IgA腎病患者血清miR-346和SFRP-4水平表達與病情嚴重程度及預后的相關性研究

趙 玲，金巧玲，黃 俊，高 興，宿 林（1.成都市第六人民醫(yī)院a.腎內科；b.藥物臨床實驗I期病房，成都 610051；.四川大學華西第四醫(yī)院腎內科，成都 610041）

IgA腎病是臨床上最常見的原發(fā)性腎小球疾病，通常表現為腎小球系膜區(qū)IgA沉積[1]。IgA腎病呈慢性進行性發(fā)展，約10%～20%的患者在確診10年后逐漸進展為終末期腎病（end stage renal disease，ESRD），給患者及其家屬造成了巨大的身心傷害[2]。因此，探尋與IgA腎病進展有關，且可預測IgA腎病患者預后的指標，對改善IgA腎病患者預后極為重要。既往研究發(fā)現，炎癥反應在IgA腎病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。微小核糖核酸（micro RNA,miR）-346作為miRNA家族成員之一，參與多種疾病的炎癥反應過程，與慢性腎病的病理生理過程密切相關[4-5]。分泌型卷曲相關蛋白4（secreted frizzled-related protein 4,SFRP-4）作為一種脂肪因子與動脈粥樣硬化、糖代謝、炎癥反應等密切相關[6]。有研究顯示，SFRP-4異常表達與腎功能密切相關[7]。目前關于miR-346，SFRP-4在IgA腎病患者中的研究較少。因此，本研究旨在探討血清miR-346和SFRP-4水平與IgA腎病患者病情程度及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年3月～2020年1月在成都市第六人民醫(yī)院接受治療的102例IgA腎病患者為研究對象，其中男性61例，女性41例，年齡26～55歲。根據腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis,RIF）程度[8]將IgA腎病患者分為輕度組（n=35，光鏡下RIF面積＜25%）、中度組（n=43，光鏡下RIF面積25%～50%）和重度組（n=24，光鏡下RIF面積＞50%）。輕度組男性20例，女性15例，年齡26～52（35.59±7.91）歲；中度組男性25例，女性18例，年齡27～55（36.21±8.49）歲；重度組男性16例，女性8例，年齡27～58（37.04±8.06）歲。納入標準：①腎穿刺活檢確診為IgA腎病者；②年齡滿18周歲。排除標準：①患有內分泌系統(tǒng)疾病者；②繼發(fā)性IgA腎病者；③并發(fā)惡性腫瘤患者；④存在免疫系統(tǒng)疾病者。同時收集同期在我院進行健康體檢的健康者50例為對照組，其中男性26例，女性24例，年齡26～54（36.29±9.68）歲。四組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.835，t=0.007，均P＞0.05），本研究通過我院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 Trizol試劑（上海索萊寶生物）；熒光定量檢測試劑盒，反轉錄試劑盒（日本TAKARA公司）；SFRP-4 ELISA試劑盒（Bioswamp公司）；全自動酶標儀（美國BioTek，Elx808）。

1.3 方法

1.3.1 資料收集與血清樣品采集：收集所有研究對象一般臨床資料：性別、年齡、血清肌酐（serum creatinine,SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、24h尿蛋白定量、血紅蛋白（hemoglobin,Hb）、清蛋白（albumin,Alb）、尿酸（uric acid,UA）及腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）。抽取IgA腎病患者入院次日晨起及對照組體檢當天空腹肘靜脈血3～5 ml，血液凝固后分離血清（3 000 r/min，10 min），-70℃冷藏待測。

