系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者ANA免疫熒光核型分布及其與病情發(fā)展的相關(guān)性研究

王 嬌，杜利君，趙 佳，張 兵（四川省南充市中心醫(yī)院檢驗科，四川南充 637000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）屬于一種由多種因素所致的自身免疫性疾病，常累及全身多系統(tǒng)、多器官。據(jù)統(tǒng)計，全世界的患病率大概是4/10萬～25/10萬，發(fā)病率逐年升高，目前雖然有關(guān)SLE的具體發(fā)病機制尚不完全明確，但有部分研究證實[1-3]，此病的發(fā)生與免疫異常、自身抗體產(chǎn)生有關(guān)。臨床研究認(rèn)為[4]，SLE發(fā)生后機體免疫失衡，吞噬細(xì)胞無法吞噬源自染色體的核酸，從而導(dǎo)致自身抗體異常生成，促進(jìn)疾病發(fā)展，其中以抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）最為常見。ANA是一組針對細(xì)胞核內(nèi)的DNA，RNA，蛋白質(zhì)或這些物質(zhì)的分子復(fù)合物而產(chǎn)生的抗體，在SLE臟器、組織損傷中具有重要的促進(jìn)作用[5]。根據(jù)臨床現(xiàn)有文獻(xiàn)已經(jīng)證實ANA與SLE有關(guān)，但鮮少有報道將ANA及免疫熒光核型分布用于病情發(fā)展的評估，鑒于此，為彌補ANA在SLE病情發(fā)展中的研究空缺及提高臨床對SLE病情發(fā)展的早期診斷，以我院收治的SLE患者為研究對象，在ANA與SLE有關(guān)的結(jié)論基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討ANA陽性率及免疫熒光核型是否與患者病情發(fā)展有關(guān)，以期望為臨床上SLE病情發(fā)展的研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年8月～2022年8月四川省南充市中心醫(yī)院收治的SLE患者300例作為SLE組，其中男性63例，女性237例，年齡23～61（43.25±5.50）歲，病程1.0～10（5.76±0.98）年，疾病活動評分（SLEDAI）2～22（15.11±2.88）分；臨床表現(xiàn)：紅斑69例，光過敏32例，口腔潰瘍70例，關(guān)節(jié)炎78例，漿膜炎45例，腎臟病變38例，血液學(xué)疾病59例，免疫學(xué)異常64例。選取同期我院收治的非SLE的其他自身免疫性疾病患者50例作為非SLE組，其中男性13例，女性37例，年齡22～61（43.11±4.89）歲；混合型結(jié)締組織病10例，舍格倫綜合征13例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎27例；另外選我院體檢的健康人50例作為健康對照組，其中男性14例，女性37例，年齡23～62（43.41±4.94）歲。三組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.606,P=0.448;F=0.039,P=0.962），具有可比性，三組均知情并同意參與此研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①SLE組符合SLE診療指南[6]中關(guān)于SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合以下4項或4項以上即可診斷，⑴峽部紅斑；⑵盤狀紅斑；⑶光過敏，對日光有明顯反應(yīng)，引起皮疹；⑷口腔潰瘍；⑸非侵蝕性關(guān)節(jié)炎，累及兩個或更多的外周關(guān)節(jié)；⑹漿膜炎（胸膜炎或心包炎）；⑺腎臟病變（尿蛋白＞0.5g/24h或管型）；⑻神經(jīng)病變（癲癇發(fā)作或精神病）；⑼血液學(xué)疾?。ò准?xì)胞減少、淋巴細(xì)胞減少或血小板減少、溶血性貧血）；⑽免疫學(xué)異常。②非SLE組患者均經(jīng)臨床確診。③健康對照組各項檢查均正常，身體健康。④年齡≥18歲。⑤自愿參與。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝功能、腎功能嚴(yán)重衰竭者；②并發(fā)局部感染或全身無法控制的感染疾病者；③妊娠或哺乳婦女；④良惡性腫瘤者；⑤代謝嚴(yán)重紊亂者。

1.2 儀器與試劑 Lminex?儀器（Bio-Techne Corporation公司），ANA譜檢測試劑盒（宙斯科技公司），ANA試劑盒[歐蒙（德國）醫(yī)學(xué)診斷實驗公司]。

