三種方法提取毛霉菌核酸效能的比較實(shí)驗(yàn)研究

潘永圣，蒲 丹，汪佳婕，趙云平，徐宏忍，白敏鳳，許小靚，尹利民

（昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650011）

毛霉菌是臨床上常見侵襲性真菌疾?。咕。┑牟≡祟愔饕ㄟ^吸入真菌孢子囊、攝入被污染的食物或皮膚創(chuàng)傷而獲得感染[1]。實(shí)體器官或造血干細(xì)胞移植患者、血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者、未被控制的糖尿病和/或伴有酮癥酸中毒患者等免疫功能低下患者毛霉菌感染的發(fā)生率較高[2]。毛霉菌可侵入宿主血管，導(dǎo)致血栓形成和組織壞死，但其感染后無特異性癥狀、臨床表征和影像學(xué)表現(xiàn)不明顯，進(jìn)展迅速，具有較高的發(fā)病率和病死率[3]。因此，在該菌感染早期就能快速準(zhǔn)確診斷和治療將有助于降低患者病死率。雖然目前毛霉菌確診主要依賴于組織病理學(xué)和真菌培養(yǎng)，但其周期長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、敏感性低等因素，無法滿足對(duì)其快速準(zhǔn)確鑒定的要求[4]。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)憑靈敏度高、特異度強(qiáng)及操作簡(jiǎn)便迅速等優(yōu)點(diǎn)在真菌鑒定、分型和耐藥性分析中發(fā)揮著越來越重要的作用。PCR技術(shù)可以早期檢測(cè)培養(yǎng)物、組織、血液和尿液等不同樣本類型中的毛霉菌[5-7]。提取核酸模板是PCR檢測(cè)的關(guān)鍵步驟之一，而核酸模板質(zhì)量是決定PCR法檢測(cè)結(jié)果靈敏度和可信度的關(guān)鍵因素，因此獲得高質(zhì)量的核酸模板對(duì)于開展PCR檢測(cè)工作十分重要[8]?；仡櫧鼛啄暄芯堪l(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)關(guān)于毛霉菌PCR檢測(cè)技術(shù)和核酸模板提取方法研究的相關(guān)報(bào)道不多，因此本研究探索改良?jí)A裂解法、一步法及磁珠法提取毛霉菌核酸效能的差異，以及探索一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的毛霉菌核酸提取方法，為臨床應(yīng)用PCR技術(shù)快速高效檢測(cè)毛霉菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選用米黑根毛霉（Rhizomucormiehei，R.miehei）、傘枝犁頭霉（Lichtheimiacorymbifera，L.corymbifera）和卷枝毛霉（Mucorcircinelloides，M.circinelloides）3株毛霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為研究對(duì)象，以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。本研究已通過昆明市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑 主要儀器設(shè)備：全自動(dòng)核酸提取儀（GeneRotex 96，西安天隆科技有限公司），核酸濃度測(cè)定儀（Qbit4，賽默飛世爾科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（SLAN-96P，上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。主要試劑：一步法檢測(cè)試劑（Lysis buffer for microorganism to direct PCR 9164，Takara Bio公司）；磁珠法檢測(cè)試劑（西安天隆科技有限公司）；馬鈴薯葡萄糖水、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和瓊脂（昆明鼎國(guó)生物科技有限公司）；氫氧化鈉（NaOH）、Tris-HCl[生工生物工程（上海）股份有限公司]；2×PCR預(yù)混液[SGExcel GoldStar TaqMan Master，包含GoldStar Taq DNA Polymerase，PCR Buffer，dNTPs和Mg2+。生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 毛霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)和菌液制備：將R.miehei和L.corymbifera菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）上培養(yǎng)48h（其中R.miehei置于45℃下培養(yǎng)，L.corymbifera置于25℃下培養(yǎng)），將M.circinelloides菌種接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）上25℃培養(yǎng)48h。分別挑取上述培養(yǎng)的菌落，加入已稱重的含3ml滅菌等滲氯化鈉溶液試管中，再次稱重調(diào)整使每管含毛霉菌150mg，振蕩混勻后均勻分為15管（每種毛霉菌每種提取方法各5管），每管含毛霉菌約10mg，13 000r/min離心5min棄上清液，備用。

1.3.2 改良?jí)A裂解法[9]：向上述備用菌中加入80μl的0.5mol/L NaOH，渦旋振蕩混勻1min，加入160μl 0.1 mol/L Tris-HCl中和，再次渦旋振蕩混勻1min，4℃13 000r/min離心5min，取上清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 一步法：在上述備用菌中加入50μl樣本釋放劑，渦旋振蕩混勻1min，85℃熱變性20min，4℃13 000r/min離心5min，取上清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 磁珠法：于上述備用菌中加入180μl溶菌酶溶液和20μl蛋白酶K溶液，渦旋振蕩混勻后50℃加熱30min，再加入200μl菌體消化液，渦旋振蕩混勻，將上述液體加入到試劑盒中，上機(jī)提取，40min 后獲得核酸提取物。

