體DNA所反映的遺傳多樣性基本和種群大小無(wú)關(guān)。Frentiu et al.(2001)[22]在對(duì)澳洲肺魚的研究中發(fā)現(xiàn)從控制區(qū)至ATPase 8的線粒體DNA序列有很少的遺傳變異。

3.2 遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)

基于線粒體Cytb序列的遼寧爪鯢種群間遺傳變異分析，種群遺傳距離(表6)和遺傳分化指數(shù)(FST，表7)均顯示了一致的結(jié)果，即分布于吉林的JLLL種群與分布于遼寧的2個(gè)種群(LNDHS & LNXY)分化程度很大，而遼寧分布LNDHS種群與LNXY種群具有中等程度分歧。對(duì)吉林爪鯢種群分析，遺傳距離(表6)和FST(表9)顯示JLLJ種群與其他3個(gè)種群(JLSH & JLWNF & JLTH)存在很大遺傳分化，而JLSH、JLWNF和JLTH種群間無(wú)分化或僅有很小分化。在上述利用Cytb基因所做分析中，兩種爪鯢顯示較大分化的種群(遼寧爪鯢JLLL種群和吉林爪鯢JLLJ種群)數(shù)據(jù)出自Nikolay et al.(2012)，如果采用本研究自測(cè)的DNA數(shù)據(jù)重新分析，遼寧爪鯢LNXY種群與LNDHS種群的分化指數(shù)為0.035，而吉林爪鯢3個(gè)種群(JLSH & JLWNF & JLTH)之間的遺傳分化指數(shù)均為0.000，即遼寧爪鯢2個(gè)種群間存在較小遺傳分化(0 < FST< 0.05)，吉林爪鯢3個(gè)種群間均無(wú)遺傳分化(FST=0.000)。

本研究從遼寧爪鯢、吉林爪鯢和遼寧爪鯢+吉林爪鯢三個(gè)側(cè)面進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。將遼寧爪鯢LNXY種群和LNDHS種群劃為一組，JLLL種群為另一組的情況下，分子方差分析結(jié)果表明，組間的變異占65.91%，成為遺傳變異的主要來(lái)源。對(duì)吉林爪鯢4個(gè)種群的AMOVA分析，變異主要來(lái)自于種群間(67.43%)。用自測(cè)Cytb數(shù)據(jù)重新分析，將JLLL種群數(shù)據(jù)去掉，不進(jìn)行組別劃分，則遼寧爪鯢種群間遺傳變異占總變異的份額為3%，F(xiàn)ST=0.035；同樣，去掉JLLJ種群數(shù)據(jù)，吉林爪鯢的遺傳變異則全部來(lái)自于個(gè)體間(100%)，F(xiàn)ST=0.000，遼寧爪鯢和吉林爪鯢種群間的變異占比都非常小，遼寧爪鯢種群略大于吉林爪鯢。將遼寧爪鯢和吉林爪鯢合并AMOVA分析，則種間的變異占到98.82%，種群間和個(gè)體間的變異僅占1.18%。

交配系統(tǒng)和擴(kuò)散機(jī)制對(duì)動(dòng)物種群的遺傳分歧水平有顯著影響。爪鯢棲息于海拔500至1000米植被茂密的山區(qū)，水質(zhì)清涼、多碎石的溪流、水溝或泉眼附近是其常棲之地。由于爪鯢依賴水環(huán)境且對(duì)水質(zhì)條件要求苛刻，極大限制了爪鯢的遷徙擴(kuò)散能力，因而分布地域狹窄。爪鯢只能集中在所處棲息地繁衍，從而限制了基因交流，進(jìn)而導(dǎo)致了一定程度的遺傳分化。環(huán)境因子的差異所導(dǎo)致的選擇差異在爪鯢種群遺傳分化中起了重要作用。

