乳腺癌患者血清NR3C2和DNMT3A表達水平及其診斷價值研究

張凌捷，葛 睿，程愛群，胡天華

（復旦大學附屬華東醫(yī)院普外科，上海 200040）

乳腺癌是全世界最常見的和最致命的女性惡性腫瘤之一，具有高度異質性的生物學和臨床特征[1]。據(jù)統(tǒng)計，其發(fā)病率逐年上升，死亡率在女性惡性腫瘤中排名第二。近年來，盡管臨床診斷和治療體系有較大改善，但乳腺癌的復發(fā)和轉移率仍較高，預后較差[3]。因此，仍需鑒定新的腫瘤生物標志物和治療靶點，以提高乳腺癌的診斷和治療水平。越來越多的研究表明，核受體亞家族C組成員2（nuclear receptor subfamily 3,group C,member 2，NR3C2）可以抑制某些腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[4-5]。DNA甲基化轉移酶-3A[DNA(cytosine-5)-methyltransferase 3A，DNMT3A]是一種負責DNA甲基化的蛋白質，參與DNA甲基化的從頭建立，在腫瘤發(fā)生中起著至關重要的作用。DNA甲基化已被證明在乳腺癌的發(fā)展中起著極其重要的作用[6]。楊海榮等[7]人研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A在宮頸癌中顯著升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NR3C2和DNMT3A在乳腺癌患者血清中表達水平異常，而目前關于乳腺癌患者血清中NR3C2和DNMT3A的表達水平研究較少，且關于兩者對乳腺癌的診斷價值更是鮮有報道。因此，本文檢測乳腺癌患者血清中NR3C2和DNMT3A的表達水平，并分析其臨床意義，以期為乳腺癌的早期臨床診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集復旦大學附屬華東醫(yī)院2017年5月～2020年12月期間住院的94例乳腺癌患者為乳腺癌組，全為女性，患者年齡45～72（60.50±5.62）歲。收集一般臨床資料，包括腫瘤部位、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織分化程度等。另選取同期86例女性健康體檢者為對照組，年齡40～68（59.50±5.28）歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.227，P＞0.05）。納入標準：①乳腺癌組均經病理活檢確診為乳腺癌；②臨床資料完整；③患者術前未接受放療或化療。排除標準：①并發(fā)其他臟器功能障礙；②并發(fā)炎性乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。本研究經患者及家屬簽署知情同意書，且經本院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 人NR3C2酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號：E0158h），人DNMT3A ELISA試劑盒（批號：E13889h）[伊艾博（武漢）科技股份有限公司]；酶標儀[型號：SpectraMax i3x，美谷分子儀器（上海）有限公司]。

1.3 方法 采用ELISA法檢測血清NR3C2，DNMT3A水平。收集所有患者入院后次日清晨空腹外周靜脈血3～4 ml，對照組體檢時采集當日空腹時靜脈血3～4 ml，5 000 r/min離心8 min，留取上清液，于-20℃冰箱中保存，待檢。血清NR3C2和DNMT3A的測定嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS25.0分析本研究數(shù)據(jù)。其中計數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；Pearson法分析乳腺癌患者血清NR3C2和DNMT3A表達水平相關性；多因素Logistic回歸分析影響乳腺癌發(fā)生的因素；受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清NR3C2與DNMT3A診斷乳腺癌的價值。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清NR3C2與DNMT3A水平比較 乳腺癌組患者血清NR3C2水平為317.84±33.47 ng/L，低于對照組（374.25±47.72ng/L），DNMT3A的表達水平為451.63±75.47 μg/L，高于對照組（349.85±63.72 μg/L），差異具有統(tǒng)計學意義（t=9.243，9.729，均P＜0.05）。

2.2 NR3C2與DNMT3A表達水平與乳腺癌組患者臨床病理特征的關系 見表1。根據(jù)乳腺癌患者血清中NR3C2與DNMT3A表達水平均值分為NR3C2低表達（n=53，NR3C2＜317.84ng/L）與NR3C2高表達（n=41，NR3C2≥317.84ng/L），DNMT3A低表達（n=43，DNMT3A＜451.63μg/L）與DNMT3A高表達（n=51，DNMT3A≥451.63μg/L）。結果表明，NR3C2，DNMT3A高表達組與低表達組在TNM分期、淋巴結轉移、組織分化之間差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 NR3C2與DNMT3A表達與臨床病理特征之間的關系[n(%)]

2.3 乳腺癌患者血清NR3C2，DNMT3A表達水平相關性 見圖1。Pearson分析結果顯示，乳腺癌患者血清NR3C2與DNMT3A表達水平存在明顯負相關（r=-0.501，P=0.000）。