1.3.5 毛霉菌菌株核酸濃度測(cè)定：用Qbit4核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定上述不同提取方法提取核酸的濃度，具體操作嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.3.6 引物和探針合成：根據(jù)MILLON等[7]報(bào)道合成R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides擴(kuò)增引物和探針：RM-F：5’-CACCGCCCGTCGCTAC-3’，RM-R：5’-GTAGTTTGCCATAGTTCGGCTA-3’和RM-P：5’-TTGAATGGCTATAGTGAGCATATGGG AGGCT-3’；LC-F：5’-CACCGCCCGTCGCTAC-3’，LC-R：5’-GCAAAGCGTTCCGAAGGACA-3’和LC-P：5’-ATGGCACGAGCAAGCATTAGGGACG-3’；MC-F：5’-CACCGCCCGTCGCTAC-3’，MC-R：5’-CCTAGTTTGCCATAGTTCTCAGCAG-3’和MC-P：5’-CCGATTGAATGGTTATAGTGAGCA TATGGGATC-3’。R.miehei探針的5’端以HEX報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端以BHQ1淬滅基團(tuán)標(biāo)記；L.corymbifera探針的5’端以ROX報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端以BHQ1淬滅基團(tuán)標(biāo)記；M.circinelloides探針的5’端以CY5報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端以BHQ1淬滅基團(tuán)標(biāo)記。以上引物和探針委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)：在PCR管中依次加入25μl 2×PCR預(yù)混液，各引物和探針1μl（終濃度為0.2μmol/L），核酸模板5μl，以RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至50μl。PCR反應(yīng)條件：95℃10min，循環(huán)1次，95℃變性15s，60℃退火/延伸60s，循環(huán)40次。熒光信號(hào)收集設(shè)在60℃。Ct值＜38且曲線呈S型判斷為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布的采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種提取方法所得核酸濃度和優(yōu)缺點(diǎn)比較 見表1。改良?jí)A裂解法、一步法及磁珠法均能提取出R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides三株毛霉菌核酸，各種方法提取毛霉菌核酸濃度由高到低分別為：一步法＞改良?jí)A裂解法＞磁珠法（P＜0.05），一步法和改良?jí)A裂解法兩種直接裂解法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.876，15.884，17.213，均P＜0.05）。改良?jí)A裂解法提取毛霉菌核酸所需時(shí)間最短，一步法次之，磁珠法最長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 574.074，P＜0.001）。各種方法提取毛霉菌核酸的耗費(fèi)成本和設(shè)備依賴度由高至低依次為：磁珠法＞一步法＞改良?jí)A裂解法。

表1 三種提取方法提取3株毛霉菌核酸結(jié)果比較（±s，n =5）

類 別改良?jí)A裂解法一步法磁珠法FP耗費(fèi)時(shí)間（min）10.00±1.5025.00±1.5075.00±1.502 574.074＜0.001 DNA提取濃度（ng/μl）R.miehei0.58±0.061.20±0.280.25±0.0938.803＜0.001 L.corymbifera5.92±0.298.17±0.130.76±0.022 160.759＜0.001 M.circinelloides1.18±0.165.82±0.580.65±0.10325.175＜0.001

2.2 三種提取方法提取毛霉菌核酸產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表2。三種方法提取毛霉菌核酸產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后均能擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)R.miehei菌株樣本，改良?jí)A裂解法和磁珠法提取的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.114，P=0.298），一步法提取的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值小于另外2種方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.852，5.277，均P＜0.05）。對(duì)L.corymbifera菌株樣本，改良?jí)A裂解法提取的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值小于一步法，相差5.00±0.125，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=40.031，P＜0.001），磁珠法提取的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值小于另外2種方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.953，60.265，均P＜0.05）。對(duì)M.circinelloides菌株樣本，改良?jí)A裂解法提取的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值大于另外2種方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.372，4.106，均P＜0.05），一步法和磁珠法提取的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.866，P=0.099）。

表2 3 種提取方法提取毛霉菌核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法Ct值比較（±s，n =5）

表2 3 種提取方法提取毛霉菌核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法Ct值比較（±s，n =5）

標(biāo)準(zhǔn)菌株改良?jí)A裂解法一步法磁珠法FP R.miehei18.72±0.1817.42±0.4618.97±0.4622.375＜0.001 L.corymbifera16.23±0.1321.23±0.2514.53±0.042 298.548＜0.001 M.circinelloides16.77±0.2815.38±0.8816.13±0.208.152＜0.006

