原發(fā)性腎病綜合征患兒治療前后外周血CXCL13和PD-L1+B淋巴細胞水平變化及臨床意義研究

胡 洋，揚 力，陳 靜（邯鄲市中心醫(yī)院.病案科；.內(nèi)分泌科；.生殖科，河北邯鄲 056000）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童常見的腎小球疾病之一，首選用藥為糖皮質(zhì)激素治療，但是約90%患兒會在治療過程中出現(xiàn)激素依賴和復(fù)發(fā)，PNS病情進展與激素耐藥和激素依賴有關(guān)[1-2]。近年有研究表明，PNS發(fā)病與免疫功能紊亂關(guān)系密切，細胞免疫和體液免疫功能異常同時存在[3-4]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，B淋巴細胞耗竭劑利妥昔單抗治療能有效降低難治性PNS復(fù)發(fā)頻次[5-6]，提示B淋巴細胞功能異常參與PNS發(fā)病。趨化因子C-X-C基序配體13（chemokine C-X-C motif ligand 13，CXCL13）是B淋巴細胞趨化因子，可吸附、直接調(diào)控B細胞的成熟和發(fā)育，參與機體免疫系統(tǒng)信號傳遞[7]。CXCL13/CXCR5共同作用參與外周循環(huán)B淋巴細胞歸巢到淋巴結(jié)的過程，并促進次級淋巴結(jié)內(nèi)B淋巴細胞分化為漿細胞，調(diào)控體液免疫[8]。程序性死亡受體配體1（programmed death protein ligand 1,PD-L1）與程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）結(jié)合可抑制機體免疫細胞分泌細胞因子[9]。有學(xué)者報道，B細胞膜上表達的PD-L1與PD-1表達陽性的T細胞結(jié)合，可以抑制T淋巴細胞的活化增殖及間接影響生發(fā)中心B細胞的形成和發(fā)展[10]。實體腫瘤中也證實，調(diào)節(jié)性B細胞膜上PD-L1高表達，通過PD-1/PD-L1軸能夠抑制T細胞對腫瘤細胞的免疫抑制作用[9]。目前有關(guān)PNS與B淋巴細胞功能異常的研究有限，本文探究了PNS患兒治療前后外周血中CXCL13和PD-L1+B淋巴細胞水平變化，并討論了PNS免疫功能紊亂的可能機制，期望為兒童PNS研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2022年4～12月邯鄲市中心醫(yī)院收治的激素敏感型初發(fā)PNS患兒52例進行研究，男性35例，女性17例，年齡2.36～12.05(6.43±2.61)歲；診斷符合2016 版《兒童激素敏感、復(fù)發(fā)/依賴腎病綜合征診治指南》[11]的標準，入院后給予糖皮質(zhì)激素治療。排除入院前使用免疫制劑或糖皮質(zhì)激素治療患兒；①并發(fā)感染、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及惡性腫瘤等繼發(fā)性因素；②并發(fā)其他腎臟疾病史和繼發(fā)性PNS。另選取同期本院健康體檢兒童30例為對照，男性19例，女性11例，年齡2.14～12.10 (6.52±2.73)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t/χ2=0.148，0.134，P=0.833，0.715）。所有家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 BV650標記的抗人CD19抗體，F(xiàn)ITG標記的抗人PD-L1抗體（Biolegend公司）；LSRFortessaTM型流式細胞儀（美國 BD Biosciences公司）；酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法與療效判定：所有患兒均給予醋酸潑尼松片（江蘇恒瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號200226），按照患兒體重2 mg/（kg·d），分3次口服，服用4周后開始逐漸減量，每4周減5.0 mg，治療6個月。療效判定：完全緩解以血生化、尿檢完全正常為標準。

1.3.2 外周血B細胞及PD-L1+B淋巴細胞檢測：收集所有兒童晨起空腹靜脈血2 ml，EDTA抗凝，密度梯度離心法分離單個核細胞，2 500 r/min離心棄上清，PBS洗滌2次，用PBS重懸細胞調(diào)整濃度為1×106個/ml，吸取100 μl，加入CD19-BV650，PDL1-FITC抗體各1 μl混勻，每個對照組管加入抗FITC，BV650標記的同型抗體，室溫避光孵育30 min，加入紅細胞裂解液，混勻靜置15 min，加入2 ml PBS，離心棄上清，于流式細胞儀檢測外周血中總B細胞（CD19+B）及PD-L1+B淋巴細胞百分比，用Cell Quest軟件進行分析。

