PCOS患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性與胰島素峰值后移的相關(guān)性研究

朱 琳，陳躍瑜，林延潤，楊發(fā)達(dá)（佛山市南海區(qū)婦幼保健院檢驗科,廣東佛山 528200）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡女性常見的內(nèi)分泌疾病，容易引發(fā)糖代謝異常，與胰島β細(xì)胞功能受損有關(guān)[1-2]，早期可表現(xiàn)出胰島素峰值后移[3-4]。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR）C677T基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病及多種糖尿病并發(fā)癥相關(guān)[5-7]，但與胰島素早期功能受損的相關(guān)性報道則較為少見。本研究旨在探討PCOS患者該基因多態(tài)性與胰島素峰值后移的相關(guān)性及其對胰島素早期功能的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2022年1月～2023年1月在佛山市南海區(qū)婦幼保健院就診的PCOS患者，入組前進(jìn)行知情同意告知并簽字確認(rèn)，且研究通過了本院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理文件編號：2022-01）。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[8]，排除標(biāo)準(zhǔn)：①由于甲狀腺功能障礙、高泌乳素血癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫欣綜合征等因素引起的排卵障礙；②糖尿病患者；③接受過改善胰島素藥物或降糖藥物治療的患者；④研究資料不完整。本課題共入組研究對象194例，2例因空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）異常剔除，1例因嘔吐未能按要求完成實驗室檢查剔除，最終納入研究對象191例。根據(jù) IRT 實驗結(jié)果分為后移組（n=65）和無后移組（n=126），兩組年齡、身高、體重比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，見表1。

表1 兩組的臨床資料比較（±s）

表1 兩組的臨床資料比較（±s）

類別無后移組（n=126）后移組（n=65）tP年齡(歲)25.83±3.6926.65±4.761.210.22體重（kg）52.28±10.9454.17±9.721.200.22身高(cm)156.83±4.98157.73±3.771.390.16

1.2 儀器與試劑 血清胰島素水平采用羅氏E601進(jìn)行檢測，羅氏原裝配套試劑盒；FPG采用AU5800進(jìn)行檢測，試劑為豪邁生物公司檢測試劑盒；MTHFR(C677T)基因型檢測采用上海百傲科技有限公司提供的試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：納入的研究對象空腹采集靜脈血10ml，無抗凝管、分離膠促凝管、EDTA-K2抗凝管各一支；采血后飲用糖水（含75g葡萄糖），并依次在30，60，120和180min四個時間點分別采集分離膠促凝靜脈血各一支（3ml），無抗凝標(biāo)本和分離膠促凝標(biāo)本靜置30min后離心（3 000r/min，10min）收集血清，EDTA-K2抗凝標(biāo)本用EP管分裝，-80℃保存待測。

1.3.2 標(biāo)本檢測：無抗凝標(biāo)本收集的血清用于FPG檢測，采用葡萄糖氧化酶法；分離膠促凝標(biāo)本收集的血清用于Fins和相應(yīng)時間點的血清胰島素水平（INS30，INS60，INS120，INS180）檢測，采用免疫發(fā)光法；EDTA-K2抗凝標(biāo)本先利用磁珠法提取DNA，再通過PCR芯片雜交法進(jìn)行MTHFR C677T基因型分型。各項目檢測均在同一檢測平臺完成，嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行檢測。

1.3.3 計算公式：ISI=1/[FPG(mmol/L)×Fins(IU/L)]；IRI=FPG(mmol/L)×Fins(IU/L)/22.5; AUC=0.25×Fins＋0.5×（INS30＋I(xiàn)NS180）+0.75×INS60＋I(xiàn)NS120[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS21.0分析軟件分析實驗數(shù)據(jù)，一般臨床資料、各項指標(biāo)先行Kolmogorov-Smirnov檢驗?；颊吣挲g、身高、體重、INS30以及AUC符合正態(tài)分布（P＞0.05），用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；其余各時間點胰島素水平、FPG，ISI和IRI均不符合正態(tài)分布（P＜0.05），用中位數(shù)（四分位間距）[M（P25，P75）]表示。基因型分布先進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗，若P＞0.05，則認(rèn)為基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，有群體代表性；基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，不同基因型多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 見表2。兩組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.90，2.30，P=0.14，0.32）,樣本具有群體代表性。

表2 基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2 基因型分布和等位基因頻率比較 見表3。與無后移組比較，后移組CT型、TT型占比更高，等位基因T的頻率高于無后移組；后移組與無后移組基因型和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.47，15.06，P=0.020，0.000）。

表3 基因型分布和等位基因頻率比較 [n(%)]

2.3 無后移組三種基因型各指標(biāo)比較 見表4。單因素方差分析顯示，無后移組三種基因型的Fins和IRI差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.569，5.928，P=0.002，0.003）；與CC型相比，CT型、TT型的Fins和IRI升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.66～2.93,P=0.004～0.009）；C向T位點突變，對無后移組Fins和IRI有影響。除此之外其余時間點的胰島素水平、AUC和FPG差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表4 無后移組三種基因型各指標(biāo)比較[±s或M（P25，P75）]