圖1 乳腺癌患者血清NR3C2，DNMT3A表達水平相關性

2.4 多因素Logistic回歸分析乳腺癌發(fā)生影響因素見表2。以乳腺癌是否發(fā)生為因變量，以血清NR3C2，DNMT3A水平為自變量，行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，NR3C2高水平為乳腺癌發(fā)生的保護因素（P＜0.05），DNMT3A高水平是乳腺癌發(fā)生的危險因素（P＜0.05）。

表2 多因素Logistic回歸分析乳腺癌發(fā)生的影響因素

2.5 血清NR3C2與DNMT3A水平評估乳腺癌的診斷價值 見表3。ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清NR3C2與DNMT3A診斷乳腺癌的最佳截斷值分別為334.828 ng/L和413.223 μg/L，曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.853和0.930，當兩者聯(lián)合時其AUC為0.969，高于兩者單獨檢測（Z=3.460，1.894，P=0.000，0.034）。

表3 血清NR3C2與DNMT3A水平對乳腺癌的診斷價值評估

3 討論

乳腺癌是女性最常見和最致命的癌癥[8]。在發(fā)展中國家和發(fā)達國家，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍在上升[9-10]。雖然強化化療、放療和靶向治療使乳腺癌患者的預后得以改善，但其仍是全球癌癥死亡的第五大原因[11]。因此，迫切需要尋找生物標志物來診斷和準確地預測乳腺癌。

核受體亞家族C組成員2（NR3C2）可以抑制某些腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[4-5]。被定義為一種鹽皮質激素受體基因，編碼腎上腺皮質激素受體[11]。作為轉錄依賴性因子，腎上腺皮質激素受體可以與鹽皮質激素反應元件結合，介導醛固酮對受限靶細胞鹽和水平衡的影響。近期研究表明，NR3C2在幾種類型的癌癥中下調，并且已被證明具有抑制作用，例如，NR3C2在結腸癌細胞中的表達下調，NR3C2的過表達抑制了結腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成[12]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，NR3C2在肺腺癌、大細胞肺癌也呈現(xiàn)低表達[13]。PENG等[14]人研究發(fā)現(xiàn)NR3C2的低表達與乳腺癌患者的預后不良密切相關。LU等[15]人也研究報道，與正常乳腺組織相比，浸潤性乳腺癌組織中NR3C2的表達水平降低。因此，我們推測NR3C2在乳腺癌患者表達降低。本研究結果顯示，與對照組相比，乳腺癌組患者血清NR3C2的表達水平顯著降低，表明NR3C2高表達能夠抑制乳腺癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。與上述結果一致。

DNA低甲基化或高甲基化以及染色質重塑與乳腺癌發(fā)展和惡性進展密切相關。例如，DNA甲基化轉移酶-3A（DNMT3A）在乳腺瘤中的表達高于纖維腺瘤[16]。還有報道DNMT3A在乳腺腫瘤組織中比相鄰的正常標本表達高[17]。此外，與原發(fā)性乳腺癌患者相比，DNMT3A在具有腦轉移瘤的乳腺癌中具有高表達[18]。同樣，本研究結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，乳腺癌組患者血清DNMT3A的表達水平顯著升高，表明DNMT3A對于乳腺癌發(fā)病進程具有促進作用。另外，Pearson相關性分析結果顯示，乳腺癌患者血清中NR3C2與DNMT3A表達水平呈顯著負相關，推測二者可能是直接或間接參與調控乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲過程中關鍵因子表達，共同影響乳腺癌的進程。但其具體調控機制尚未明確。經Logistic回歸分析結果顯示，NR3C2高水平為乳腺癌發(fā)生的保護因素，DNMT3A高水平，TNM分期（III～IV期）、淋巴結轉移以及組織低分化均是乳腺癌發(fā)生的危險因素，表明NR3C2低水平、DNMT3A高水平與乳腺癌的發(fā)生密切相關，下一步研究可通過體內外實驗驗證兩者關系，為乳腺癌的治療提供新的思路。ROC曲線結果發(fā)現(xiàn)，血清NR3C2與DNMT3A診斷乳腺癌的AUC分別為0.853和0.930，當兩者聯(lián)合時其AUC為0.969，高于兩者單獨檢測，表明兩者聯(lián)合檢測對于乳腺癌的診斷具有較高的價值。

綜上所述，乳腺癌患者血清中NR3C2表達水平降低，DNMT3A表達水平升高，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，且兩者聯(lián)合檢測對于診斷乳腺癌的發(fā)生具有較高的價值，NR3C2與DNMT3A有望作為診斷乳腺癌的特異度指標。但本研究并未對NR3C2，DNMT3A與乳腺癌病理機制的關系進行研究，后續(xù)需進一步深入研究。