心房顫動(dòng)患者血清miR-29b和miR-135b水平表達(dá)與心房纖維化程度及射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究

李晶晶，劉曉晨，劉恩香，王岳勝（滄州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北滄州 061000）

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）簡(jiǎn)稱房顫，是臨床上常見(jiàn)的快速心律失常疾病[1]。AF是心功能不全、腦卒中等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，易引起嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]。關(guān)于AF的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，有觀點(diǎn)認(rèn)為其可能與心房重構(gòu)、心房纖維化等病理生理改變有關(guān)[3]。目前，治療AF的主要方法有藥物保守治療、外科手術(shù)和射頻消融術(shù)。其中射頻消融術(shù)在治療效果上較藥物治療、外科手術(shù)治療要好，可以更好地維持患者的竇性心律，提高患者的運(yùn)動(dòng)耐力[4]。但射頻消融術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重影響患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸。因此，早期預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)對(duì)于干預(yù)措施的制定具有一定臨床意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是一種小的非編碼單鏈RNA，21～23個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)水平[5]。miRNAs在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及人類疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[6]。有研究表明，miRNAs可能與心肌纖維化也有關(guān)[7]，miRNAs作用于心臟成纖維細(xì)胞并調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的存活[8]。miRNAs可在不同環(huán)節(jié)參與心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，并參與AF的發(fā)生。近年來(lái)，關(guān)于miRNAs與AF關(guān)系的研究也越來(lái)越多[9]，但目前關(guān)于miRNAs的表達(dá)與射頻消融術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性的研究還處于初步階段，因此，本研究檢測(cè)AF患者血清miR-29b和miR-135b的表達(dá)，并分析miR-29b和miR-135b的表達(dá)與心房纖維化及AF患者射頻消融術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性，旨在為AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)相關(guān)生物標(biāo)志物的尋找提供理論依據(jù)，期望改善AF患者預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年7月～2022年7月于滄州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院診治并接受射頻消融術(shù)治療的AF患者158例（病例組），其中男性82例，女性76例，平均年齡67.23±5.1歲，身體質(zhì)量指數(shù) (body mass index，BMI) 23.53±3.12 kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合人民衛(wèi)生出版社第八版《內(nèi)科學(xué)》指定的AF診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②臨床資料完整，基本資料匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：①瓣膜性房顫（機(jī)械瓣或生物瓣置換術(shù)后、二尖瓣修復(fù)后的房顫），心房血栓形成及病態(tài)竇房結(jié)綜合征者；②既往接受過(guò)房顫消融術(shù)或起搏器植入術(shù)，環(huán)肺靜脈隔離術(shù)后加行二尖瓣峽部、左房房頂、三尖瓣峽部、碎裂電位消融；③心電圖質(zhì)量較差影響測(cè)量，不能接受隨訪的患者。另選同期在本院體檢的健康者126例（對(duì)照組），其中男性62例，女性64例，平均年齡68.29±4.85歲，BMI 23.46±3.10 kg/m2。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/t=0.001,1.377,均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：20190522），兩組受試者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 日立7180全自動(dòng)生化分析儀（江西仁隆生物技術(shù)），ABI 7500型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司），RNA提取試劑（賽默飛世爾科技），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），SYBR Green Master Mix（2×）（北京伊塔生物科技有限公司），HD6彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)（荷蘭Philips公司）。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集：收集所有AF患者入院后的一般臨床資料：包括性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、糖尿病史、冠心病史等情況。

1.3.2 樣本采集：采集所有患者術(shù)前清晨空腹肘靜脈血5ml，低溫靜置30min，3 000r/min離心10min，留取上清，分裝于無(wú)菌EP管中，于-20℃冰箱中保存，待測(cè)。

1.3.3 生化指標(biāo)測(cè)定：射頻消融術(shù)后，HD6彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)收集患者的左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular fraction，LVEF）、左心房?jī)?nèi)徑資料；采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定患者的空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、低密度脂蛋白-膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferas，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血肌酐（creatinine，CR）、尿酸（uric acid，UA）和血尿素（UREA）。

1.3.4 血清miR-29b和miR-135b測(cè)定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清miR-29b和miR-135b水平。按照總RNA提取試劑操作步驟分離提取血清總RNA，并測(cè)定其濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成的cDNA保存于-80℃冰箱中。用合成的cDNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），采用ABI 7500型qRT-PCR儀檢測(cè)血清miR-29b和miR-135b相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)閁6，引物經(jīng)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)后由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系共20 μl：cDNA（50 ng/μl）2 μl，qRT-PCR檢測(cè)使用SYBR Green Master Mix（2×）10 μl，PCR上下游引物（10μmol/L）各1 μl，加ddH2O至20 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 45s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)后，采集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-29b和miR-135b基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-29b，miR-135b和U6 qRT-PCR引物序列