表4 無后移組三種基因型各指標(biāo)比較[±s或M（P25，P75）]

項 目CC基因型（n=77）CT基因型（n=38）TT基因型（n=11）FP Fins(IU/L)8.75(5.43,13.50)12.56(9.39,15.49)12.59(9.56，22.48)6.5690.002 INS30(IU/L)94.65±69.6784.15±41.2282.04±30.480.5080.603 INS60(IU/L)78.53(51.04，131.87)95.35(68.57，125.20)110.78(64.36，167.12)0.2710.763 INS120(IU/L)52.85(31.90，88.98)55.75(40.62，80.05)69.52(41.23，84.32)0.4520.637 INS180(IU/L)22.00(11.70，36.36)26.05(13.74，38.79)24.63(15.77，45.25)0.0740.929 ISI0.024(0.015，0.035)0.016(0.013，0.022)0.014(0.009，0.022)1.4720.234 IRI1.87(1.28，3.03)2.75(1.96，3.53)3.16(2.01，4.83)5.9280.003 AUC216.64±149.22195.02±73.61213.41±86.640.3770.687 FPG(mmol/L)4.95(4.69，5.22)4.98(4.67，5.18)5.03(4.70，5.25)0.8040.443

2.4 后移組三種基因型各指標(biāo)比較 見表5。單因素方差分析顯示，后移組三種基因型的Fins和ISI差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.827，3.559，P=0.027，0.034），相比于CC型，CT型和TT型的Fins升高，而ISI降低（t=2.11～2.51,P=0.015～0.039）。其余時間點的胰島素水平、AUC和FPG差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表5 后移組三種基因型各指標(biāo)的比較[ ±s或M（P25，P75）]

表5 后移組三種基因型各指標(biāo)的比較[ ±s或M（P25，P75）]

項 目CC基因型（n=24）CT基因型（n=26）TT基因型（n=15）FP Fins(IU/L)8.67(6.73，10.66)13.00(9.29,20.74)13.92(7.84，18.03)3.8270.027 INS30(IU/L)72.08±49.6072.29±62.8693.53±75.580.6930.504 INS60(IU/L)63.74(41.38，173.56)75.41(18.23，149.51)98.81(50.62，244.36)0.9410.396 INS120(IU/L)101.08(66.56，206.04)109.51(42.09，244.18)152.21(72.29，247.67)0.3630.696 INS180(IU/L)60.15(34.83，101.59)52.52(21.97，96.64)52.48(21.24，84.95)0.5860.560 ISI0.022(0.018，0.033)0.016(0.010，0.023)0.014(0.011，0.025)3.5590.034 IR2.04(1.38，2.49)2.91(2.01，4.50)3.16(1.77，3.99)2.7480.072 AUC295.29±197.45299.43±234.86360.61±257.030.4480.641 FPG(mmol/L)5.03(4.57，5.53)4.89(4.68，5.12)4.90(4.51，5.36)0.8670.425

3 討論

正常情況下，IRT峰值時間在30或60min，即胰島素峰值在第一分泌時相，在短時間高糖刺激下，機(jī)體能夠快速、有效地分泌足夠量的胰島素；若IRT峰值時間延遲到120或180min，即為胰島素峰值后移，提示第一分泌時相胰島素分泌不良，未能將血糖下降至合適水平，第二分泌時相持續(xù)高水平分泌胰島素以控制血糖水平。第一分泌時相分泌不良是β細(xì)胞功能受損的病理生理學(xué)特點，是糖耐量異常和餐后血糖異常升高的重要原因[10-11]。既往研究表明在發(fā)生峰值后移的人群中，即便是糖耐量正常，其胰島功能已經(jīng)處于早期受損階段，發(fā)展為2型糖尿病的風(fēng)險高[12]，因此探討胰島素峰值后移的影響因素，對糖代謝異常的早期防治有一定的臨床價值。

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T基因是位于染色體1p36.3的第677個核苷酸，其等位基因C可向T發(fā)生突變，產(chǎn)生三種基因型：突變純合型（TT）、突變雜合型（CT）以及野生型（CC）。王玲玲等[13]研究表明在妊娠糖尿病孕婦中等位基因T的頻率顯著高于正常孕婦組，而且MTHFR代謝過程中的中間產(chǎn)物同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平也同步升高，證明該位點突變導(dǎo)致Hcy水平升高是妊娠糖尿病發(fā)生的重要危險因素。本研究結(jié)果表明MTHFR C677T基因?qū)μ谴x異常的影響在早期階段就已經(jīng)存在，胰島素峰值后移組的基因型分布和T等位基因頻率與無后移組相比，CT型和TT型占比更高，等位基因T的頻率亦高于無后移組，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示該基因多態(tài)性對胰島素峰值后移有影響，T 等位基因可能是胰島素峰值后移的易感基因。

