PAI-1基因多態(tài)性與血小板聚集率交互作用對(duì)下肢深靜脈血栓形成的影響

張建軍，靳志雄，胡常暉，黃秀萍

（張家口市第一醫(yī)院a.急診科；b.普外一科；c.腎內(nèi)科，河北張家口 075000）

下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）形成是一種常見的血管疾病，典型癥狀包括疼痛、腫脹、發(fā)紅和水腫等[1-2]。DVT的治療包括藥物療法和物理療法，未經(jīng)治療的DVT可能誘發(fā)肺栓塞，甚至?xí)＜吧黐3-4]。盡管其發(fā)病率相對(duì)較高，但我們對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解仍不充分。DVT患者主要表現(xiàn)為凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)之間的功能失衡。纖溶酶原激活物抑制劑1型（plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1）是一種重要的調(diào)節(jié)劑，通過抑制纖維蛋白溶解激活劑組織型纖溶酶原激活劑（tissue type plasminogen activator，tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）在溶解血栓中發(fā)揮作用，其不僅抑制血管中的纖維蛋白溶解，而且還參與細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)節(jié)[5]。血小板聚集率是DVT的重要表達(dá)部分，當(dāng)循環(huán)血小板在某些病理情況下遇到細(xì)胞外基質(zhì)成分時(shí)，就會(huì)發(fā)生血小板活化和凝血酶生成[6]。PAI-1基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）對(duì)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響，從而影響下肢DVT的易感性。目前關(guān)于PAI-1基因多態(tài)性與血小板聚集率交互作用對(duì)下肢DVT的影響的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探討PAI-1基因多態(tài)性與血小板聚集率交互作用對(duì)下肢DVT影響的機(jī)制，以便在臨床早期診斷中提供理論依據(jù)及為臨床治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2020年2月～2023年2月于張家口市第一醫(yī)院就診的下肢DVT患者80例為觀察組，另選80例健康者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組均符合下肢DVT的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組均為健康者；②患者的病歷完整，可用于數(shù)據(jù)分析；③自愿參加本研究及同意簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①受試者臨床資料不全；②正服用溶栓類藥物的患者；③其他明確的免疫系統(tǒng)疾病，如強(qiáng)直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡；④血液流變性疾病，如骨髓瘤、血友病、瓦爾登斯特倫病、真性紅細(xì)胞增多癥。兩組在性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、惡性腫瘤史、心血管疾病史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t/χ2=0.069～0.865，均P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 人纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），DNA快速提取試劑盒（徐州賽恩生物試劑有限公司），ADP試劑（美國biopool公司），TYXN-91智能血液聚集儀（上海通用醫(yī)用儀器公司），ABI7500 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀（美國ABI公司），JY600+電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），JS-780A全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：清晨抽取患者入組時(shí)空腹靜脈血8 ml，其中3 ml枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min離心15 min分離血漿，PAI-1水平通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行操作；另外2 ml枸櫞酸鈉抗凝，在4℃下以700 g離心15 min抽取上部血漿制備貧血小板血漿，在4℃下以700 g離心10 min抽取上部血漿制備富血小板血漿，ADP試劑作為誘導(dǎo)劑使用TYXN-91智能血液聚集儀檢測(cè)血小板聚集率。剩下的3 ml放置于無菌EDTA管抗凝，上下顛倒充分混勻，-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜赑AI-1 4G/5G位點(diǎn)SNP分析。

1.3.2 收集患者一般資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：包括血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、三酰甘油（triglycerides，TG）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、低密度脂蛋白-膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1,apoA1）和載脂蛋白B(apolipoprotein B1,apoB1)水平。