1.3.2 項目檢測：血清miR-346表達水平檢測采用實時熒光定量PCR法，Trizol試劑提取血清中總RNA，將總RNA反轉錄得到cDNA，采用熒光定量PCR儀進行測定，內參基因選擇U6，總反應體系20 μl，其中miScript SYBR Green Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 4 μl，雙蒸水4 μl。反應條件：92℃預變性60 s，95℃變性30 s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共42個循環(huán)。測定完成后采用2-ΔΔCt法計算miR-346相對表達水平，此實驗重復三次，避免實驗誤差。miR-346引物序列：上游引物5’-GAGTGCCTGCCTCTCTGTTG-3’，下游引物5’-G AGCAGCTCTGCCCAGG-3’；U6引物序列：上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。使用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清SFRP-4水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 隨訪：對102例患者隨訪三年，主要以電話或門診的方法進行隨訪，在隨訪期間死亡或進展為ESRD納為預后不良組，生存下來且未進展為ESRD納為預后良好組。ESRD：開始進行維持性腎臟替代治療或eGFR降低至15 ml/min/1.73 m2。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間差異比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗；IgA腎病患者血清miR-346，SFRP-4水平與病情程度之間的相關性分析用Spearman分析；采用多元Logistic回歸分析影響IgA腎病患者不良預后的因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基線資料對比 見表1。IgA腎病患者SCr，BUN，24h尿蛋白定量、UA水平較對照組升高，且隨著病情程度的增加，SCr，BUN，24 h尿蛋白定量，UA水平逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；IgA腎病患者Hb，Alb，eGFR水平較對照組降低，且隨著病情程度的增加，Hb，Alb，UA，eGFR水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 基線資料對比（±s）

表1 基線資料對比（±s）

注：a與對照組相比t=5.674，14.611，24. 306；4.394，11.545，12. 021；2.837，5.534，7. 763；4.139，9.038，10. 537；9.575，12.788，14. 556；5.784，14.206，17.784，均P＜0.05。b與輕度組相比t=7.147，15. 140；6.422，7. 717；9.179，10. 318；2.054，3. 889；4.969，8. 108；3.076，6. 074；7.538，12.063，均P＜0.05。c與中度組相比t=9.039，3.042，2.210，2.084，3.91，3.277，5.741，均P＜0.05。

項 目對照組（n=50）輕度組（n=35）中度組（n=43）重度組（n=24）FP SCr（mmol/L）63.21±18.4390.37±25.73a134.54±28.24ab201.23±30.22abc183.4660.000 BUN（mmol/L）5.67±1.427.22±1.83a10.51±2.54ab12.84±3.71abc66.7950.000 24 h尿蛋白定量（g/24h）-1.48±0.352.83±0.81b3.12±0.97bc46.2810.000 Hb（g/ml）148.34±18.21135.24±24.36a121.84±24.39ab117.52±20.87abc15.9190.000 Alb（g/ml）43.48±7.2237.49±5.49a31.16±5.68ab26.63±4.33abc55.0710.000 UA（μmol/L）260.37±40.58346.59±41.26a378.34±48.39ab419.37±50.49abc88.9200.000 eGFR（ml/min/1.73m2）100.39±12.6784.37±12.42a62.49±13.01ab43.18±13.54abc132.7590.000

2.2 不同病情程度IgA腎病患者血清miR-346，SFRP-4水平對比 見表2。與對照組相比，IgA腎病患者血清miR-346水平降低，血清SFRP-4水平升高，且隨著病情程度的增加，血清miR-346水平逐漸降低，血清SFRP-4水平逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步Spearman相關性分析結果顯示，IgA腎病患者病情程度與血清miR-346水平呈顯著負相關（r=-0.673，P＜0.05），與血清SFRP-4水平呈顯著正相關（r=0.532，P＜0.05）。

表2 不同病情程度患者血清miR-346，SFRP-4水平對比（±s）

表2 不同病情程度患者血清miR-346，SFRP-4水平對比（±s）

注：a與對照組相比t=6.980，11.800，13. 920；8.378，18.094，16.929，均P＜0.05。b與輕度組相比t=3.678，8. 367；8.488，9.631，均P＜0.05。c與中度組相比t=7.845，3.845，均P＜0.05。

