急性缺血性腦卒中患者血清Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2水平表達(dá)與腦梗死體積及預(yù)后的相關(guān)性研究

鐘 曌，郭繼勃，郭 昊，韓曉婷，張麗萍，祝 剛 （.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院a.神經(jīng)內(nèi)科；b.急診科；c.神經(jīng)外科，西安 70038；.核工業(yè)四一七醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，西安 70699）

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是約占全部腦卒中的60%～80%，術(shù)后易出現(xiàn)高復(fù)發(fā)、高致殘、高死亡等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者及家屬的生活質(zhì)量[1]。AIS病理機(jī)制目前尚未明確，有研究顯示，神經(jīng)炎癥引發(fā)的腦組織受損及細(xì)胞壞死是造成AIS的關(guān)鍵因素之一[2]。因此，尋找能夠反映AIS嚴(yán)重程度的炎性標(biāo)志物，并分析其在病理過(guò)程中的作用機(jī)制，對(duì)盡早診斷AIS病情及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2（kruppel-like factor 2，KLF2）是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，其對(duì)胚胎發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞功能以及T細(xì)胞和單核細(xì)胞靜止的維持起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[3]。有研究報(bào)道，KLF2能夠抑制單核細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，減少促炎介質(zhì)的分泌，從而發(fā)揮抗炎功能[4]。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）/鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是鞘磷脂代謝的重要途徑，其中S1P主要以脂蛋白形式存在，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、凝血及炎癥等多種病理過(guò)程，而SphK1是促進(jìn)鞘磷脂代謝生成S1P的關(guān)鍵酶，主要調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[5-6]。已有研究證實(shí)，激活SphK1可催化S1P合成，促進(jìn)炎癥因子釋放，對(duì)調(diào)控免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有重要作用[7]。然而目前有關(guān)KLF2與SphK1/S1P通路的研究鮮少，其介導(dǎo)AIS發(fā)生的機(jī)制尚不明確。因此本研究主要探究了AIS患者血清KLF2水平表達(dá)與腦梗死體積及預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步通過(guò)分析KLF2表達(dá)與炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）及SphK1，S1P水平的相關(guān)性，旨在探究KLF2介導(dǎo)AIS發(fā)生的可能機(jī)制，以期為AIS病情評(píng)估及治療提供新方向。

1 材料及方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021年4月～2022年11月空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的141例AIS患者，AIS診斷符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018版》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭顱CT或MRI首次確診，發(fā)病24 h內(nèi)入院。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象年齡18～90歲；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后進(jìn)行，所有研究對(duì)象均知情并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在靜脈溶栓治療相對(duì)或絕對(duì)禁忌癥，溶栓48 h后出現(xiàn)神經(jīng)功能惡化者；②并發(fā)有心/腎/肝等嚴(yán)重功能器官損傷、其他惡性腫瘤或自身免疫、血液病；③妊娠女性；④并發(fā)有急性心肌梗死或有嚴(yán)重心腦血管不良事件；⑤各種繼發(fā)性腦出血、顱內(nèi)外損傷、各種腦腫瘤出血或近期罹患慢性感染性疾病者；⑥復(fù)發(fā)性卒中；⑦既往有手術(shù)史、腦卒中病史者。另選取同期于本院健康體檢中心進(jìn)行體檢的50例健康體檢者作為對(duì)照，患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index,BMI）等基礎(chǔ)資料與AIS患者相匹配。兩組年齡、性別，BMI，吸煙/飲酒史、并發(fā)癥等基線(xiàn)資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/t=-1.707～3.161，均P＞0.05），AIS組入院NIHSS評(píng)分與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-27.113，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床基線(xiàn)資料及特征比較［n(%)，±s］

表1 兩組臨床基線(xiàn)資料及特征比較［n(%)，±s］

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=50）AIS組（n=141） t/χ2 P年齡（歲） 62.12±7.42 63.72±5.89-1.537 0.126 BMI（kg/cm2） 24.51±2.16 25.08±1.98-1.707 0.089男性 27（54.00） 82（58.16） 0.260 0.610吸煙史 14（28.00） 51（36.17） 1.098 0.295飲酒史 17（34.00） 38（26.95） 0.895 0.344糖尿病 12（24.00） 40（28.37） 0.356 0.551高血壓 24（48.00） 88（62.41） 3.161 0.075高血脂 5（10.00） 15（10.64） 0.016 0.899房顫病 3（6.00） 18（12.77） 1.727 0.189冠心病 4（8.00） 21（14.89） 1.542 0.214入院NIHSS評(píng)分-5.07±1.32-27.113 0.000