1.3.3 PAI-1 4G/5G位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)：采用DNA提取試劑提取基因組DNA，并檢測(cè)其濃度和純度，將A260nm/A280nm比值在1.7～1.9范圍內(nèi)的DNA樣本保存?zhèn)溆糜?20℃冰箱內(nèi)?；螯c(diǎn)位篩選依照基因分型結(jié)果，通過Haploview 4.3軟件，依照r2≥0.8，且最小等位基因頻率＞0.1標(biāo)準(zhǔn)，選取PAI-1 4G/5G基因標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。利用PCR擴(kuò)增目的基因。引物序列如下：PAI-1u：5’-AAGCTTTTACC ATGGTAACCCCTGGT-3’；PAI-2d：5’-TGCAGCCA GCCACGTGATTGTCTAG-3’；PAI-5G：5’-GTCTGG ACACGTGGGGG-3’；PAI-4G：5’-GTCTGGA CACGTGGGGA-3’。反應(yīng)體系：100 ng基因組DNA，14μl 4×PCR緩沖液，30 mmol /L MgCl2，10 μmol/L引物，1.10 U Tag酶（天根公司，北京）。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 min，65℃ 10 min，63℃ 23 min，72℃ 23 min，啟動(dòng)PCR反應(yīng)。將4G （139 bp）和5G（140 bp）特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與257 bp對(duì)照條帶在溴化乙啶染色的2g/dl瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。通過酶切反應(yīng)可知PAI-1存在三種基因型：野生4G4G，雜合突變4G5G和純合突變5G5G。15g/L瓊脂糖凝膠電泳：180V 20min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過ABI 3500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，并與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，采用Sequencing Analysis 5.4版軟件進(jìn)行基因突變結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件數(shù)據(jù)分析。使用百分比（%）描述計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)；使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)：通過Hardy-Weinberg檢驗(yàn)遺傳平衡（P＞0.05為符合）；采用多因素Logistics回歸分析DVT的影響變量P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過交互作用系數(shù)γ分析血小板聚集率與PAI-1 4G/5G位點(diǎn)基因多態(tài)性的交互作用。

2 結(jié)果

2.1 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 見表1。與對(duì)照組比較，觀察組患者的血小板計(jì)數(shù)水平降低；D-二聚體、PAI-1，臥床時(shí)間、血小板聚集率水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 觀察組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較（±s）

表1 觀察組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較（±s）

項(xiàng)目觀察組（n=80）對(duì)照組（n=80）tP TG（mmol/L）1.71±0.641.52±0.981.4520.148 TC（mmol/L）4.52±0.834.45±0.890.5140.608 HDL-C（mmol/L）1.38±0.351.32±0.341.1000.273 LDL-C（mmol/L）2.44±0.672.26±0.631.7510.082載脂蛋白A1（g/L）1.26±0.231.22±0.241.0760.283載脂蛋白B（g/L）0.97±0.200.95±0.210.6170.538 PT（s）11.45±0.8711.32±1.020.8670.387 APTT（s）25.26±3.1425.54±4.130.4830.630 TT（s）17.51±1.7317.38±1.740.4740.636 D-二聚體（mg/L）0.96±1.270.45±1.262.5500.012 PAI-1（mg/ml）33.26±10.1215.14±8.5612.227＜0.001血小板計(jì)數(shù)（×1012/L）189.56±51.27209.16±71.911.9850.049血小板聚集率（%）55.25±15.5635.75±16.237.757＜0.001臥床時(shí)間（h）4.12±1.202.32±0.7811.249＜0.001

2.2 PAI-1基因多態(tài)性分析和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 野生型4G4G純合子的終產(chǎn)物為139 bp一條帶，變異型5G5G純合子的終產(chǎn)物為257bp和140bp兩條帶，雜合子4G5G的終產(chǎn)物為139 bp，140 bp和257 bp三條帶。測(cè)序結(jié)果用Sequencing Analysis 5.4版軟件進(jìn)行對(duì)比，共發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，PAI-1 4G/5G基因一致性為100%。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，PAI-1 4G/5G各基因型分布符合要求（P＞0.05），這提示納入樣本具有代表性。

2.3 兩組PAI-1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較 觀察組PAI-1 4G/5G基因型4G4G，4G5G，5G5G基因頻率分別為41.25%，47.50%和11.25%，對(duì)照組分別為12.50%，67.50%和20.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.045，P＜0.001）。觀察組PAI-1 4G/5G等位基因4G，5G頻率分別為65.00%和35.00%，對(duì)照組分別為46.25%和53.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.394，P＜0.001）。

2.4 觀察組不同基因型患者血小板聚集率比較 與5G5G基因型患者相比，基因型4G5G，4G4G患者的血小板聚集率依次升高（35.25%±12.55% vs 45.78%±13.45%，56.48%±15.26%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.297，P＜0.001）。

2.5 PAI-1位點(diǎn)基因多態(tài)性和血小板聚集率與下肢DVT易感性的關(guān)系 見表2。以是否發(fā)生下肢DVT作為因變量（否=0，是=1），將PAI-1 4G/5G位點(diǎn)基因型、等位基因頻率、血小板聚集率作為自變量，Logistic回歸分析顯示，PAI-1 4G/5G位點(diǎn)基因型4G4G（OR=5.347，95%CI：1.797～18.124）、攜帶等位基因4G（OR=4.345，95%CI：1.805～16.252）和血小板聚集率（OR=5.647，95%CI：1.845～22.148）是下肢DVT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。

