篩選血清HBV-DNA陰性且HBsAg與HBsAb陽(yáng)性CHB患者的血清危險(xiǎn)因素及評(píng)分與預(yù)后的相關(guān)性研究

楊 陽(yáng)，張歡妍，呂 幸，彭俊華（1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院金壇臨床學(xué)院，江蘇常州 1300；.江蘇大學(xué)附屬金壇第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 1300）

當(dāng)人體被乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，針對(duì)乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）產(chǎn)生具有保護(hù)性的乙肝表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb），HBsAb中和HBsAg，進(jìn)而協(xié)助機(jī)體清除HBV。因此，理論上HBsAg和HBsAb在人體內(nèi)是先后出現(xiàn)的，但在實(shí)際的臨床工作中確實(shí)存在兩者同時(shí)陽(yáng)性的情況，回顧性研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，HBsAg與HBsAb陽(yáng)性在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者中的發(fā)生率為2.43%～8.9%。既往的研究[2-5]主要集中在HBV-DNA陽(yáng)性的CHB患者中，高HBV-DNA載量的HBsAg與HBsAb陽(yáng)性患者預(yù)后相對(duì)更差，伴隨著更嚴(yán)重的肝纖維化和肝硬化，患肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的風(fēng)險(xiǎn)更高。研究發(fā)現(xiàn)[4]，HBV-DNA陰性且HBsAg和 HBsAb陽(yáng)性患者的預(yù)后與HCC的發(fā)生率無(wú)關(guān)，針對(duì)此類(lèi)患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的研究甚少，探討此類(lèi)患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素對(duì)患者的治愈有著重要的意義。本研究從常見(jiàn)的血清學(xué)指標(biāo)中篩選HBV-DNA陰性且HBsAg和 HBsAb陽(yáng)性患者的危險(xiǎn)因素，探討危險(xiǎn)因素評(píng)分與預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)而指導(dǎo)臨床針對(duì)性地治療。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年1月～2022年6月在常州市金壇第一人民醫(yī)院就診且HBV-DNA陰性CHB患者193例。其中，HBsAg和 HBsAb陽(yáng)性的患者119例作為觀察組，其中男性70例，女性49例，年齡65.0（54.0，73.0）歲；HBsAg陽(yáng)性且HBsAb陰性的患者74例為對(duì)照組，其中男性47例，女性27例，平均年齡61.0(43.5，72.0)歲。兩組間性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.42，U=3 842.00，均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2020年慢性乙型肝炎基層診療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②HBsAg持續(xù)陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月；③未接受抗病毒治療；④HBsAg和HBsAb共同陽(yáng)性患者經(jīng)一個(gè)月以后的復(fù)查仍然為共存狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎；②酒精性肝病和非酒精性脂肪肝等原因造成的肝臟損害；③既往或正在接受抗病毒治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑盒（蘇州長(zhǎng)光華醫(yī)AE240）；熒光定量PCR分析儀（美國(guó)生物系統(tǒng)公司ABI7500）及生物試劑盒（深圳市愛(ài)康生物科技股份有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑（貝克曼Au5800）；血液分析儀及其配套試劑（Sysmex XN2000）。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集：收集所有患者的性別、年齡、肝功能血清學(xué)指標(biāo)（ALT，AST，TP，ALB，TBIL）、乙肝血清學(xué)指標(biāo)（HBsAg，HBsAb，HBVDNA）、血細(xì)胞檢測(cè)參數(shù)（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)）。

1.3.2 分組標(biāo)準(zhǔn)：觀察組：HBV-DNA陰性且HBsAg和HBsAb陽(yáng)性；對(duì)照組：HBV-DNA陰性且只有HBsAg陽(yáng)性。

