非小細胞肺癌患者血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表達及與預(yù)后相關(guān)性研究

巫旋欽，陳 庚，賈 硯，陽 鵬，陳中良

[中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）心胸血管外科，廣東深圳 518106]

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全世界所有惡性腫瘤中最高，其中80%～85%的組織學類型被診斷為非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC），且大多數(shù)患者在肺癌晚期才被診斷出來，最佳治療的時機被延遲，導(dǎo)致肺癌患者的預(yù)后仍然不盡如人意[1-2]。因此，尋找可盡早識別NSCLC的生物標志物，對改善NSCLC預(yù)后、提高國民健康有重要意義。據(jù)報道，腫瘤自身抗體（autoantibodies，AABs）在成為癌癥生物標志物方面具有較大潛力，其不但在臨床診斷早期可檢測到，在癌癥轉(zhuǎn)移時其表達也能被發(fā)現(xiàn)，因此AABs可能成為NSCLC早期診斷和預(yù)測患者預(yù)后最有潛力的生物標志物[3]。研究表明，角蛋白5抗體（cytokeratin 5 antibody，anti-CK5）、P63抗體（P63 antibody，anti-P63）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1抗體（thyroid transcription factor 1 antibody，anti-TTF-1）在肺腺癌中發(fā)揮重要作用[4]。然而，NSCLC患者血清中是否存在CK5，P63和TTF-1的相應(yīng)抗體，以及這些抗體對NSCLC的診斷價值鮮有報道。本研究通過檢測NSCLC患者中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1的表達水平，分析其與NSCLC預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床中NSCLC的早期診療和預(yù)后提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2015年6月～2017年6月在中國科學院大學深圳醫(yī)院接受治療的80例NSCLC患者的隨訪記錄，將其設(shè)為NSCLC組。NSCLC組男性45例，女性35例，年齡58.99±15.74歲。納入標準：①患者在臨床中確診為NSCLC[5]；②NSCLC分期包括不能進行切術(shù)手術(shù)的III～IV期患者；③未進行任何抗腫瘤治療的患者；④臨床基本資料完善的患者。排除標準：①并發(fā)其他腫瘤者；②并發(fā)免疫性疾病者；③并發(fā)血液性疾病者；④隨訪失聯(lián)或不配合者。另外納入80例肺炎患者為肺炎組（良性病變）和同期健康體檢者80例為對照組。肺炎組男性44例，女性36例，年齡59.27±14.33歲；對照組男性42例，女性38例，年齡59.61±14.28歲。三組研究者一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（F/χ2=0.035，0.235，P＞0.05），具有可比性。該研究經(jīng)本院倫理委員會批準，研究對象均知情同意并書面確認。

1.2 儀器與試劑 anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（科威生物技術(shù)有限公司）；酶標儀（BioTek Instruments,USA）

1.3 方法 對照組在體檢時，NSCLC組在患者入院確診時抽取靜脈血5 ml，3 000 r/min離心后，將得到的血清立即儲存于-80℃冰箱中待測。采用ELISA方法檢測血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1的水平。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。

1.4 隨訪 術(shù)后通過電話訪問、門診復(fù)查等形式對全部患者進行為期5年的隨訪，全部病例無失訪，統(tǒng)計隨訪期間患者生存情況。按生存情況分為預(yù)后良好（生存）組（n=19）和預(yù)后不良（死亡）組（n=61）。

1.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件完成統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗；采用COX回歸分析NSCLC預(yù)后的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1及其聯(lián)合檢測對NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TF-1水平比較 見表1。單因素方差分析顯示，肺炎組和NSCLC組患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），NSCLC組患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平高于肺炎組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 三組血清中anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平比較（±s）

表1 三組血清中anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平比較（±s）

注：＃與對照組比較，t=3.619,7.451,4.612; 8.117,4.367,11.022,均P＜0.05；*與肺炎組比較t=3.832,3.505,6.655,均P＜0.05。

項目 對照組（n=80） 肺炎組（n=80） NSCLC組（n=80） F P anti-CK5（pg/ml） 140.01±46.31 158.79±46.51＃ 178.68±46.44＃* 13.883＜0.001 anti-P63（ng/ml） 2.02±0.43 2.18±0.50＃ 2.36±0.52＃* 16.572＜0.001 anti-TTF-1（ng/ml） 2.26±0.44 2.41±0.42＃ 2.73±0.43＃* 30.809＜0.001