表2 PAI-1 4G/5G位點(diǎn)基因多態(tài)性與下肢DVT易感性的關(guān)系

2.6 PAI-1基因多態(tài)性與血小板聚集率的交互作用 見表3。PAI-1 4G/5G位點(diǎn)基因型4G4G單獨(dú)所致下肢DVT易感性的OR為7.785，血小板聚集率所致下肢DVT易感性的OR為6.715；二者同時(shí)存在時(shí)，交互作用OR為22.324，γ為1.681，提示在下肢DVT易感性中呈正向交互作用（3.135＜1.864×2.024，為次相乘模型）。

表3 PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性與血小板聚集率的交互作用

3 討論

下肢深靜脈血栓（DVT）形成是一種在下肢深靜脈中形成血凝塊的疾病，造成血流受阻，引起患肢腫脹、局部疼痛和靜脈曲張，還可能導(dǎo)致肺栓塞，是繼心臟病發(fā)作和中風(fēng)后心血管疾病死亡的第三大常見原因[7]。睡眠和靜臥期間，血流速度變慢，血流淤積，加上人體脆弱的血管壁，容易發(fā)生DVT[8-9]。在外科手術(shù)后的患者中，發(fā)生DVT的風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較高。對(duì)于疑似DVT患者，建議結(jié)合臨床驗(yàn)前概率評(píng)估、D-二聚體檢測(cè)和影像學(xué)檢查進(jìn)行診斷[10]。鑒于遺傳因素在疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，SNP已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[11]。目前研究PAI-1基因多態(tài)性與血小板聚集率交互作用對(duì)下肢DVT影響的文章鮮有報(bào)道。因此，本研究探討DVT患者有關(guān)影響因素及PAI-1基因多態(tài)性，旨為DVT早期診斷、治療及發(fā)病機(jī)制的研究提供實(shí)際的理論依據(jù)。

當(dāng)有DVT時(shí)，纖維蛋白會(huì)分解，產(chǎn)生D-二聚體[12]。因此，高水平的D-二聚體可以提示DVT的存在。除此之外，血小板計(jì)數(shù)水平是檢測(cè)DVT的重要指標(biāo)之一。DVT患者的血小板計(jì)數(shù)水平通常會(huì)降低，當(dāng)發(fā)生DVT時(shí)，血小板會(huì)聚集在血栓上，導(dǎo)致血小板數(shù)量減少。目前研究表明，血小板聚集率與多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，如DVT，冠心病、腦卒中、高血壓等。因此，研究血小板聚集率對(duì)于這些疾病的早期診斷及治療具有重要意義。血小板聚集率是指血小板在接觸到損傷的血管壁時(shí)，通過細(xì)胞膜上的黏附蛋白和受體，發(fā)生黏附、聚集并產(chǎn)生黏附介質(zhì)的過程。血小板聚集率還與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)，血小板聚集率的升高反映了體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，導(dǎo)致DVT疾病的發(fā)生。

纖溶酶原激活物抑制劑1型（PAI-1）位于染色體7q上，編碼含有402個(gè)氨基酸的分泌蛋白，一種抑制纖維蛋白溶解的蛋白質(zhì)，DVT時(shí)PAI-1水平會(huì)增加，抑制纖維蛋白溶解，從而增加血栓的穩(wěn)定性。臥床時(shí)間長也是引起DVT的重要因素，長期臥床或長時(shí)間靜止會(huì)導(dǎo)致血液循環(huán)不暢，容易發(fā)生DVT疾病[13-14]。PAI-1基因在人類體內(nèi)的表達(dá)也受到許多因素的調(diào)節(jié)，如生長激素、胰島素、細(xì)胞凋亡因子和炎性介質(zhì)等。過去幾十年中，關(guān)于PAI-1基因的研究涉及到了其在許多疾病中的作用，如心血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病和肝病等，其中研究的深入程度和成果也在逐步加深。作為組織型和尿激酶型纖溶酶原激活劑的主要抑制劑，PAI-1是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的組成部分[15]。異常升高的PAI-1會(huì)損害纖溶酶原的活化，導(dǎo)致血管中纖維蛋白過度積累，從而進(jìn)一步導(dǎo)致DVT。纖維蛋白原，稱為凝血因子I，是一種由肝臟合成的急性期蛋白質(zhì)。它在凝血酶的作用下被激活成纖維蛋白，在身體的凝血過程中是必不可少的。纖維蛋白原升高會(huì)增加血液粘度，促進(jìn)血小板聚集，并加重DVT[16]。