1.3.3 血清無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)計(jì)算公式：外周血炎性指標(biāo)：中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率（neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR）=中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；血小板/淋巴細(xì)胞比率(platelet-to-lymphocyte ratio,PLR)=血小板計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；系統(tǒng)炎癥指數(shù)(systemic immune-inflammation index，SII)=血小板計(jì)數(shù)×中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。無(wú)創(chuàng)肝纖維化指標(biāo): 谷氨?；D(zhuǎn)移酶/血小板計(jì)數(shù)的比值(gamma-glutamyl-transpeptidase to platelet ratio，GPR)= GGT(U/L)×100/[PLT(×109/L)×GGT的正常上限（U/L）]；天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與血小板比值指數(shù)(aspartate aminotransferase to platelet ratio，APRI)= AST（U/L）×100/[PLT（×109/L）×AST的正常上限（U/L）]；基于4因子的纖維化指數(shù)(fibrosis index based on the four factors，F(xiàn)IB-4)=[年齡（歲）×AST（U/L）]/[[PLT（×109/L）×[ALT（U/L）]1/2]。

1.3.4 跟蹤隨訪：根據(jù)觀察組隨訪二年內(nèi)HBsAg和HBsAb水平變化分亞組。將HBsAg水平明顯降低（減少一半以上）的患者歸為預(yù)后良好組，低于檢測(cè)下限0.1 IU/ml定義為HBsAg清除；HBsAg水平?jīng)]有明顯降低或HBsAb水平低于10 mIU/ml的患者歸為預(yù)后不良組。追蹤的方式主要是門(mén)診隨訪。119例觀察組中44例患者追蹤到HBsAg和HBsAb的復(fù)檢記錄，53例患者沒(méi)有復(fù)檢記錄，22例患者追蹤時(shí)間未滿(mǎn)2年。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù) ( 四分位數(shù) ) [M(P25，P75)]表示，采用Mann-WhitneU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（百分率）[n（%）]表示，采用卡方檢驗(yàn)。采用 Logistic 單因素回歸分析HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式的相關(guān)因素，多因素Logistic分析其發(fā)生獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；運(yùn)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線明確HBsAg，TP，PLT和APRI等指標(biāo)的截?cái)嘀狄约霸u(píng)價(jià)危險(xiǎn)因素評(píng)分預(yù)測(cè)模型的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組臨床資料和血清無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)的比較 見(jiàn)表1。觀察組的HBsAb，PLT和TP水平高于對(duì)照組，而觀察組的HBsAg水平和APRI比值低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組的性別、年齡以及ALT，AST，ALB，TBIL，NLR，PLR，SII，GPR和FIB-4指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 觀察組和對(duì)照組臨床資料和血清無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)的比較[n(%),±s,M(P25,P75)]

表1 觀察組和對(duì)照組臨床資料和血清無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)的比較[n(%),±s,M(P25,P75)]

項(xiàng)目觀察組(n=119)對(duì)照組(n=74)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量P值年齡(歲)65.00（54.00，73.00）61.00(43.50，72.00)3 842.000.137男（%）70（59.32）47（649.38）0.420.517 HBsAg（IU/ml）1.60（0.37，13.15）138.78（8.66，161.94）1 685.50＜0.001 HBsAb（mIU/ml）29.70（15.80，47.50）0.66(0.37，1.85)0.01＜0.001 ALT（U/L）21.50(14.75，35.50)21.00(14.50，40.00)4 191.500.684 AST（U/L）23.50(19.75，34.25)22.00(18.00，29.50)3 972.000.253 TP（g/L）70.20（65.73，74.90）67.00（64.45，71.25）3 254.000.004 ALB（g/L）42.40（39.60，44.50）41.40（38.60，44.05）3 839.500.178 TBIL（μmol/L）14.65(10.65，17.65)12.40(9.40，16.80)3 689.500.080 PLT（×109/L）181.07±63.31158.27±61.552.460.015 NLR2.33(1.62，4.36)2.89(2.04，3.89)3 946.500.226 PLR121.57(87.44，159.00)130.67(91.13，160.95)4 187.000.567 SII429.27(270.62，714.03)408.50(270.50，747.84)4 279.500.743 GPR0.28(0.18，0.48)0.30(0.17，0.58)4 124.500.558 APRI0.31(0.22，0.47)0.46(0.32，0.71)2 972.00＜0.001 FIB-41.97(1.12，2.83)2.04(1.21，3.25)4 188.500.678