2.2 血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1對NSCLC的診斷價值 見圖1、表2。以NSCLC患者血清anti CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平為檢驗變量，以是否發(fā)生NSCLC為狀態(tài)變量（否=0，是=1）繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平及三者聯(lián)合預(yù)測NSCLC發(fā)生的AUC分別為0.725，0.710，0.735和0.852，其中聯(lián)合預(yù)測AUC顯著高于三者單獨預(yù)測AUC，差異具有統(tǒng)計學意義（Z=2.500，2.795，2.378，P=0.012，0.005，0.021），且三者聯(lián)合具有較高的敏感度和特異度。

圖1 血清anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平預(yù)測NSCLC發(fā)生的ROC曲線

表2 血清anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平預(yù)測NSCLC發(fā)生的價值

2.3 不同預(yù)后NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平比較 見表3。單因素方差分析顯示，NSCLC死亡組患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平均高于生存組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表3 不同預(yù)后NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平比較（±s）

表3 不同預(yù)后NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平比較（±s）

項目 生存組（n=19） 死亡組（n=61） F P anti-CK5（pg/ml） 163.00±42.66 183.57±47.45 3.820＜0.001 anti-P63（ng/ml） 2.18±0.39 2.41±0.40 2.201 0.031 anti-TTF-1（ng/ml） 2.51±0.39 2.80±0.46 2.481 0.015

2.4 臨床病理特征與NSCLC患者anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平的關(guān)系 見表4。經(jīng)獨立樣本t檢驗分析顯示，NSCLC患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表達均與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤部位無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。吸煙的患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表達顯著高于不吸煙的患者，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；T分期中，T1～T2期患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表達顯著低于T3～T4期患者，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；N分期中，N0期患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表達顯著低于N+期患者，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。

2.5 NSCLC患者預(yù)后影響因素的COX回歸分析 見表5。以吸煙史（不吸煙=0，吸煙=1）、T分期（T1～T2期=0，T3～T4期=1）、N分期（N0=0，N+=1）、anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平為自變量，以預(yù)后（不良=1，良好=0）為因變量，進行單因素COX回歸分析。結(jié)果顯示，以上6個因素均對NSCLC患者預(yù)后有影響（P＜0.05）。多因素分析發(fā)現(xiàn)，T分期[HR（95%CI）=1.443（1.106～2.254）]、N分期[HR（95%CI）=1.375（1.185～1.820）]、anti-CK5[HR（95%CI）=1.518（1.133～2.286）]，anti-P63[HR（95%CI）=1.771（1.255～2.388）]和anti-TTF-1[HR（95%CI）=2.012（1.672～2.921）]水平均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素（均P＜0.05）。

2.6 NSCLC患者anti-CK5，anti-P63和anti-TF-1水平預(yù)測不良預(yù)后的價值分析 見圖1、表6。以NSCLC患者血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平為檢驗變量，以預(yù)后結(jié)果為狀態(tài)變量（生存=0，死亡=1）繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平及三者聯(lián)合預(yù)測NSCLC患者預(yù)后結(jié)局的AUC分別為0.773，0.741，0.729和0.880，其中聯(lián)合預(yù)測AUC顯著高于三者單獨預(yù)測AUC（Z=3.834，3.868，3.686,P=0.043，0.032，0.028）。

表6 血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平預(yù)測NSCLC患者預(yù)后結(jié)局的價值

3 討論

在腫瘤發(fā)展的進程中，癌細胞會釋放出一些特異性蛋白，這些特異性蛋白表達失調(diào)后成為腫瘤抗原[6]。癌細胞的抗原變化可以被患者自身的免疫系統(tǒng)識別，并表現(xiàn)為對參與惡性轉(zhuǎn)化的因素的免疫反應(yīng)。而自身抗體被稱為來自免疫系統(tǒng)的“報告者”，可以識別參與轉(zhuǎn)化過程的細胞因子的抗原變化[7]。腫瘤相關(guān)的自身抗體是一組血清生物標志物，不但在血液樣本中容易獲得，而且具有較長的半衰期，這比目前使用的其他蛋白質(zhì)生物標志物具有優(yōu)勢[8]。此外，抗體對抗原的擴增反應(yīng)意味著在腫瘤發(fā)生的早期階段，即使相對少量的抗原也可以引發(fā)更大的免疫反應(yīng)，這使其成為一種有用的早期診斷標志物[8]。相較于CT檢測，癌癥患者血液中的自身抗體能夠提前5年發(fā)現(xiàn)腫瘤，且血液中自身抗體的聯(lián)合檢測更為有效，對早期癌癥的篩查價值較大[6]。因此，本研究探尋可靠的自身抗體對NSCLC進行診斷意義重大。