1.2 儀器與試劑 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 AIS治療方法：對(duì)所有符合條件的病例按照急性缺血性腦卒中診治指南標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療，治療時(shí)間窗內(nèi)予以阿替普酶、尿激酶靜脈溶栓治療或動(dòng)脈取栓術(shù)，超治療時(shí)間窗患者、溶栓治療或取栓術(shù)后24h復(fù)查頭顱CT未見(jiàn)出血病例予以硫酸氫氯吡格雷片75 mg和阿司匹林腸溶片100 mg，同時(shí)予以積極的抗血小板聚集、降顱壓、抗凝等治療，并給予維持水電解質(zhì)平衡等支持治療。

1.3.2 腦梗死體積計(jì)算及分組：AIS患者腦梗死體積計(jì)算根據(jù)Pullicino公式=頭顱CT/MRI上顯示的梗死最長(zhǎng)直徑×最寬直徑×層數(shù)×（層距＋層厚）×0.5，若為多發(fā)性梗死，計(jì)算各個(gè)散在多發(fā)的梗死體積總和即為腦梗死總體積。根據(jù)腦梗死總體積將入組AIS患者分為小梗死灶組（體積＜5 cm3，P=75），中梗死灶組（5～10 cm3，P=36）及大梗死灶組（＞10 cm3，P=30）。

1.3.3 AIS病情嚴(yán)重程度評(píng)估：入院后根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（national institutes of health stroke scale，NIHSS）[9]評(píng)價(jià)AIS患者神經(jīng)功能缺損程度，該量表包含意識(shí)水平、視野、上肢運(yùn)動(dòng)、下肢運(yùn)動(dòng)、凝視、面癱、共濟(jì)失調(diào)、語(yǔ)言、感覺(jué)、忽視、構(gòu)音障礙等11個(gè)方面，總分0～42分，評(píng)分越高表明神經(jīng)缺損程度越重。

1.3.4 血清KLF2，IL-6，S1P和SphK1水平檢測(cè)：采集所有研究對(duì)象入院時(shí)外周靜脈血約5 ml，置入EDTA-Na2抗凝管，4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)血清KLF2，IL-6，S1P和SphK1水平。

1.3.5 AIS預(yù)后分組：治療后隨訪(fǎng)三個(gè)月，采用改良Rankin量 表[10]（modified Rankin scale，mRS）評(píng)估AIS患者預(yù)后情況，mRS評(píng)分范圍0～5分，0分為無(wú)癥狀；1分為未見(jiàn)明顯功能異常，生活可自理；2分為輕微殘障，日常生活需他人輔助料理；3分為中度殘障，日常生活需依賴(lài)他人；4分為中重度殘障，日常生活主要依賴(lài)他人；5分為重度殘障，絕對(duì)臥床，生活完全依賴(lài)他人?？偟梅?～2分提示預(yù)后良好，3～6分提示預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2或Fisher精確檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)分析血清KLF2表達(dá)與AIS患者腦梗死體積、預(yù)后mRS評(píng)分及血清IL-6，S1P和SphK1水平之間的相關(guān)性；ROC曲線(xiàn)分析血清KLF2對(duì)AIS腦梗死體積和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清KLF2，IL-6，S1P和SphK1水平表達(dá)及相關(guān)性分析 見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，AIS組患者血清KLF2水平顯著降低，IL-6，S1P和SphK1水平則顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；earson相關(guān)性分析顯示，AIS組血清KLF2表達(dá)與IL-6，SphK1水平之間呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.480，-0.522，均P＜0.05）；與S1P水平無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.172，P＞0.05）；血清SphK1與S1P水平呈明顯正相關(guān)（r=0.480，P＜0.05）。