1.3.3 血清CXCL13，sPD-L1及細胞因子水平檢測：收集所有兒童晨起空腹靜脈血6 ml，EDTA抗凝，2 500 r/min離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測患兒血清中CXCL13和可溶性PD-L1（sPD-L1），同時檢測兩組轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-10（IL-10）和白細胞介素-1β（IL-1β）等細胞因子水平。

1.3.4 臨床數(shù)據(jù)收集：收集患兒血清清蛋白（albumin，ALB）、24h尿蛋白定量、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、總T細胞計數(shù)（CD3+T）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件。對計量資料進行K-S檢驗顯示均方差齊性符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (±s) 表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，PNS組治療前后比較采用配對樣本t檢驗。PNS患兒外周血PD-L1+B淋巴細胞和CXCL13及與實驗室指標的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床實驗室指標比較 見表1。與健康對照組比較，PNS組ALB和IgG水平降低，24h尿蛋白定量及IgM和總T細胞計數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），兩組Scr，BUN比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 兩組臨床實驗室指標水平比較（±s）

表1 兩組臨床實驗室指標水平比較（±s）

項 目健康對照組PNS組t值P值A(chǔ)LB（g/L）47.36±3.1316.42±2.4749.473＜0.001 24h尿蛋白定量（mg/kg·d）6.57±1.56104.05±28.49-18.675＜0.001 Scr（mmol/L）3.86±1.064.13±1.23-1.0060.318 BUN（umol/L）31.34±4.8532.25±5.08-0.7940.429 CD3+T計數(shù)（個）1283.18±285.392070.64±371.15-10.027＜0.001 IgM（g/L）1.09±0.341.74±0.53-6.031＜0.001 IgG（g/L）5.37±1.243.49±1.585.594＜0.001

2.2 兩組B細胞、PD-L1+B淋巴細胞及血清CXCL13，sPD-L1和細胞因子水平比較 見表2。與健康對照組比較，PNS組治療前患兒外周血總B細胞、PD-L1+B淋巴細胞及血清CXCL13，sPD-L1，TGF-β1，TNF-α，IL-10和IL-1β水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；PNS組患兒治療后各細胞及血清指標水平均較治療前下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 兩組B細胞、PD-L1+B淋巴細胞及血清CXCL13，sPD-L1和細胞因子水平比較（±s）

表2 兩組B細胞、PD-L1+B淋巴細胞及血清CXCL13，sPD-L1和細胞因子水平比較（±s）

PNS組治療前 vs 健康對照組治療后 vs 治療前治療前治療后tPtP總B細胞（%）4.95±2.8312.54±4.236.20±2.48-10.754＜0.0019.324＜0.001 PD-L1+B淋巴細胞（%）0.35±0.121.17±0.380.43±0.25-11.468＜0.00111.731＜0.001 CXCL13（pg/ml）53.67±12.42121.03±30.5265.27±14.16-11.526＜0.00111.951＜0.001 sPD-L1（pg/ml）47.27±8.14116.25±25.6855.63±11.44-14.271＜0.00115.549＜0.001 TGF-β1（ng/ml）12.53±1.6217.91±2.0414.35±1.82-12.360＜0.0019.930＜0.001 TNF-α（ng/ml）52.43±4.6877.65±7.2756.48±4.16-17.048＜0.00118.226＜0.001 IL-10（pg/ml）4.76±1.2514.21±3.565.15±1.09-14.017＜0.00117.548＜0.001 IL-1β（ng/ml）35.57±5.9264.38±7.4639.38±4.05-18.103＜0.00121.237＜0.001項 目健康對照組

2.3 PNS患兒外周血PD-L1+B淋巴細胞和CXCL13及與實驗室指標的相關(guān)性 見表3。Pearson相關(guān)性分析，PD-L1+B淋巴細胞比例與ALB和IgG水平呈負相關(guān)，與IgM水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；CXCL13表達水平與ALB和IgG水平呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；PD-L1+B淋巴細胞比例與CXCL13表達水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

目前原發(fā)性腎病綜合征（PNS）發(fā)病機制尚未完全明確，研究發(fā)現(xiàn)患兒外周血淋巴細胞亞群比例改變，PNS頻繁復(fù)發(fā)和激素耐藥與患兒體內(nèi)免疫功能異常有關(guān)，監(jiān)測治療過程中發(fā)現(xiàn)免疫功能明顯變化，證實PNS發(fā)病與免疫功能紊亂密切相關(guān)[12]。PNS發(fā)病涉及細胞機制、免疫致病、炎癥介質(zhì)損傷和遺傳因素[1]，其中免疫致病的相關(guān)因素研究是PNS近年的熱點。

