急性淋巴細(xì)胞白血病兒童血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平及其臨床價(jià)值研究

岳俊剛，陳 芳（江油市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川江油 621701）

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是兒童最常見的一種惡性腫瘤，起源于造血干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分化過程中的惡性增殖，與染色體變異、基因突變、蛋白異常表達(dá)等因素有關(guān)，其具體發(fā)病機(jī)制暫未明確[1-2]。微小核糖核酸（microRNA，miR）具有調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯和mRNA穩(wěn)定性的作用[3]。研究表明，miRNAs的異常表達(dá)和兒童急性淋巴細(xì)胞白血病關(guān)系密切，可將其作為診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病，并預(yù)測患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[4-5]。據(jù)報(bào)道，miR-1301-3p可作為肺癌的生物標(biāo)志物[6]。足糖萼蛋白（podocalyxin，PODXL）可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、凋亡，并廣泛存在于多種惡性腫瘤中[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在成熟的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞增殖、存活、遷移、耐藥性和代謝重編程過程中PODXL具有重要作用[8]。目前，miR-1301-3p和PODXL在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中作用的研究鮮有報(bào)道。因此本研究通過檢測兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)情況，探討miR-1301-3p和PODXL對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者的診斷和預(yù)后價(jià)值，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月～2019年1月在江油市第二人民醫(yī)院就診的146例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者作為觀察組，收集其臨床資料。其中男性81例，女性65例；＜8歲90例，≥8歲56例，平均年齡8.50±3.60歲。另選擇同期在本院體檢的健康兒童100例作為對照組，其中男性55例，女性45例，＜8歲55例，≥8歲45例，平均年齡8.30±3.92歲。本研究經(jīng)家屬知情同意并簽署知情同意書，且經(jīng)江油市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤14歲患者；②新發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病患者；③診斷、分型符合中華醫(yī)學(xué)會制定的《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第四次修訂)》[9]患者；④臨床資料完整患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非首次確診、經(jīng)過放療化療的患者；②由其他類型的白血病轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的急性淋巴細(xì)胞白血病患者；③并發(fā)血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤或自身免疫疾病的患者。

1.2 儀器與試劑 TRIzol試劑（貨號：NR0002，北京雷根生物技術(shù)有限公司）；miRNA-T反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：ST-200158-H，北京依托華茂生物科技有限公司）；熒光定量PCR試劑盒（貨號：BES-21153CBR，上海博爾森生物科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（型號：F-430，美國Bio-Rad公司），PODXL 酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：QS9814-A，上海欽勝生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集：采集觀察組患者確診當(dāng)天和對照組健康兒童體檢當(dāng)天的靜脈血4 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清。

1.3.2 qRT-PCR檢測血清miR-1301-3p相對表達(dá)量：使用TRIzol法提取血清總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 2μl，RNase Free dH2O（20 μl），Prime-Script RT Master Mix（4μl））后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，qRT-PCR檢測條件：95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)1次，95℃變性30s，55℃退火45s，75℃延伸15s，共循環(huán)35次。以U6為內(nèi)源對照，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1301-3p的表達(dá)水平。引物由上海烜雅生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 ELISA法檢測血清PODXL：采用ELISA檢測血清PODXL表達(dá)水平，操作過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 隨訪：從患者初次確診為兒童急性淋巴細(xì)胞白血病開始，進(jìn)行為期三年的隨訪，通過門診或電話的方式記錄患者生存情況。隨訪截止時(shí)間為2022年1月31日。隨訪終點(diǎn)為患者死亡或者隨訪結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0作為本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平關(guān)系采用Pearson相關(guān)性方法；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic curves，ROC）曲線評估患者血清miR 1301 3p和PODXL的表達(dá)對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷價(jià)值，采用Z檢驗(yàn)比較ROC曲線下面積（area under curve，AUC）；采用Kaplan-Meier法分析患者血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)對預(yù)后的影響；采用COX回歸分析影響兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平及相關(guān)性分析 觀察組血清miR-1301-3p（0.81±0.13）表達(dá)水平低于對照組（0.98±0.11），血清PODXL（18.69±4.96 ng/ml）表達(dá)水平高于對照組（15.56±4.32 ng/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.710，5.119，均P＜0.001）。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，觀察組血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.487,P＜0.05）。