1.3 方法

1.3.1 ANA陽性率及ANA免疫熒光核型檢測：采集所有研究對象3ml空腹靜脈血，在3 500r/min下離心分離出血清，放置于-20℃下保存?zhèn)溆?。①采用多重微珠流式免疫熒光發(fā)光法檢測血清ANA陽性表達(dá)情況，嚴(yán)格按照宙斯科技公司AtheNA Multi-LyteTM抗核抗體譜檢測試劑盒操作說明于Lminex?儀器上測定，ANA≥100AU/ml定義為陽性。②采用間接免疫熒光（indirect immunofluorescence，IIF）法檢測ANA免疫熒光核型，反應(yīng)板內(nèi)加25μl血清，與人喉表皮樣癌細(xì)胞（human laryngeal epidermoid cancer cells，Hep-2）、猴肝片反應(yīng)30min，加入20μl異硫氰酸熒光素結(jié)合的抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），在顯微鏡下觀察Hep-2核熒光染色情況，報告ANA免疫熒光核型。

1.3.2 疾病活動指數(shù)評價：使用系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)（systematic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評分評價疾病活動情況，共24項，得分范圍為0～105分，SLEDAI≥5分定義為疾病處于活動期，＜5分定義為疾病未處于活動期，根據(jù)患者疾病進(jìn)展情況分為SLE活動組（n=111）、SLE非活動組（n=189）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件作為數(shù)據(jù)分析工具。計量資料服從正態(tài)分布并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用多因素Logistic回歸分析影響SLE患者病情發(fā)展的危險因素；采用Spearman檢驗分析ANA與SLE患者病情發(fā)展的相關(guān)性；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析ANA及Logistic回歸模型預(yù)測活動性SLE的價值。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組ANA陽性表達(dá)率及SLE患者ANA免疫熒光核型分析 SLE組ANA陽性率為96.00%（288/300），高于非SLE組[56.00%（28/50）]和健康對照組[4.00%（2/50）]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=78.184，P＜0.05）。288例ANA陽性SLE患者免疫熒光核型包括核顆粒型[60.07%（173/288）]、核均質(zhì)型[31.94%（92/288）]、胞漿顆粒型[3.47%（10/288）]、核仁型[2.78%（8/288）]和著絲點型[1.74%（5/288）]，以核顆粒型最為多見，其次為核均質(zhì)型。

2.2 ANA與SLE患者臨床特征、病情發(fā)展的關(guān)系 關(guān)節(jié)炎陽性、SLE活動期患者ANA陽性率高于關(guān)節(jié)炎陰性、SLE非活動期患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），與其余特征資料無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。根據(jù)SLE患者病情發(fā)展情況分為SLE非活動組和SLE活動組，分析兩組ANA免疫熒光核型發(fā)現(xiàn)，與SLE非活動組比較，SLE活動組核顆粒型比例升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組ANA免疫熒光核型核均質(zhì)型、胞漿顆粒型、核仁型、著絲點型對比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 ANA與SLE患者臨床特征、病情發(fā)展的關(guān)系[n（%）]

表2 SLE非活動組、SLE活動組ANA免疫熒光核型比較[n（%）]

2.3 SLE非活動組、SLE活動組SLE患者臨床資料對比 見表3。SLE活動組腎臟病變占比、SLEDAI評分、IgA，IgM和IgG水平均高于SLE非活動組，C3，C4水平均低于SLE非活動組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 SLE非活動組、SLE活動組SLE患者臨床資料對比[（±s），n（%）]

表3 SLE非活動組、SLE活動組SLE患者臨床資料對比[（±s），n（%）]

類 別SLE非活動組（n=189）SLE活動組（n=111）t/χ2P性別（男/女）39/15024/870.0410.839年齡（歲）43.29±5.5843.20±5.370.1330.894病程（年）5.79±0.975.72±1.000.5750.565 SLEDAI評分（分）2.10±0.4315.64±3.4253.8190.001 IgA（mg/L）1.98±0.234.98±0.7650.1090.001 IgM（mg/L）1.03±0.123.00±0.2396.7510.001 IgG（mg/L）13.42±2.5120.08±4.5316.3980.001 C3（mg/L）1.15±0.210.60±0.0925.9910.001 C4（mg/L）0.49±0.100.20±0.0527.7250.001臨床表現(xiàn) 紅斑46（24.34）23（20.72）0.5170.472光過敏20（10.58）12（10.81）0.0040.951口腔潰瘍45（23.81）25（22.52）0.0650.799關(guān)節(jié)炎50（26.46）28（25.23）0.0550.815漿膜炎25（13.23）20（18.02）1.2590.262腎臟病變40（21.16）43（38.74）10.7930.001神經(jīng)病變23（12.17）19（17.12）1.4220.233血液學(xué)疾病39（20.63）20（18.02）0.3030.582免疫學(xué)異常37（19.58）27（23.32）0.9390.332