表2 兩組血清KLF2，IL-6，S1P和SphK1水平比較（±s）

表2 兩組血清KLF2，IL-6，S1P和SphK1水平比較（±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=50) AIS組(n=141) t P KLF2（pg/ml） 242.85±17.39 194.37±32.37 10.076 0.000 IL-6（pg/ml） 9.92±2.45 13.70±2.89-8.253 0.000 S1P（pg/ml） 259.15±78.24 432.58±101.37-10.986 0.000 SphK1（ng/ml） 1.48±0.36 2.65±0.58-13.367 0.000

2.2 不同腦梗死體積AIS患者血清KLF2表達(dá)相關(guān)性 小梗死灶組、中梗死灶組及大梗死灶組血清KLF2表達(dá)分別為217.69±33.14pg/ml，196.48±29.53pg/ml和168.94±31.62pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.753，P＜0.001）。Pearson相關(guān)性分析顯示，血清KLF2水平與AIS腦梗死體積呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.607，P＜0.05）。

2.3 不同預(yù)后AIS患者血清KLF2表達(dá)相關(guān)性 根據(jù)改良Rankin量表（modified Rankin scale，mRS）評(píng)分分為預(yù)后良好組（n=82）和預(yù)后不良組（n=59），預(yù)后良好組血清KLF2表達(dá)為211.83±28.46pg/ml，明顯高于預(yù)后不良組的170.12±25.34pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.982，P＜0.001）。Pearson相關(guān)性分析顯示，血清KLF2水平與AIS患者mRS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.586，P＜0.05）。

2.4 血清KLF2對(duì)AIS腦梗死體積及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制ROC曲線(xiàn)顯示，血清KLF2預(yù)測(cè)AIS患者中-大梗死灶的AUC值為0.871（95%CI：0.827～0.953），當(dāng)截?cái)嘀等?06.1 pg/ml時(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為83.4%和74.8%，見(jiàn)圖1A；血清KLF2預(yù)測(cè)AIS預(yù)后不良的AUC值為0.889（95%CI：0.789～0.934），當(dāng)截?cái)嘀等?92.37 pg/ml時(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為89.4%和79.6%，見(jiàn)圖1B。

3 討論

急性缺血性腦卒中（AIS）為最常見(jiàn)的腦卒中類(lèi)型，由于高致殘、高死亡特性，很大程度上增加了人們的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力，已成為我國(guó)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[11]。因此，探究AIS發(fā)生發(fā)展的病因，尋找能反映其疾病嚴(yán)重程度的潛在標(biāo)志物是目前科研工作者研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

大量研究證實(shí)，神經(jīng)炎癥參與了腦缺血后的病理過(guò)程，干預(yù)腦缺血后的神經(jīng)炎癥應(yīng)答則能有效減輕腦組織損傷[12-13]。KLF2基因位于人類(lèi)染色體10p13.1，作為KLFs家族成員其氨基端含有的Cys2/His2鋅指樣結(jié)構(gòu)能與富含GC結(jié)合位點(diǎn)序列的增強(qiáng)子或靶基因DNA結(jié)合，起到轉(zhuǎn)錄作用，在機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中表現(xiàn)出抗凝、抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等作用[14]。研究報(bào)道，KLF2作為新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可激活內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，促使T細(xì)胞向輔助型T細(xì)胞2（T-helper 2，Th2）分化，減少T細(xì)胞歸巢，減輕炎癥反應(yīng)[14]。KLF2可以抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和單核細(xì)胞炎癥趨化因子1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表達(dá)，減少單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減輕內(nèi)皮炎癥反應(yīng)[15]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生理作用的調(diào)節(jié)中，其可通過(guò)直接或間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)血管生成等過(guò)程[16]。此外，JHA等[17]曾報(bào)道，上調(diào)KLF2能夠阻斷核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制巨噬細(xì)胞炎性激活及內(nèi)皮細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，減少血管內(nèi)皮功能障礙，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。ZHANG等[18]研究表明，KLF2可以誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達(dá)并促進(jìn)一氧化氮（nitric oxide，NO）生成，促使血管舒張，利于減輕卒中所致的腦組織缺血或缺氧損傷。VILA等[19]在缺血性卒中大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，尿酸治療可上調(diào)KLF2表達(dá)，并降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）水平，改善大鼠內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性和通透性，減少炎癥引發(fā)的腦損傷。急性腦梗死患者血清KLF2水平降低，與梗死面積呈負(fù)相關(guān)[20]。黎紅華等[21]一項(xiàng)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型研究發(fā)現(xiàn)，KLF2通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的抗炎感染因子，維持血液抗凝狀態(tài)，起到抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。KLF2被證實(shí)是一種關(guān)鍵的心血管保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子，參與腦卒中、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化及心肌梗死等心血管疾病的病理生理過(guò)程。而本研究經(jīng)探究KLF2在AIS中的作用，發(fā)現(xiàn)AIS組血清KLF2水平顯著降低，炎癥因子IL-6水平顯著升高，且KLF2表達(dá)與AIS腦梗死體積和IL-6水平呈明顯負(fù)相關(guān)，表明KLF2水平檢測(cè)可反映AIS病變嚴(yán)重程度，AIS病理過(guò)程可能與KLF2誘導(dǎo)炎癥因子釋放有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，AIS預(yù)后良好組血清KLF2表達(dá)明顯高于預(yù)后不良組，并與mRS評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)，表明KLF2表達(dá)與AIS預(yù)后關(guān)系密切。同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清KLF2預(yù)測(cè)AIS患者中-大梗死灶和預(yù)后不良的AUC值分別為0.871和0.889，診斷價(jià)值較高，提示其可作為AIS病情診斷及評(píng)估預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