本研究結(jié)果顯示，PAI-1基因4G/5G位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示所選樣本具有代表性。DVT與年齡、損傷機(jī)制、ASA評(píng)分、機(jī)械通氣、CRP，血小板計(jì)數(shù)、D-二聚體、多發(fā)性損傷、延長住院時(shí)間以及從受傷到手術(shù)的時(shí)間超過2周有關(guān)[17]。血小板也是血栓形成的關(guān)鍵因素。血小板可參與血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及纖維蛋白的形成，從而導(dǎo)致血栓形成。血小板消耗抗體可降低血漿中促炎細(xì)胞因子的水平，輸注血小板可恢復(fù)細(xì)胞因子水平。血小板黏附之后立即出現(xiàn)血小板活化、顆粒分泌、聚集和血漿凝血[18-19]。由于其抗黏附性，血小板在內(nèi)皮附近循環(huán)而不會(huì)形成任何穩(wěn)定的黏附接觸。然而，在某些生理病理情況下，它們變得異常多動(dòng)[20]并導(dǎo)致血管內(nèi)形成凝塊，導(dǎo)致DVT并增加心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率。血小板聚集率水平升高是因?yàn)樵贒VT過程中，血小板會(huì)聚集并黏附在已有的血小板上，形成DVT。因此，血小板聚集率水平的升高可以提示DVT的存在。纖維蛋白溶解系統(tǒng)的損傷在血栓性疾病的進(jìn)展中起著重要的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因4G4G位點(diǎn)基因型和攜帶等位基因4G，以及血小板聚集率，都是下肢DVT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中4G4G基因型的風(fēng)險(xiǎn)比最大。在下肢DVT的形成過程中，血小板可以促進(jìn)凝血過程，并在血管內(nèi)壁損傷后黏附聚集，形成DVT。因此，高血小板聚集可能會(huì)增加下肢DVT的風(fēng)險(xiǎn)。在PAI-1基因多態(tài)性中，4G4G基因型和攜帶等位基因4G可以影響PAI-1基因的表達(dá)，從而影響凝血和纖溶功能的平衡。另一方面，其遺傳多態(tài)性在血栓性疾病中的作用越來越受到關(guān)注。研究表明，PAI-1基因多態(tài)性(4G4G型)是心血管疾病和深靜脈血栓形成的患病風(fēng)險(xiǎn)因素之一，這是因?yàn)檫^多的PAI-1會(huì)抑制纖溶酶原激活劑的活性，從而導(dǎo)致血栓形成。PAI-1基因多態(tài)性(4G4G型)是指PAI-1基因第7內(nèi)含子中含有4個(gè)鳥嘌呤和4個(gè)胞嘧啶，這種基因型表現(xiàn)為PAI-1蛋白的合成量和釋放量增加，因而增加了血液中PAI-1的水平。最近的一項(xiàng)meta分析顯示，PAI-1 4G/5G多態(tài)性與DVT風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，尤其是在亞洲人群中[21]。

交互作用是一種臨床疾病評(píng)估常用的方法，通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)間的交互作用進(jìn)行定量分析。以往的研究發(fā)現(xiàn)[22]，血小板聚集率與多種基因位點(diǎn)的多態(tài)性之間存在協(xié)同交互作用。目前對(duì)于PAI-1基因4G/5G多態(tài)性與血小板聚集率在DVT中的交互作用還沒有被深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1（4G4G）基因型和血小板聚集率之間存在正向交互作用，顯著增加了DVT發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。血小板聚集率和PAI-1（4G4G）型對(duì)DVT的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有相互顯著放大效應(yīng)，這提示PAI-1的4G等位基因?yàn)镈VT的危險(xiǎn)基因，攜帶PAI-1（4G4G）基因型者血小板聚集率越高危害效應(yīng)越大。因此，本研究猜想由于血小板聚集率異常，提示DVT患者的血小板水平控制不佳，為DVT的發(fā)生創(chuàng)造了條件。而攜帶PAI-1（4G4G）的患者體內(nèi)激素水平紊亂，增加DVT的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本文局限性：本研究所納入樣本數(shù)量較少，血栓形成的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響的因素也很多，本研究未完全納入，樣本選擇受制于地區(qū)、例數(shù)、人群，需進(jìn)一步擴(kuò)大地區(qū)、擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實(shí)PAI-1基因突變與血小板聚集率的交互作用與DVT的關(guān)系。對(duì)此，我們將在未來研究中進(jìn)一步證實(shí)本研究的分析結(jié)果。

綜上所述，DVT的高危人群均攜帶PAI-1（4G4G）基因型。PAI-1（4G4G）基因型與血小板聚集率的交互作用增加了DVT的發(fā)病和發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)。臨床可以通過控制血小板聚集率和基因調(diào)控來預(yù)防DVT的發(fā)生。