2.4 影響SLE患者病情發(fā)展的因素及ANA與SLE患者病情發(fā)展的相關(guān)性分析 以SLE患者病情發(fā)展?fàn)顩r作為因變量，病情活動=1，非活動=0，將表2，表3篩選有意義的變量作為自變量，行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，ANA陽性、ANA核顆粒型、SLEDAI評分、IgA，IgM，IgG，C3，C4和腎臟病變等均是影響SLE患者病情發(fā)展的獨立危險因素。見表4。進(jìn)一步分析ANA與SLE患者病情發(fā)展的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，ANA與SLE患者病情發(fā)展呈正相關(guān)（r=0.309，P＜0.05）。見圖1。

圖1 ANA與SLE患者病情發(fā)展的相關(guān)性

表4 SLE患者病情發(fā)展的因素分析

2.5 ANA及Logistic回歸模型預(yù)測活動性SLE的價值分析 針對Logistic回歸分析所獲得的因素，建立預(yù)測模型，即Logit（P）=1.854×（ANA陽性）+1.872×（ANA核顆粒型）+1.278×（SLEDAI評分）+1.651×（IgA）+1.795×（IgM）+1.885×（IgG）+1.684×（C3）+1.463×（C4）+1.221×（腎臟病變）-10.797。經(jīng)ROC曲線分析顯示，相比單獨使用ANA，由Logistic回歸分析結(jié)果所獲得的預(yù)測模型對活動性SLE的預(yù)測價值更高（曲線下面積=0.895，95%CI：0.800～0.943，P＜0.05）。見表5，圖2。

圖2 ANA及Logistic回歸模型預(yù)測活動性SLE的ROC曲線

表5 ANA及Logistic回歸模型預(yù)測活動性SLE的效能分析

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)生與免疫系統(tǒng)紊亂相關(guān)，目前世界范圍內(nèi)SLE的發(fā)病率逐年升高，既往研究發(fā)現(xiàn)，SLE起病緩慢，早期僅表現(xiàn)為關(guān)節(jié)痛、皮疹，無明顯組織器官損傷，但隨著病情的進(jìn)展，患者逐漸從原有的關(guān)節(jié)痛、皮疹轉(zhuǎn)變?yōu)槔钳從I病、中樞神經(jīng)損傷，甚至狼瘡危象，嚴(yán)重威脅著患者生命安全[7-9]。就目前研究發(fā)現(xiàn)[10]，SLE患者病情發(fā)展可從多個方面綜合評估，一方面從疾病活動度，反映了臟器的急性可逆性損傷，另一方面可從臟器、組織受累損傷情況以評估。雖然SLE目前無法治愈，但臨床可通過早期預(yù)測患者病情發(fā)展?fàn)顩r，制定針對性的措施，以控制病情惡化，因此早期評估病情發(fā)展對改善患者預(yù)后具有重要的意義。

由于SLE自然病程多表現(xiàn)為病情加重與緩解交替，僅根據(jù)患者臨床表現(xiàn)難以早期診斷，需借助生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行診斷，既往研究顯示[11]，SLE患者血清中存在較多的自身抗體，這些抗體與自身抗體結(jié)合后形成大量的免疫復(fù)合物，從而激活補體系統(tǒng)，進(jìn)而形成炎癥損傷，加速病情發(fā)展。ANA是一組細(xì)胞核內(nèi)DNA，RNA及蛋白等分子復(fù)合體所產(chǎn)生的自身抗體類型，主要存在于IgG內(nèi)，可識別細(xì)胞核組分，在多種自身免疫性疾病患者中均可檢出ANA[12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，SLE患者多存在以ANA陽性為表象的自身免疫功能紊亂表現(xiàn)，表明ANA可能參與SLE發(fā)病，可能與DNA損傷、細(xì)胞凋亡壞死、氧化應(yīng)激有關(guān)。在本研究中比較SLE組、非SLE組及健康對照組ANA陽性表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非SLE患者、健康人比較，SLE患者血清ANA陽性率顯著升高，此結(jié)果與鄒紅云等[14]研究結(jié)果相似，此結(jié)果說明ANA與SLE關(guān)系密切，證實了ANA在SLE中的廣泛表達(dá)，分析其原因可能為SLE中DNA損傷、細(xì)胞凋亡壞死、氧化應(yīng)激等病理改變所致。另外研究顯示[15]，SLE的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且伴隨著多器官系統(tǒng)損害，其中以腎臟損害最為常見。鑒于此，本研究進(jìn)一步分析ANA在SLE患者不同臨床特征中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，存在關(guān)節(jié)炎的患者ANA陽性率明顯高于無關(guān)節(jié)炎患者，但存在腎臟損害的患者雖然ANA有所升高，但升高并不顯著，此結(jié)果提示著，雖然SLE患者存在多器官系統(tǒng)損害，有關(guān)節(jié)炎的患者ANA陽性顯著升高，但與腎臟損害無明顯相關(guān)，我們推測可能與本研究所納入樣本量較少有關(guān)，后續(xù)還需擴大樣本量進(jìn)一步分析。另外本研究根據(jù)SLE病情發(fā)展情況，分為SLE非活動期和SLE活動期，分析ANA與患者病情發(fā)展的關(guān)系，結(jié)果顯示，處于SLE活動期的患者ANA陽性率顯著升高，此結(jié)果提示著，ANA可能參與SLE病情發(fā)展，但本研究尚未深入分析其具體機制，推測可能為SLE病情發(fā)展過程中，機體DNA損傷加劇，從而導(dǎo)致ANA陽性率升高。