3 討論

毛霉菌是繼曲霉之后在免疫功能低下的患者如血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者、造血干細(xì)胞移植和實(shí)體器官移植患者中常見的絲狀真菌病原體。目前臨床上確診毛霉菌主要通過分離培養(yǎng)和表型鑒定，但該種方法耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作人員專業(yè)要求高，結(jié)果判斷主觀性較強(qiáng)，不能滿足臨床上對(duì)其快速準(zhǔn)確診斷的要求。PCR檢測(cè)方法可以早期檢測(cè)培養(yǎng)物、組織、血液和尿液等不同樣本類型中的毛霉菌，被認(rèn)為是一種無創(chuàng)的方法[10]。而核酸提取是PCR檢測(cè)過程中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，提取核酸的質(zhì)量和效率直接影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性，若提取的核酸純度和濃度較低，可能導(dǎo)致PCR檢測(cè)出假陰性結(jié)果。毛霉菌與其他真菌相似，具有厚重的細(xì)胞壁，其核酸提取較細(xì)菌和人體組織細(xì)胞DNA的提取難度大。目前常用于真菌核酸提取的方法有SDS裂解法、CTAB法、反復(fù)凍融裂解法等，但都存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、提取核酸效率低等缺點(diǎn)[8,9]。為此，本研究采用改良?jí)A裂解法、一步法及磁珠法對(duì)不同屬的毛霉菌（R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides）分別提取核酸，從提取毛霉菌核酸的濃度及PCR擴(kuò)增后Ct值進(jìn)行效能比較，從中篩選出適合臨床實(shí)驗(yàn)室毛霉菌核酸快速提取的實(shí)用方法。

本研究采用改良?jí)A裂解法、一步法及磁珠法提取R.miehei，L.corymbifera和M.circinelloides3株毛霉菌，結(jié)果顯示三種提取方法均能提取出毛霉菌核酸，提取的毛霉菌核酸濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中磁珠法提取的毛霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA濃度低于一步法和改良?jí)A裂解法，這與不同提取方法的原理有關(guān)[11-12]：①磁珠法是使用高濃度異硫氰酸胍或十二烷基硫酸鈉將細(xì)胞破壞，使核酸游離出來，在高鹽低pH值的情況下與磁珠表面硅基結(jié)合，經(jīng)過洗滌、漂洗、吸干，最后在低鹽高pH值的環(huán)境下將核酸釋放出來，可有效去除PCR干擾物，但存在DNA損失。②一步法和改良?jí)A裂解法是直接將樣本與裂解液混合，室溫或加熱提取核酸的方法，提取的核酸里不僅有核酸，還有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，但提取過程中基本不存在DNA損失。

為使結(jié)果具有可比性，本研究采用除了核酸提取方法不同外，其余的核酸模板上樣量、PCR擴(kuò)增試劑和PCR擴(kuò)增儀均一致，并同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果表明3種方法提取的3株毛霉菌核酸均能擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果，且提取的不同種毛霉菌核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后Ct值呈現(xiàn)多樣性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。改良?jí)A裂解法提取R.miehei菌株的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后Ct值和磁珠法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提取L.corymbifera菌株的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值小于一步法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提取M.circinelloides菌株的核酸產(chǎn)物擴(kuò)增后的Ct值雖都大于一步法和磁珠法，但在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)40個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增后結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性（Ct值為17.57±0.26）。本研究還發(fā)現(xiàn)，改良?jí)A裂解法在耗時(shí)、耗費(fèi)成本和設(shè)備依賴度等方面均優(yōu)于一步法和磁珠法。因此對(duì)模板核酸的純度沒有嚴(yán)格要求時(shí)，從經(jīng)濟(jì)、可操作性角度等方面綜合考慮改良?jí)A裂解法提取毛霉菌核酸更實(shí)用。由于本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性樣本均為標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)物，樣本類型單一，樣本中是否含有其他干擾核酸提取和抑制PCR擴(kuò)增的物質(zhì)還不得而知，所以用患者的不同陽(yáng)性標(biāo)本類型進(jìn)行提取效率的驗(yàn)證值得探索。

綜上所述，改良?jí)A裂解法、一步法及磁珠法均可用于毛霉菌核酸提取，且提取的毛霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸均能擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果。改良?jí)A裂解法可在短時(shí)間內(nèi)快速提取毛霉菌核酸，所需成本低，操作簡(jiǎn)便，所提取的毛霉菌核酸模板的濃度可滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的要求，因此為了節(jié)省時(shí)間和成本可應(yīng)用改良?jí)A裂解法提取毛霉菌核酸。