項 目對照組（n=50）輕度組（n=35）中度組（n=43）重度組（n=24）FP miR-3461.09±0.230.76±0.19a0.63±0.12ab0.42±0.07abc96.7350.000 SFRP-4（ng/ml）1.32±0.311.90±0.32a2.54±0.34ab2.94±0.51abc147.1710.000

2.3 不同預后IgA腎病患者基線資料及血清miR-346，SFRP 4水平對比 見表3。102例IgA腎病患者中，在隨訪截止后，有32例患者進入預后不良組，70例為預后良好組，兩組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。預后不良組患者SCr，BUN，24 h尿蛋白定量，UA，SFRP-4水平高于預后良好組，而Hb，Alb，eGFR，miR-346水平低于預后良好組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表3 不同預后IgA腎病患者基線資料與血清miR-346，SFRP-4水平對比[±s,n(%)]

表3 不同預后IgA腎病患者基線資料與血清miR-346，SFRP-4水平對比[±s,n(%)]

項 目預后良好組（n=70）預后不良組（n=32）χ2/tP性別（男/女）38/32（54.29）23/9（71.88）2.8260.093年齡（歲）35.78±8.1337.09±8.320.7500.455 SCr（mmol/L）121.68±26.89164.39±29.917.1840.000 BUN（mmol/L）8.85±2.4712.29±2.796.2640.000 24 h尿蛋白定量（g/24h）2.26±0.652.80±0.793.8360.000 Hb（g/ml）132.48±24.15119.56±22.252.4500.016 Alb（g/ml）34.22±5.8228.01±4.175.4260.000 UA（μmol/L）367.36±43.61398.41±52.633.1230.002 eGFR（ml/min/1.73m2）70.41±14.2153.53±10.146.0460.000 miR-3460.71±0.150.43±0.109.6150.000 SFRP-4（ng/ml）2.18±0.352.90±0.419.1280.000

2.4 多因素Logistic回歸分析影響IgA腎病患者預后的危險因素 見表4。以IgA腎病患者是否出現預后不良作為因變量（是＝1，否＝0），以SCr，BUN，24h尿蛋白定量，Hb，Alb，UA，eGFR，miR-346，SFRP-4水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，SCr，24 h尿蛋白定量，eGFR，miR-346，SFRP-4是IgA腎病患者預后不良的獨立危險因素（均P＜0.05）。

表4 多因素Logistic回歸分析影響IgA腎病患者預后的危險因素

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高及飲食習慣的改變，IgA腎病的發(fā)病率逐年增加，IgA腎病是一種發(fā)病率較高的原發(fā)性腎小球疾病，病理診斷特征是在腎臟系膜區(qū)沉積以IgA為主的免疫復合物[9]。臨床上主要表現為腎間質纖維化、巨噬細胞/淋巴細胞浸潤、腎小球硬化、急慢性腎炎、血尿、蛋白尿及腎功能衰竭等，另有部分患者會出現無癥狀血尿、蛋白尿，在臨床上未能及時被發(fā)現，對患者生命健康造成嚴重威脅[10]。目前，臨床多使用腎活檢對IgA腎病進行診斷，雖然該方法是診斷IgA腎病的金標準，但在實際應用中，該方法一方面需要專業(yè)設備和技術人員的支持，另一方面在進行腎組織活體標本取樣時會對患者造成損傷，在實際應用中存在諸多不足[11]。因此，尋找一種簡單、快速的IgA腎病診斷方法，判斷IgA腎病預后的指標對改善患者的生存狀況有重要意義。