PNS發(fā)病與T細胞亞群紊亂及致病T細胞因子升高有關(guān)，T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫在PNS發(fā)病中發(fā)揮主導(dǎo)作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，PNS不僅與T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫有關(guān)，也和B細胞介導(dǎo)的體液免疫關(guān)系密切[14]。在疾病活動期頻繁復(fù)發(fā)型和激素依賴型PNS患兒總B細胞、記憶B細胞、過渡B細胞水平明顯升高。隨著免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（影響B(tài)細胞存活）和生物制劑利妥昔單克隆抗體（耗竭B細胞）藥物在PNS中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)有效地預(yù)防了疾病復(fù)發(fā)，證實由B細胞介導(dǎo)的體液免疫參與PNS發(fā)病[5-6]。本研究結(jié)果檢測證實PNS患兒體內(nèi)免疫紊亂。最新研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡受體配體1（PD-L1）+B淋巴細胞與濾泡輔助性T細胞上表達的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合抑制該T細胞的生成，降低體液免疫活化所需的輔助作用，在自身免疫性疾病和體液免疫疾病中發(fā)揮重要作用[17-18]。通常PD-L1+B細胞在各種疾病中扮演著免疫應(yīng)答的負性調(diào)節(jié)作用，而在PNS研究中，呂治安等[19-20]研究表明，PD-1/PD-L1信號參與了PNS的發(fā)病過程。本研究亦發(fā)現(xiàn)外周血PD-L1+B淋巴細胞和血清sPD-L1表達升高與PNS發(fā)病相關(guān)。低ALB是PNS診斷的特征條件之一，主要原因是腎小球通透性改變或濾過屏障損傷造成ALB從尿液中大量丟失[21]。大多數(shù)PNS在初發(fā)期和復(fù)發(fā)期均存在低IgG血癥，說明分泌免疫球蛋白的B細胞免疫功能紊亂，IgM則升高[22]。本研究中得出PD-L1+B淋巴細胞表達均與ALB，IgG和IgM顯著相關(guān)，分析PD-L1+B細胞可能促進PNS患兒的體液免疫反應(yīng)，造成IgM和IgG分泌異常。

趨化因子C-X-C基序配體13（CXCL13）是唯一可與CXCR5受體結(jié)合的配體，穩(wěn)定表達于成熟的B細胞、輔助性及調(diào)節(jié)性T細胞，參與免疫調(diào)控[7]。據(jù)文獻報道，CXCL13能夠調(diào)控外周循環(huán)B淋巴細胞歸巢到淋巴結(jié)的過程，可促進次級淋巴結(jié)內(nèi)B淋巴細胞分化為漿細胞，發(fā)揮體液免疫[23]。自身免疫性疾病中已證實CXCL13存在異常，本研究也表明CXCL13高表達參與了PNS發(fā)病。另外有學(xué)者報道，免疫反應(yīng)失衡和炎癥反應(yīng)亢進與PNS有關(guān)，炎癥介質(zhì)TGF-β1和TNF-α等作用于腎小球，可介導(dǎo)炎癥損傷，參與免疫反應(yīng)，誘發(fā)PNS的發(fā)生[17]。ANSEL等[24-25]報道，CXCL13作為B淋巴細胞趨化劑，與CXCR5結(jié)合可選擇性的介導(dǎo)外周血中B細胞的趨化性，增加B細胞產(chǎn)生釋放IL-10和IL-1β等細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)。最新研究表明，CXCL13可作為糖皮質(zhì)激素治療的一種血清標志物，反映B細胞免疫的效應(yīng)程度[21]。本研究結(jié)果表明PNS患兒自身存在炎癥反應(yīng)，疾病發(fā)生期CXCL13和炎癥細胞因子釋放增加；治療后機體免疫紊亂改善，炎癥反應(yīng)受到抑制，猜測CXCL13可能通過促進外周血B淋巴細胞趨化性，促進免疫細胞生產(chǎn)炎癥細胞因子，引起炎癥和抗炎反應(yīng)激活，加重PNS早期過度免疫炎癥反應(yīng)。然而B細胞介導(dǎo)的免疫與PNS的關(guān)系研究較少見，具體作用調(diào)控分子機制仍需后期進一步的研究明確。積極研發(fā)靶向CXCL13的抑制劑或藥物，或許能通過抑制B淋巴細胞趨化性，進而減輕過度免疫炎癥反應(yīng)，降低PNS對患兒的損害，為PNS早期診療提供新的策略。

綜上所述，CXCL13和PD-L1+B淋巴細胞比例升高與PNS患兒免疫系統(tǒng)紊亂相關(guān)。CXCL13可能通過促進外周血中B淋巴細胞趨化性，增加免疫細胞生產(chǎn)炎癥細胞因子，加重PNS早期過度免疫炎癥反應(yīng)。