2.2 觀察組和對(duì)照組差異指標(biāo)的ROC分析 通過(guò)ROC分析來(lái)評(píng)價(jià)差異指標(biāo)的預(yù)測(cè)價(jià)值。HBsAg，TP，PLT，APRI曲線下面積（AUC）分別為0.194（95%CI: 0.126～0.262）,0.625（95%CI: 0.547～0.704）,0.599（95%CI: 0.515～0.684）和0.340（95%CI: 0.262～0.418），敏感度分別為16.8%，52.9%，63.0%和52.1%，特異度分別為31.5%，68.5%，57.5%和19.2%，截?cái)嘀捣謩e為22.56 IU/ml，69.45 g/L，157.5×109/L和0.29。

2.3 觀察組發(fā)生預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析 見(jiàn)表2。HBsAg≤22.56 IU/ml，TP≥69.45 g/L，PLT≥157.50×109/L，APRI≤0.29與觀察組發(fā)生預(yù)后不良有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。將以上因素納入多因素logistics回歸分析，結(jié)果顯示HBsAg≤22.56 IU/ml [OR(95%CI):9.853(4.722～20.560)] 和TP≥69.45 g/L[OR(95%CI):2.358(1.132～4.912)]是觀察組發(fā)生預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SII因P＞0.05，故以中位數(shù)413.35為臨界值，年齡根據(jù)既往文獻(xiàn)[7]確定臨界值。

表2 觀察組發(fā)生預(yù)后不良的單因素分析[n(%)]

2.4 建立危險(xiǎn)因素評(píng)分模型 見(jiàn)圖1?；贖BsAg≤22.559 IU/ml和TP≥69.45 g/L這兩個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行評(píng)分。每一個(gè)危險(xiǎn)因素賦予1分，得到如下三組：0分組（無(wú)危險(xiǎn)因素），1分組（1個(gè)危險(xiǎn)因素），2分組（2個(gè)危險(xiǎn)因素）。統(tǒng)計(jì)得到：0分組、1分組和2分組在觀察組中分別有11例、54例和54例，在對(duì)照組中分別有34例、34例和6例，該危險(xiǎn)因素建立的評(píng)分模型預(yù)測(cè)HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式的AUC為0.703，靈敏度為66.7%，特異度為73.9%。

圖1 危險(xiǎn)因素評(píng)分模型預(yù)測(cè)HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式的ROC曲線

2.5 危險(xiǎn)因素評(píng)分模型與觀察組預(yù)后情況分析 根據(jù)HBsAg，HBsAb水平變化對(duì)44例觀察組患者二年內(nèi)預(yù)后情況進(jìn)行分析。在評(píng)分模型的0分組、1分組和2分組出現(xiàn)良好預(yù)后分別有1例、7例和12例，出現(xiàn)不良預(yù)后分別有6例、16例和2例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.838，P=0.001）。其中，發(fā)生HBsAg清除有9例（2.0%，9/44），發(fā)生在1分組和2分組分別有2例和7例；發(fā)生 HBsAb消失也有9例（2.0%，9/44），發(fā)生在0分、1分組和2分組分別是2例、6例和2例。結(jié)果表明評(píng)分高的HBsAg和HBsAb陽(yáng)性患者趨向于HBsAg降低甚至血清學(xué)清除的良好預(yù)后；評(píng)分低的HBsAg和HBsAb陽(yáng)性患者趨向于HBsAg升高甚至HBsAb消失的不良預(yù)后。