2.2 血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷價(jià)值分析 見圖1。ROC曲線分析顯示，血清miR-1301-3p診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的AUC為0.858（95%CI：0.806～0.910），截?cái)嘀禐?.897，敏感度和特異度分別為78.1%，88.0%，約登指數(shù)為0.661；血清PODXL診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的AUC為0.729（95%CI：0.665～0.792），截?cái)嘀禐?6.740，敏感度和特異度分別為50.0%，87.0%，約登指數(shù)為0.370；miR-1301-3p和PODXL聯(lián)合診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的AUC為0.930（95%CI：0.893～0.967），顯著大于miR-1301-3p和PODXL單獨(dú)診斷的AUC（Z=2.236，P=0.025；Z=5.428，P＜0.001），敏感度和特異度分別為94.5%和85%，約登指數(shù)為0.795。

圖1 血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的ROC曲線

2.3 miR-1301-3p和PODXL表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 見表2。分別以miR-1301-3p和PODXL的ROC曲線分析的截?cái)嘀?.897，16.740 ng/ml為界限，將146例急性淋巴細(xì)胞白血病患者分為miR-1301-3p低表達(dá)組（n=98）和miR-1301-3p高表達(dá)組（n=48），PODXL低表達(dá)組（n=58）和PODXL高表達(dá)組（n=88）。兩組間卡方檢驗(yàn)顯示，miR-1301-3p低表達(dá)組患者的中高危險(xiǎn)分層、白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥50×109/L，MLL基因重排陰性、染色體核型異常、淋巴結(jié)腫大的比例均高于miR-1301-3p高表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.333，12.962，5.773，4.375，5.047，均P＜0.05）；PODXL高表達(dá)組患者的中高危險(xiǎn)分層、白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥50×109/L，MLL基因重排陰性、染色體核型異常和淋巴結(jié)腫大比例均高于PODXL低表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.912，7.038，11.843，11.440，23.708，均P＜0.05）。

表2 血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.4 miR-1301-3p和PODXL表達(dá)與患者生存率的關(guān)系 見圖2。對146例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者進(jìn)行為期三年的隨訪。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，miR-1301-3p低表達(dá)組的總生存率(39.80%)低于miR-1301-3p高表達(dá)組(62.50%)，PODXL高表達(dá)組的總生存率(38.64%)低于PODXL低表達(dá)組(60.34%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.31，9.419，均P＜0.05）。

圖2 miR-1301-3p和PODXL表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

2.5 COX回歸分析影響兒童淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后的危險(xiǎn)因素 自變量賦值見表3。以患者生存情況為因變量（0=存活，1=死亡），以白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）、危險(xiǎn)分層、染色體核型、MLL基因重排、淋巴結(jié)腫大以及miR-1301-3p和PODXL作為自變量進(jìn)行COX回歸分析，見表4。單因素COX回歸分析顯示，miR-1301-3p低表達(dá)、PODXL高表達(dá)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥50×109/L、中高危險(xiǎn)分層、染色體核型異常、MLL基因重排陰性、淋巴結(jié)腫大是影響兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。多因素COX回歸分析表明，miR-1301-3p低表達(dá)、PODXL高表達(dá)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥50×109/L、中高危險(xiǎn)分層、MLL基因重排陰性是影響兒童急性淋巴細(xì)胞白血病不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。

表3 COX回歸分析中自變量賦值表

表4 COX回歸分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病是一種骨髓造血干細(xì)胞異常分化、增殖導(dǎo)致的惡性腫瘤，包括多種亞型[10]。急性淋巴細(xì)胞白血病多發(fā)于兒童和青少年，聯(lián)合化療和異基因造血細(xì)胞移植是治療該病的主要方法[11]。急性淋巴細(xì)胞白血病是兒童和癌癥相關(guān)死亡的主要原因，盡管該病的臨床治愈率超過85%，但仍有約20%的患者會復(fù)發(fā)[12-13]。目前，臨床尚缺乏診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病并評價(jià)其預(yù)后的特異性指標(biāo)，故篩選與該病相關(guān)的診斷和預(yù)后指標(biāo)極其重要。