多囊卵巢綜合征（PCOS）患者無論是否發(fā)生胰島素峰值后移，三種基因型Fins單因素方差分析均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組CT型和TT型的Fins均高于CC型,MTHFR C677T基因C向T突變對Fins有影響，可使Fins升高。Fins異常是空腹血糖調(diào)節(jié)受損主要的病理機(jī)制，糖代謝異常患者Fins顯著高于正常人群，同時Fins升高也對PCOS患者病情控制不利，需要引起足夠的重視[14-15]。兩組組內(nèi)不同基因型之間比較，飲用糖水后的其他時間點血清胰島素水平，AUC和FPG差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，基因型不同對高糖刺激下單個時間點胰島素分泌量和IRT試驗全過程胰島素分泌總量并不影響，對FPG亦無影響。總體上看，MTHFR C677T基因位點突變可影響基礎(chǔ)胰島素水平，但對胰島素的反應(yīng)能力和胰島素分泌總量沒有影響，也尚未對FPG構(gòu)成影響。

在未發(fā)生胰島素峰值后移的PCOS患者中，CC型、CT型、TT型的患者IRI呈遞增趨勢，LSD-t檢驗 CT型、TT型與CC型比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，C向T突變使未發(fā)生峰值后移的PCOS患者胰島素抵抗程度增加。該位點突變可使MTHFR的活性及其耐熱性下降，葉酸攝入量不足時，Hcy水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗程度增加，血糖升高的風(fēng)險也隨之增加[16-18]。胰島素抵抗本身是PCOS重要的致病機(jī)理，50%～70%的PCOS患者存在胰島素抵抗[19]，由此可見MTHFR C677T基因位點突變會加劇PCOS患者的胰島素抵抗程度。KAO等[20]認(rèn)為胰島素抵抗是糖代謝異常的影響因素，胰島素抵抗使胰島素對機(jī)體組織的生物學(xué)作用減弱,胰島β細(xì)胞代償性地產(chǎn)生更多的胰島素以維持血糖正常,長時間代償導(dǎo)致糖代謝異常。但在峰值后移的患者中，不同基因型IRI的差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義。本課題組前期研究表明發(fā)生胰島素峰值后移的PCOS患者IRI比無后移的患者明顯增高[20]，因此并非胰島素后移的患者不存在胰島素抵抗，而是發(fā)展到峰值后移階段，IRI普遍增高，不同基因型之間的差異不明顯?？偟膩碚f，對于未發(fā)生胰島素峰值后移PCOS患者來說，MTHFR C677T基因C向T突變使胰島素抵抗程度增高。

在已發(fā)生胰島素峰值后移的PCOS患者中，不同基因型的患者ISI差異有統(tǒng)計學(xué)意義，從CC型到CT型，再到TT型，ISI呈遞減趨勢，胰島素敏感性隨C向T突變，逐漸降低。ISI是反映了機(jī)體靶器官吸收和利用葡萄糖能力的指標(biāo)，ISI降低提示機(jī)體對胰島素敏感性下降，胰島素相對不足，糖的攝取和利用減少，也是血糖升高的關(guān)鍵因素之一。胰島β細(xì)胞是根據(jù)胰島素敏感性來調(diào)整胰島素的分泌，胰島素敏感性下降時分泌增加，胰島素敏感性增強時分泌減少，動態(tài)調(diào)整以維持血糖穩(wěn)定，當(dāng)這種動態(tài)平衡被破壞時，便可發(fā)展為糖尿病前期甚至是糖尿病。既往研究表明，胰島素敏感性逐漸減退與糖代謝異常臨床表現(xiàn)加重趨勢相符[21]，因此C向T位點突變，可能通過影響機(jī)體胰島素敏感性，增加糖代謝異常的風(fēng)險。在未發(fā)生峰值后移的患者中，不同基因型ISI差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，疾病發(fā)展的不同階段影響因素可有不同，胰島素敏感性的改變要晚于胰島素抵抗[22]，推測胰島素敏感性改變在胰島素峰值后移階段對PCOS患者影響更大，需重視評估峰值后移的PCOS患者ISI，尤其是合并有MTHFR C677T基因突變患者的敏感性可能更低。

綜上，PCOS患者M(jìn)THFR C677T基因位點多態(tài)性與胰島素峰值后移有關(guān)，基因突變患者Fins升高。在未發(fā)生峰值后移的患者中，基因突變者抵抗程度增加；而在峰值后移的患者中，基因突變者胰島素敏感性降低。胰島素抵抗和高胰島素血癥是糖尿病的始動因素[23]，MTHFR C677T基因位點C向T突變，可使基礎(chǔ)胰島素升高，而在不同時期的胰島素抵抗程度增加或者敏感性降低，都可能使胰島素功能降低。當(dāng)然本研究也有一定局限性：①兩個分組TT基因型樣本量略少，且研究對象主要集中在佛山地區(qū)，MTHFR C677T基因位點多態(tài)性有地域上的差異。②本研究僅從探討MTHFR C677T基因?qū)σ葝u素峰值后移的影響，應(yīng)當(dāng)看到疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，仍需綜合更多影響因素做進(jìn)一步研究。