目前隨著臨床上對SLE的深入研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，當(dāng)病情發(fā)展時，患者免疫抑制現(xiàn)象加重，T細(xì)胞失調(diào)加劇，導(dǎo)致大量ANA產(chǎn)生，進(jìn)而增加免疫復(fù)合物沉積量，損傷器官。劉衛(wèi)霞等[18]在其研究中發(fā)現(xiàn)，ANA熒光核型分析有利于SLE的診斷和治療。報道顯示[19]，ANA的靶抗原成分較多，如細(xì)胞骨架、胞核、胞漿等，核顆粒型與SLE患者疾病活動存在一定的關(guān)聯(lián)，核顆粒型更加趨向于癥狀緩解。另外ANA免疫熒光核型核均質(zhì)型所對應(yīng)的靶抗原主要為核小體、組蛋白、DNA等細(xì)胞核成分，而在SLE發(fā)生后細(xì)胞凋亡加劇，大量核小體活性增加，髓系樹突狀細(xì)胞以自身抗原形成呈遞，此時T細(xì)胞經(jīng)激活B細(xì)胞產(chǎn)生ANA，進(jìn)而引起器官、組織損傷[20-21]。同時ANA抗原性增加后誘導(dǎo)補體活化，促進(jìn)細(xì)胞炎癥浸潤，過量的細(xì)胞因子被釋放，炎癥級聯(lián)進(jìn)而加重器官、組織損傷[22-23]。許曉風(fēng)等[24]學(xué)者在其一項報道中發(fā)現(xiàn)，SLE患者ANA免疫熒光核型多為胞漿混合型、核均質(zhì)型，不同ANA免疫熒光核型患者癥狀不同。本研究通過分析SLE患者ANA免疫熒光核型分布特征發(fā)現(xiàn)，患者ANA免疫熒光核型以核顆粒型最為多見，且處于活動期的患者核顆粒型比例更高，此結(jié)果說明，ANA免疫熒光核型核顆粒型可能參與患者病情發(fā)展，分析其結(jié)果可能與部分患者在疾病進(jìn)展時，細(xì)胞凋亡增加，核小體活性增加，補體活化，對組織損害程度加重，進(jìn)而表現(xiàn)為ANA免疫熒光核型分布一致化。

抗核抗體（ANA）對SLE或其他自身免疫性疾病的早期診斷和鑒別具有一定的指導(dǎo)意義，大多數(shù)SLE患者表現(xiàn)為ANA陽性，但ANA滴度與SLE進(jìn)程并非是平行的，在診斷患者病情發(fā)展時可能存在一定差異。因此需要采用多種臨床指標(biāo)聯(lián)合檢測并結(jié)合臨床癥狀，可較準(zhǔn)確地判斷疾病進(jìn)展、活動性與非活動性變化情況，有助于對疾病的治療和轉(zhuǎn)歸進(jìn)行評定，本研究中根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果，聯(lián)合ANA構(gòu)建預(yù)測患者病情發(fā)展的模型，結(jié)果顯示，與單獨ANA預(yù)測相比，所構(gòu)建的模型預(yù)測效能更優(yōu)，此結(jié)果提示著，臨床在評估SLE患者病情發(fā)展?fàn)顟B(tài)的同時，還需結(jié)合臨床治療和癥狀表現(xiàn)，以提高評估準(zhǔn)確率。

綜上所述，SLE患者ANA免疫熒光核型主要以核顆粒型為主，ANA陽性是導(dǎo)致患者病情發(fā)展的重要因素，監(jiān)測ANA表達(dá)及免疫熒光核型有助于SLE病情發(fā)展的診斷和評估。本研究分析ANA及免疫熒光核型與SLE患者病情發(fā)展的關(guān)系及ANA對SLE的預(yù)測價值，在臨床上具有一定的推廣價值。但本研究并未進(jìn)一步驗證ANA及免疫核型參與SLE患者病情發(fā)展的具體機制，因此后續(xù)還需進(jìn)一步深入探究。