研究表明，miR-1301-3p在多種癌癥中發(fā)揮重要作用。例如，在前列腺癌細(xì)胞和組織中miR-1301-3p表達(dá)明顯上調(diào)，高水平miR-1301-3p能促進(jìn)前列腺癌發(fā)病相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)前列腺癌干細(xì)胞增殖[14]。在非小細(xì)胞肺癌組織中，miR-1301-3p的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良顯著相關(guān)[15]。而在胰腺癌組織中miR-1301-3p表達(dá)則下調(diào)，且其低表達(dá)水平與胰腺癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[16]。以上研究表明，在不同癌癥中miR-1301-3p的作用機(jī)制也各不相同。目前，miR-1301-3p在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病中相關(guān)機(jī)制仍未明確。本研究中，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者血清miR-1301-3p表達(dá)水平低于健康兒童，與上述研究結(jié)果一致[16]，且其與危險(xiǎn)分層、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MLL基因重排、染色體核型、淋巴結(jié)腫大有關(guān)，表明血清miR-1301-3p低表達(dá)對兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。此外，本研究中miR-1301-3p低表達(dá)患者的總生存率較低，說明低水平miR-1301-3p是影響兒童急性淋巴細(xì)胞白血病不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，可增加兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)。PODXL蛋白是一種跨膜蛋白，廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[17]。HE等[18]meta分析結(jié)果顯示，PODXL高表達(dá)與胰腺癌和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者總生存率顯著相關(guān)。YAO等[19]認(rèn)為PODXL在卵巢癌中過表達(dá)，BBOX1-AS1通過miR-1-1p/PODXL途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞生長，提示PODXL可作為卵巢癌治療的新潛在靶點(diǎn)。本研究中，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者血清PODXL高表達(dá)，與上述研究結(jié)果類似[19]，且其與危險(xiǎn)分層、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MLL基因重排、染色體核型、淋巴結(jié)腫大有關(guān)，表明高表達(dá)PODXL促進(jìn)了兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展。此外，有報(bào)道稱，PODXL還可作為多種癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物[17]。例如，外周血PODXL水平異常改變與胰腺癌的術(shù)后生存率密切相關(guān)[20]。本研究中PODXL高表達(dá)組的總生存率較低，說明PODXL高表達(dá)是影響兒童急性淋巴細(xì)胞白血病不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，與上述研究結(jié)果類似[21]。

YU等[21]報(bào)道，胃癌中PODXL過表達(dá)，且CTCF誘導(dǎo)的LINC01207激活通過調(diào)節(jié)miR-1301-3p / PODXL軸有助于胃癌進(jìn)展。本研究也發(fā)現(xiàn)血清miR-1301-3p和PODXL表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證二者具有靶向作用，說明在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展過程中二者間存在相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-1301-3p和PODXL聯(lián)合診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的AUC顯著大于兩者單獨(dú)診斷的AUC，表明二者聯(lián)合診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病具有更高的診斷價(jià)值，故miR-1301-3p和PODXL有望成為診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的新指標(biāo)。

綜上所述，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者血清miR-1301-3p表達(dá)下調(diào)、PODXL表達(dá)上調(diào)，二者與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者的危險(xiǎn)分層、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MLL基因重排、染色體核型、淋巴結(jié)腫大密切相關(guān)，是影響該病患者預(yù)后的重要因素，故miR-1301-3p和PODXL可作為診斷兒童急性淋巴細(xì)胞白血病并預(yù)測患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。但本研究未分析兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制與miR-1301-3p和PODXL的關(guān)系，需繼續(xù)展開相關(guān)研究對其進(jìn)行深入探索，以獲得更為明確的證據(jù)，為兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診治提供參考。