3.3 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與地理演化

線粒體DNA是動(dòng)物親緣地理學(xué)最常用的遺傳標(biāo)記，盡管隨著新一代測(cè)序技術(shù)的普遍應(yīng)用而有所下降，但在已發(fā)表的有關(guān)譜系地理研究中仍占據(jù)較大份額。線粒體DNA具有高突變率、PCR擴(kuò)增對(duì)模板要求低、在動(dòng)物組織中拷貝數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)，特別是線粒體DNA在種內(nèi)多態(tài)性為中性，不受選擇影響，因而能更好反映種群經(jīng)歷的歷史事件。動(dòng)物線粒體DNA極少重組，每一個(gè)單倍型對(duì)應(yīng)一個(gè)前一世代祖先，所以很容易推斷單倍型間的遺傳關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)單倍型分布和相對(duì)頻率推斷種群歷史地理關(guān)系。本研究遼寧爪鯢單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系顯示出典型的星狀模式(圖1)，新單倍型(Hap_1-2, Hap_4-7)的形成發(fā)生在出現(xiàn)頻率最高的單倍型(Hap_3)，后續(xù)的核苷酸突變不可能發(fā)生在相同位點(diǎn)，因而這些稀少的新單倍型出現(xiàn)頻率和數(shù)目較低。盡管研究樣本采自分屬不同行政區(qū)域的兩個(gè)地點(diǎn)，但遼寧爪鯢地理分布的狹域性使其依然構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立分化中心。與遼寧爪鯢有所不同，吉林爪鯢顯示出相對(duì)復(fù)雜的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖1)，單倍型Hap_1占有主導(dǎo)地位，但Hap_3頻率出現(xiàn)次級(jí)峰。Hap_1與Hap_3間單倍型距離很近(僅一步突變)，可能是由于短暫的遺傳隔離因素形成，由二者衍生出來(lái)的稀少衛(wèi)星單倍型(Hap_2, Hap_4)很少。

地理隔離和擴(kuò)散能力是一個(gè)物種地理分布格局形成的決定因素，狹域分布的物種也很少有以單一的未分化的種群存在?；贑ytb基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系顯示(圖3)，遼寧爪鯢種群呈現(xiàn)多系譜系關(guān)系，亦即來(lái)自不同種群的一些樣本攜帶來(lái)自不同進(jìn)化枝的單倍型。這從另一個(gè)方面反映在遼寧爪鯢種群間很少地理隔離或無(wú)隔離因素存在，種群間基因交流頻繁。同樣，吉林爪鯢種群也表現(xiàn)為多系譜系關(guān)系，各種群沒(méi)有形成獨(dú)立進(jìn)化枝。但遼寧爪鯢與吉林爪鯢卻分屬2個(gè)不同的進(jìn)化枝，遼寧爪鯢與O.sp.和O.koreanus構(gòu)成一支，而吉林爪鯢與O.cf.japonicus和O.nipponoborealis構(gòu)成一支，O.fischeri位于樹的根部單獨(dú)一支。爪鯢屬在28.7MYA漸新世中期從其它小鯢中分離出來(lái)，分布于東北亞地區(qū)的山地森林中[14]。在第三紀(jì)中新世的早期，大概15.5 MYA，俄羅斯的O.fischeri和其他世系首先在爪鯢屬中分離出來(lái)。基于Yoshikawa et al.(2008)的分析，日本分布的爪鯢最早于8.1 MYA與東北亞大陸分布的爪鯢分離[14]，而中國(guó)東北與朝鮮半島分布的爪鯢則在5.5 MYA分離，而在本研究中中國(guó)東北的2種爪鯢分屬日本和朝鮮半島2個(gè)不同的進(jìn)化枝，這其中的矛盾和東北亞地區(qū)爪鯢物種系統(tǒng)發(fā)育和地理演化關(guān)系有待于進(jìn)一步深入研究。

兩棲類動(dòng)物種群的普遍衰退是當(dāng)今普遍現(xiàn)象，兩棲動(dòng)物遷移能力低，當(dāng)種群變得小而隔離時(shí)，在遺傳問(wèn)題方面變得特別脆弱。鑒于遼寧爪鯢和吉林爪鯢種群呈現(xiàn)多系的譜系結(jié)構(gòu)，因而建議將2個(gè)物種分別作為一個(gè)管理單元加以保護(hù)。兩種爪鯢(特別是遼寧爪鯢)已知分布區(qū)域極其狹窄，棲息地多為山地，景色宜人，夏季涼爽，有部分爪鯢分布區(qū)為開(kāi)發(fā)旅游資源而建立風(fēng)景區(qū)，這在很大程度上對(duì)爪鯢生境造成了干擾和破壞。建議加強(qiáng)爪鯢物種監(jiān)測(cè)和棲息地保護(hù)力度，對(duì)爪鯢分布區(qū)實(shí)施封閉管理，目前，遼寧鞍山市野生動(dòng)植物保護(hù)站建立了爪鯢自然保護(hù)小區(qū)[23]。同時(shí)，需進(jìn)一步加強(qiáng)爪鯢生物學(xué)、種群遺傳學(xué)以及保護(hù)生物學(xué)研究，為爪鯢保護(hù)提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

Cytb分析兩種爪鯢種群遺傳變異水平很低，但吉林爪鯢的遺傳多樣性高于遼寧爪鯢。遼寧爪鯢種群間存在較小遺傳分化，而吉林爪鯢種群間均無(wú)遺傳分化。遼寧爪鯢和吉林爪鯢種群均呈現(xiàn)多系的譜系結(jié)構(gòu)，建議將兩個(gè)物種分別作為一個(gè)管理單元加以保護(hù)。

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