CK5被認為是中等分子量的細胞角蛋白，由于其在基底細胞中的表達，也被稱為基底細胞角蛋白[9]。GUDI等[10]人表明，在診斷各種病變?nèi)橄俳M織時，anti-CK5對病變組織的診斷效果優(yōu)于anti-CK5/6，在常規(guī)臨床使用中具有較高的診斷和經(jīng)濟效益。TERADA等[11]人發(fā)現(xiàn)CK5是肺鱗狀細胞癌（ADC）的獨立不良預(yù)后因素，陽性CK5對ADC表現(xiàn)出侵襲性臨床行為。p63是上皮發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子，許多小鼠和人類研究顯示可驅(qū)動腫瘤發(fā)生[12]。LéPINE等[13]人發(fā)現(xiàn)anti-P63的免疫化學是預(yù)測復(fù)發(fā)性呼吸道狀瘤病嚴重程度的潛在生物標志物。TTF-1是一種參與肺胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄蛋白。它有助于表面活性劑的產(chǎn)生、呼吸單位和肺泡的發(fā)育以及正常的肺功能，同時具有癌基因和腫瘤抑制特性[14]。SHARMA等[15]人認為在ADC中TTF-1的特異度為88.2%，p63的特異度為93.8%。也有研究表明，TTF-1在肺腺癌均具有較高的陽性預(yù)測值和診斷準確性，而CK5和p63對肺鱗狀細胞癌具有較高的陽性預(yù)測值和準確性[16]。此外在回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，使用anti-TTF-1抗體快速免疫組織化學法對肺腺癌的診斷中有幫助[17]。已研究表明，CK5，P63和TTF-1三種抗原在NSCLC中表達，因此本實驗中研究anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1這三種自身抗體在NSCLC中的表達情況。本研究結(jié)果表明，NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平明顯高于對照組受試者和肺炎患者，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致[11,15]，提示三者的表達升高,參與NSCLC的發(fā)生。ROC曲線結(jié)果顯示，血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1聯(lián)合預(yù)測NSCLC發(fā)生的診斷效能明顯升高。且聯(lián)合預(yù)測的敏感度和特異度分別為78.75%和85.00%，提示anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1對NSCLC的發(fā)生有一定診斷價值。本研究進一步探究NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1與患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，死亡組患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平明顯高于生存組患者，且NSCLC患者血清三者指標表達水平與患者吸煙史、T分期和N分期均有關(guān)，這一結(jié)果與MU等[18]人研究結(jié)果類似，提示血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1高表達可能是NSCLC患者預(yù)后不良的分子標志。進一步通過ROC曲線預(yù)測顯示，三者聯(lián)合對NSCLC患者預(yù)后預(yù)測具有良好的臨床價值，且COX回歸分析顯示T分期、N分期以及anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素，這一結(jié)果與CHENG等[19]結(jié)果基本一致，提示血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1可作為預(yù)測NSCLC預(yù)后不良的輔助生物檢測手段，及早預(yù)估預(yù)后不良的發(fā)生風險，降低NSCLC的死亡率，表明血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1在NSCLC的診斷與預(yù)后評估中具有重要的臨床價值。但本研究納入樣本量有限，且影響NSCLC預(yù)后的因素眾多，后續(xù)本研究還需進一步探究血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系并探討其在NSCLC發(fā)生中的作用機制，為三者作為NSCLC患者預(yù)后標志物提供更有利的理論依據(jù)。

綜上所述，NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1表達升高，且均是NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素，三者聯(lián)合對NSCLC患者預(yù)后的結(jié)局具有較好的預(yù)測價值。作為臨床上檢測的輔助手段，AABs的特異性及先于癥狀出現(xiàn)的特征可對NSCLC患者早干預(yù)，進而達到積極防治，改善NSCLC預(yù)后的目的。但本研究中樣本量較小，可能使結(jié)果具有局限性，后期將使用大樣本量對其具體機制進行深入研究。