1.3.5 心房纖維化程度檢測(cè)：158例患者均進(jìn)行射頻消融術(shù)，術(shù)中留取心肌標(biāo)本。采用福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、脫蠟，參考李慶勇等[11]的方法。每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野，測(cè)定每個(gè)視野中的膠原面積，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。根據(jù)AF患者心房組織CVF平均數(shù)，將患者分為高纖維化組（n=77）和低纖維化組（n=81）。

1.3.6 隨訪：所有患者術(shù)后進(jìn)行為期6個(gè)月的隨訪，隨訪方式以電話或者門診復(fù)查方式。隨訪頻次為術(shù)后每?jī)蓚€(gè)月1次，若患者有心悸等癥狀及時(shí)記錄常規(guī)心電圖及24h動(dòng)態(tài)心電圖。復(fù)發(fā)定義為術(shù)后3個(gè)月空白期后，24h動(dòng)態(tài)心電圖記錄≥30s的房顫、房撲或房速。根據(jù)患者AF是否復(fù)發(fā)，分為復(fù)發(fā)組（n=72）和未復(fù)發(fā)組（n=86）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以“百分率（%）”表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素；受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-29b和miR-135b水平對(duì)AF患者的術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與病例組血清miR-29b和miR-135b相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，AF患者血清miR-29b（0.64±0.13 vs 1.04±0.24）和miR-135b（0.45±0.08 vs 1.00±0.14）的相對(duì)表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.916，41.604，均P＜0.05）。

2.2 不同心房纖維化程度患者血清miR-29b和miR-135b相對(duì)表達(dá)水平比較 與低纖維化患者比較，高纖維化患者的血清miR-29b（0.51±0.11 vs 0.76±0.15），miR-135b（0.34±0.07 vs 0.55±0.09）相對(duì)表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.896，16.314，均P＜0.05）。

2.3 AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組臨床資料比較 見(jiàn)表2。與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組的左心房?jī)?nèi)徑、UA水平增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其他臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組臨床資料比較[n（%），（±s）]

表2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組臨床資料比較[n（%），（±s）]

類 別復(fù)發(fā)組（n=72）未復(fù)發(fā)組（n=86）t/χ2P值性別 男41（56.94）44（51.16）0.5270.468女31（43.06）42（48.84）年齡（歲）67.34±5.2467.14±5.000.2450.807體重指數(shù)（kg/m2）23.75±3.5423.35±2.230.8630.389吸煙史40（55.56）42（48.84）0.7090.400高血壓史23（31.94）21（24.42）1.1050.296糖尿病史12（16.67）15（17.44）0.0170.897冠心病史14（19.44）13（15.12）0.5180.472 FPG（mmol/L）6.21±1.156.14±1.060.03980.691 LVEF(%)59.23±3.2158.23±4.121.6770.096左心房?jī)?nèi)徑（mm）45.34±3.5635.23±2.8919.7020.001 LDL-C（mmol/L）2.97±0.862.81±0.641.3390.183 TC（mmol/L）3.88±1.163.78±1.080.5600.576 TG（mmol/L）1.53±0.451.51±0.360.3100.757 ALT（U/L）26.47±5.1425.17±4.891.6360.106 AST（U/L）28.14±5.6729.45±5.471..4740.142 CR（μmmol/L） 78.76±20.1774.47±18.451.3950.165 UA（μmol/L） 478.15±68.45421.75±61.765.4410.001 UREA（mmol/L）10.45±2.469.83±2.111.7050.090

2.4 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-29b和miR-135b表達(dá)水平比較 與未復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)組的血清miR-29b（0.54±0.12 vs 0.72±0.14），miR-135b（0.53±0.10 vs 0.36±0.06）的相對(duì)表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.584，12.642，均P＜0.05）。

2.5 影響AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)的Logistic多因素分析見(jiàn)表3。以AF患者射頻消融術(shù)后是否復(fù)發(fā)為因變量（是=1，否=0），左心房直徑、UA，miR-29b和miR-135b為自變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，左心房直徑、UA，miR-29b和miR-135b是AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素（均P＜0.05）。

表3 AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic 回歸分析

2.6 血清miR-29b和miR-135b對(duì)AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 見(jiàn)圖1。miR-29b和miR-135b預(yù)測(cè)AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.843（95%CI：0.783～0.902），0.901（95%CI：0.852～0.949），miR-29b和miR-135b聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC最大，為0.947（95%CI：0.914～0.981），靈敏度分別為65.1%，80.2%和90.75%，特異度分別為88.9%，91.7%和83.1%，具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。二者聯(lián)合與血清miR-29b，miR-135b單獨(dú)檢測(cè)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.288，1.493，P=0.135，0.022）。