為探討KLF2介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的病理機(jī)制，本研究探究發(fā)現(xiàn)，AIS患者血清中SphK1和S1P水平顯著升高，KLF2與SphK1水平呈明顯負(fù)相關(guān)，SphK1和S1P水平呈明顯正相關(guān)，提示KLF2可能通過(guò)調(diào)控SphK1/S1P軸介導(dǎo)AIS神經(jīng)炎性反應(yīng)，這與YAMAMOTO等[22]報(bào)道的鞘磷脂受體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向血管壁聚集并釋放炎癥因子的結(jié)論相吻合。此外，SU等[23]在研究腦缺血灌注損傷模型中SphK1介導(dǎo)的反應(yīng)途徑及機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制SphK1可以減少白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）的產(chǎn)生，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，可能作用機(jī)制是阻斷了TNF受體關(guān)聯(lián)因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）/NF-κB信號(hào)通路，減輕了血管壁局部的炎癥反應(yīng)。ZHENG等[24]研究表明，S1P可促進(jìn)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α和IL-6的分泌，其受體S1PR1影響血管生成和細(xì)胞黏附，在淋巴細(xì)胞運(yùn)輸和維持血管完整性中發(fā)揮重要作用，從而促進(jìn)復(fù)雜炎癥過(guò)程的調(diào)節(jié)。JIN等[25]研究表明，SphK1在生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子的作用下活化，可以促進(jìn)S1P的生成及分泌，S1P進(jìn)一步激活下游NF-κB等信號(hào)通路，可造成促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子之間的失衡，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥免疫應(yīng)答，加劇炎性反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。近年王曉楠等[26]研究發(fā)現(xiàn)，SphK1/S1P信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，導(dǎo)致下游炎癥因子高表達(dá)，參與了經(jīng)氧化低密度脂蛋白(oxidation low lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，表明SphK1/S1P通路與炎癥有關(guān)的血管損傷和動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程相關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，KLF2可能通過(guò)調(diào)控SphK1/S1P信號(hào)途徑參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)AIS的發(fā)生，然而具體的分子機(jī)制還需通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的深入探究，闡明KLF2和SphK1/S1P信號(hào)對(duì)AIS神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用，可為臨床研究及治療提供更多參考。

綜上所述，AIS血清中KLF2表達(dá)顯著降低，與患者的腦梗死體積及預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)，對(duì)評(píng)估AIS病情嚴(yán)重程度及預(yù)測(cè)患者預(yù)后具有臨床指導(dǎo)意義。血清KLF2表達(dá)與IL-6，SphK1水平存在一定相關(guān)性，其可能通過(guò)SphK1/S1P途徑參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)AIS發(fā)生發(fā)展。