3 討論

免疫球蛋白在慢性乙肝、代償期肝硬化和失代償期肝硬化人群中逐漸增高,表明HBV引起的免疫應(yīng)答是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及炎癥壞死的主要原因，而炎癥壞死持續(xù)存在或反復(fù)出現(xiàn)可導(dǎo)致肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（HCC）[8-9]。臨床上對(duì)乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物（HBsAg，HBsAb，HBV-DNA等）結(jié)合生化檢測(cè)指標(biāo)（ALT，AST，TBIL等）、血細(xì)胞檢測(cè)和肝纖維化指標(biāo)（GPR，APRI，F(xiàn)IB-4評(píng)分等）來(lái)確定慢性乙型肝炎（CHB）患者的進(jìn)展階段和嚴(yán)重程度，從而采取相應(yīng)的治療方案[8]。HBV-DNA陰性且HBsAg和HBsAb陽(yáng)性患者作為臨床的少見(jiàn)病例，其臨床預(yù)后報(bào)道較少，在管理上與HBsAg陽(yáng)性且HBsAb陰性患者沒(méi)有區(qū)分，治療上缺乏針對(duì)性。因此有必要篩選出HBV-DNA陰性的HBsAg和HBsAb陽(yáng)性患者不同預(yù)后的危險(xiǎn)因素，指導(dǎo)臨床進(jìn)行針對(duì)性診療。

CHB是慢性炎癥、免疫系統(tǒng)失衡的全身性疾病，肝功能血清學(xué)指標(biāo)可反映肝炎的進(jìn)展和肝細(xì)胞的壞死程度；基于血細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的NLR，PLR，SII等相關(guān)炎癥指標(biāo),可用于預(yù)測(cè)重度肝纖維化和肝硬化[10]，也可用于預(yù)測(cè)慢加急肝功能衰竭[11]、病毒性肝炎[12]和HCC的預(yù)后和進(jìn)展[13]；基于血清指標(biāo)的無(wú)創(chuàng)診斷模型GPR，APRI，F(xiàn)IB-4與肝臟纖維化分期相關(guān)，為臨床使用非侵入式方法診斷肝臟炎癥和纖維化提供依據(jù)[14]，甚至作為肝活檢的替代方法[6]。本研究中，觀察組和對(duì)照組肝功能血清學(xué)指標(biāo)（ALT，AST，ALB，TBIL）集中在正常范圍之內(nèi)，相關(guān)炎癥指標(biāo)（NLR，PLR，SII）接近無(wú)纖維化的CHB患者[10]，肝纖維化血清診斷模型（GPR，APRI，F(xiàn)IB-4）的結(jié)果低于肝纖維化的初級(jí)階段[15-16]，表明了本研究選取的研究對(duì)象多為非活動(dòng)性HBV攜帶者，其肝臟的炎癥損害和纖維化程度較低。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，APRI在無(wú)纖維化的F0階段和輕度纖維化的F1階段分別是0.32和0.48，推測(cè)本研究選取的觀察組和對(duì)照組分別處于肝纖維化的F0階段和F1階段，并且本研究中觀察組的PLT水平高于對(duì)照組，PLT的數(shù)量與肝纖維化相關(guān)[17-18]，表明觀察組肝纖維化程度低于對(duì)照組。其原因可能是HBV-DNA陰性的HBsAg和HBsAb陽(yáng)性患者排除了免疫逃逸突變體導(dǎo)致的檢測(cè)失敗和新的HBV菌株的重復(fù)感染，處于HBsAg清除到HBsAb產(chǎn)生的過(guò)渡階段，機(jī)體的免疫系統(tǒng)壓制病毒的復(fù)制，患者肝內(nèi)無(wú)炎癥活動(dòng)或僅有輕微炎癥[4,8]。肝損害和肝纖維化是影響CHB患者預(yù)后和治療的重要因素，低水平的肝損害和纖維化程度也是觀察組患者趨向于良好預(yù)后的重要因素。

HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式的最終血清學(xué)轉(zhuǎn)變結(jié)果是HBsAg血清學(xué)清除和HBsAb血清學(xué)消失[4]，前者達(dá)到了臨床治愈的目標(biāo)，后者可發(fā)展為CHB的嚴(yán)重階段，兩者預(yù)后的管理完全不同。本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg水平低于22.56 IU/ml和TP水平高于69.45 g/L是影響HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，低水平的HBsAg預(yù)示著HBV清除，高水平的TP提示更好的肝臟合成能力，結(jié)合肝功能的化學(xué)指標(biāo)正常和肝臟組織無(wú)明顯炎癥或纖維化改變?yōu)榱己玫念A(yù)后提供基礎(chǔ)[8]?；谝陨蟽蓚€(gè)危險(xiǎn)因素建立的評(píng)分模型預(yù)測(cè)HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式發(fā)生情況的ROC曲線下面積是0.703，具有一定的診斷價(jià)值，高評(píng)分提示該模式的高發(fā)生率。值得一提的是，該評(píng)分模型的2分組出現(xiàn)了較多HBsAg降低甚至血清學(xué)清除現(xiàn)象，提示該評(píng)分模型可用于篩選良好預(yù)后人群，這與既往的研究結(jié)果相似[19]。出現(xiàn)良好預(yù)后的HBsAg和HBsAb陽(yáng)性乙肝患者可能處于疾病恢復(fù)的短暫過(guò)渡階段，屬于臨床治愈的優(yōu)勢(shì)人群，積極的配合治療，能夠提高HBsAg的清除率[20-21]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組兩年內(nèi)HBsAg清除率為2.0%，低于既往研究年清除率4.92%[20]，可能原因是研究人群特征的差異以及隨訪的時(shí)間較短。然而，該評(píng)分模型的0分組和1分組出現(xiàn)了較多的HBsAg升高甚至HBsAb血清學(xué)消失的不良預(yù)后，提示該評(píng)分模型可用于篩選不良預(yù)后人群。出現(xiàn)不良預(yù)后的原因可能是HBV重新激活的信號(hào)，主要發(fā)生在無(wú)抗病毒預(yù)防情況下接受免疫抑制治療的HBV感染者，可能導(dǎo)致爆發(fā)性肝炎、肝衰竭等致命的后果[4]；另一個(gè)原因是人類(lèi)基因寡聚腺苷酸合成酶3（OAS3）突變導(dǎo)致HBV的復(fù)制不受限制，從而使HBsAg清除失敗[22],這兩種情況都需要積極的干預(yù)?？梢?jiàn)，HBV-DNA陰性的HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式并不只是恢復(fù)的指標(biāo)，不良臨床結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)仍然存在，有必要篩選出不同臨床預(yù)后人群加以針對(duì)性的治療管理。

綜上所述，HBV-DNA陰性且HBsAg和HBsAb陽(yáng)性患者比HBsAg陽(yáng)性且HBsAb陰性患者存在更低的HBsAg和纖維化水平，更高的TP和PLT含量。HBsAg≤22.56 IU/ml和TP≥69.45 g/L是HBsAg和HBsAb陽(yáng)性模式發(fā)生不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，基于這兩個(gè)因素建立評(píng)分模型可用于預(yù)測(cè)其發(fā)生和篩選不同預(yù)后人群。本研究建立的模型指標(biāo)簡(jiǎn)單易行，適合基層醫(yī)院CHB患者的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。但本研究的局限之處在于標(biāo)本量較少導(dǎo)致建模數(shù)據(jù)有限，隨訪時(shí)間短無(wú)法長(zhǎng)期觀察到患者長(zhǎng)期的血清學(xué)變化，后期將擴(kuò)大標(biāo)本量，長(zhǎng)期隨訪進(jìn)一步深入研究，為臨床診療提供更有利的證據(jù)。