圖1 血清miR-29b，miR-135b預(yù)測(cè)AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

3 討論

心房顫動(dòng)（AF）的典型特征是快速無(wú)規(guī)律的心跳，可能無(wú)癥狀或出現(xiàn)心悸、呼吸困難和頭暈等癥狀。AF還可能伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括心力衰竭、中風(fēng)等，甚至可能導(dǎo)致死亡[12]。我國(guó)成人的AF患病率為0.77%，隨著年齡的增長(zhǎng)AF的患病率逐漸升高[13]。射頻消融術(shù)是臨床上AF治療的最為有效的手段之一，然而術(shù)后復(fù)發(fā)依然是困擾臨床工作的常見(jiàn)問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)AF患者血清miR-29b和miR-135b的研究，希望發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的價(jià)值。

AF患者心房結(jié)構(gòu)重塑突出特征為心房纖維化。心房纖維化即異常膠原纖維在正常心房肌間質(zhì)中沉積，使正常心房肌間質(zhì)中膠原纖維含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致心肌間質(zhì)中不同類型的膠原蛋白比例失調(diào)、膠原纖維排列紊亂[14]。miRNAs可對(duì)多種疾病及細(xì)胞增殖和分化進(jìn)行調(diào)控[15]。有研究表明，miRNAs在調(diào)控AF的發(fā)生中具有潛在作用，在房顫中，miRNAs參與電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，miRNAs的異常表達(dá)可導(dǎo)致AF發(fā)生的易患性增加[16]。HAN等[17]研究表明，miR-29b在AF患者的心房組織及心房成纖維化細(xì)胞中表達(dá)下降，心房纖維化程度加重。YU等[18]研究表明，miR-29b通過(guò)抑制Ⅰ型膠原α1（collagen type I alpha chain 1 gene，COL1A1）、Ⅱ型膠原-α1（COL2A1）和Ⅲ型膠原-α1（COL3A1）等膠原合成潛力，參與纖維化的過(guò)程。高雅等[19]研究表明，非瓣膜性心房顫動(dòng)（nonvalvular atrial fibrillation，NVAF）患者外周血miR-29b呈低表達(dá)，且miR-29b的表達(dá)越低，NVAF的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)就越高。賈偉佳等[20]研究表明，miR-135b在多種疾病中參與表達(dá)，miR-135b在心律失常性右室心肌?。╝rrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC）中表達(dá)降低，ROC分析表明miR-135b與ARVC有關(guān)。WANG等[21]研究中，miR-135b在大鼠AF組織中表達(dá)下調(diào)，與大鼠的心房纖維化有關(guān)。以上研究均表明血清miR-29b和miR-135b與AF等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究中血清miR-29b和miR-135b在AF患者中的表達(dá)水平低于對(duì)照組，且隨著心肌纖維化程度的增加而降低，提示miR-29b和miR-135b可能通過(guò)參與心肌纖維化造成心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)而導(dǎo)致AF的發(fā)生。分析原因，①miR-29b可調(diào)節(jié)心房心肌病患者心房TASK-1鉀通道表達(dá)，miR-29b或可通過(guò)miR-29b-VEGFA/TGF-β軸在房顫進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[22-23]；②miR-135b能夠抑制TGF-β/Smads通路，從而抑制成纖維化細(xì)胞的增殖、肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積，抑制心房組織纖維化，從而減輕房顫[21]。本研究接著研究了影響AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組左心房?jī)?nèi)徑和血清UA水平高于未復(fù)發(fā)組，提示左心房?jī)?nèi)徑和UA水平可能與AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。進(jìn)一步Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，左心房直徑、UA增加以及miR-29b，miR-135b降低是AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素，提示miR-29b和miR-135b可能在AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的過(guò)程中起保護(hù)作用。此外，本文中血清miR-29b和miR-135b預(yù)測(cè)AF患者射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.843，0.901，二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC為0.923，提示檢測(cè)血清miR-29b和miR-135b對(duì)預(yù)測(cè)AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)有較高的預(yù)測(cè)效能。故對(duì)AF患者血清miR-29b和miR-135b水平的檢測(cè)有望應(yīng)用于臨床，來(lái)預(yù)測(cè)AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)。

綜上所述，AF患者血清miR-29b和miR-135b水平降低，二者與AF患者心房纖維化程度及射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，對(duì)AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究中的隨訪時(shí)間較短，不能為長(zhǎng)期隨訪的預(yù)后提供較為準(zhǔn)確的依據(jù)，后續(xù)還需延長(zhǎng)隨訪時(shí)間并加大樣本量，對(duì)血清miR-29b和miR-135b水平參與AF患者術(shù)后復(fù)發(fā)的通路及其可能機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。