miRNA是一種由20～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，廣泛表達于真核生物中，參與調控細胞增殖、遷移、炎癥反應、免疫平衡、信號轉導等多種重要生物進程[12-13]。既往研究顯示，miRNA與慢性腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關，miRNA可引發(fā)和誘導足細胞凋亡、腎基底膜及腎小球發(fā)育異常、細胞外基質沉積、間質纖維化、系膜擴張、腎小球纖維化等，與糖尿病腎病、IgA腎病、腎癌等疾病密切相關[14-15]。miR-346是miRNA家族成員之一，動物實驗發(fā)現，在糖尿病腎病小鼠模型中，miR-346可通過降低腎組織中SMAD3/4的表達，從而對糖尿病腎病小鼠的腎功能進行改善，減緩糖尿病腎病的進展[16]。SU等[17]研究發(fā)現，miR-346通過靶向N-myc下游調節(jié)基因2（N-myc downstream-regulated gene 2,NDRG2）可促進缺氧條件下腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲。以上研究提示，miR-346異常表達可能與腎損傷性疾病密切相關。本研究結果顯示，IgA腎病患者血清miR-346水平低于對照組，且隨著病情的進展，miR-346水平逐漸降低。提示miR-346可能在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有利于評估IgA腎病患者病情。推測miR-346低表達可促進腎小管上皮細胞凋亡，同時促進了細胞炎癥反應和氧化應激反應，促進腎組織和腎功能損傷[5]，進而影響IgA腎病的病理發(fā)展，但其作用機制需進一步探究。

分泌型卷曲相關蛋白（SFRP）作為Wnt信號通路抑制劑，能夠競爭性地阻斷Wnt信號傳遞并與細胞膜上的卷曲蛋白受體結合，間接的對β-actenin水平和Wnt信號通路產生影響，目前在腫瘤領域被廣泛研究[18]。SFRP-4是SFRP家族成員之一，位于染色體7p14.1上，SFRP-4是Wnt的拮抗劑，可通過結合Wnt受體和卷曲受體阻斷其信號通路，并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究發(fā)現，SFRP-4作為與炎癥相關的因子，在惡性腫瘤[19]、糖尿病腎病[20]等多種疾病的發(fā)生中發(fā)揮作用。目前關于SFRP-4與IgA腎病之間的關系研究較少，本研究結果顯示，IgA腎病患者血清SFRP-4水平高于對照組，可能是由于SFRP-4是一種Wnt信號拮抗劑，可激活Wnt信號通路，當IgA腎病患者出現腎功能異常時，Wnt4/β-actenin信號通路異常活化，進而需大量SFRP-4進行抑制，因此SFRP-4表達水平升高[21]。進一步相關性分析顯示，IgA腎病患者病情程度與血清SFRP-4水平呈顯著正相關，患者病情越嚴重，SFRP-4表達水平越高。IgA腎病血清SFRP-4水平升高，加速細胞外基質降解及纖維化進程，使T調節(jié)細胞分化，產生更多的炎癥遞質，從而使氧化自由基和活性氧生成增加，誘發(fā)氧化應激損傷，進而使腎組織損傷加重[20]。此外SFRP-4可引起血管收縮功能障礙，引發(fā)腎小球疾病，從而使腎功能降低，導致腎臟纖維化，使IgA腎病患者病情加重[22]。本研究進一步分析發(fā)現，102例IgA腎病患者中，30例進入預后不良組，且預后不良組患者血清miR-346水平相比預后良好組更低，SFRP-4則更高，多因素Logistic回歸分析得出，SCr，24 h尿蛋白定量、eGFR，血清miR-346，SFRP-4是影響IgA腎病患者預后的獨立影響因素，提示血清miR-346，SFRP-4的異常表達與IgA腎病患者預后不良有關，且SFRP-4，miR-346在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，血清miR-346在IgA腎病患者中表達水平較低，與病情程度呈顯著負相關，血清SFRP-4在IgA腎病患者中表達水平升高，與病情程度呈顯著正相關，兩者可對IgA腎病患者病情進展進行有效監(jiān)測。且兩者均是影響IgA腎病患者預后不良的獨立影響因素，可作為IgA腎病預后不良的重要指標。然而本研究仍存在以下不足：①隨訪時間相對較短，部分IgA腎病患者進展為ESRD時間較長，可能會對本研究造成偏倚；②樣本量相對較少，未來將擴大樣本量進行更深入的探究；③未深入探究SFRP-4，miR-346影響IgA腎病患者預后的具體途徑，故評估價值仍需進一步研究。