大鯢活性物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展

劉金洋，翟興月，羅 嬋，陳 平，李 偉，，佟長青

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，遼寧大連 116023；3.長沙金馳科研有限公司，湖南長沙 410000）

0 引言

大鯢（Andrias davidianus），又名娃娃魚，屬隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀動(dòng)物。大鯢作為一種傳統(tǒng)的藥用動(dòng)物，其肌肉、皮膚、骨骼均可食用、入藥。中醫(yī)認(rèn)為大鯢性甘平，可補(bǔ)氣益血、滋陰補(bǔ)腎[1]。大鯢具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在食用、醫(yī)療、保健等方面具有廣闊的開發(fā)前景，各界頗為關(guān)注。為了探究大鯢體內(nèi)的營養(yǎng)成分，已有研究對(duì)大鯢的各個(gè)部位進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)大鯢體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、氨基酸及脂肪酸等多種營養(yǎng)成分[2]。多不飽和脂肪酸可預(yù)防心腦血管疾病，提高腦細(xì)胞活性，增強(qiáng)記憶力和思維能力[3]。大鯢肌肉和尾脂中含有大量脂肪，其中多種不飽和脂肪酸的含量大于70%[4-5]，除以上營養(yǎng)成分外，大鯢還含有膠原蛋白、糖肽、活性肽和透明質(zhì)酸等多種功能性成分，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化性、抗疲勞、抗癌及降血糖等作用[6-7]。

研究發(fā)現(xiàn)，低分子量抗氧化肽的活性更強(qiáng)，與其親本蛋白質(zhì)相比，分子量較低的肽更容易靠近自由基，從而抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化[8]。Yi-ping Y等人[9]在對(duì)蓮子蛋白水提物的研究中發(fā)現(xiàn)，分子量最低組分肽的抗氧化活性明顯強(qiáng)于分子量高的組分。此外，氨基酸組成對(duì)生物活性的影響也很重要。序列中疏水氨基酸的含量高則抗氧化活性較強(qiáng)；序列中的酸性氨基酸和堿性氨基酸可以螯合金屬離子展現(xiàn)高抗氧化活性[10]。部分抗菌肽含有親水與疏水2 種基團(tuán)，二者相互作用可影響抗菌活性，親水基團(tuán)易與水結(jié)合，疏水基團(tuán)則易與脂質(zhì)結(jié)合，從而保證抗菌肽與細(xì)胞膜更好的結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜解體使細(xì)菌死亡[11]。二級(jí)結(jié)構(gòu)與多肽的抗菌活性也存在關(guān)聯(lián)，主要分為α 螺旋型、β 折疊型、環(huán)形及伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類，不同二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)抗菌肽的影響各有差異[8]。

為充分利用養(yǎng)殖大鯢資源，使其在醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域充分發(fā)揮功效，對(duì)大鯢功能性成分的深入研究十分必要。目前，有許多研究者對(duì)大鯢體內(nèi)的活性成分及其功效進(jìn)行了研究，對(duì)大鯢膠原蛋白、活性肽、脂肪及透明質(zhì)酸等活性物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)行綜述，以期為大鯢活性物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的深入研究和大鯢精深加工產(chǎn)品研發(fā)提供一定的參考。

1 活性物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系研究現(xiàn)狀

1.1 膠原蛋白與明膠

膠原蛋白廣泛應(yīng)用于化妝品、保健品、醫(yī)療等方面。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，包含一個(gè)或多個(gè)膠原蛋白三螺旋構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域，三螺旋結(jié)構(gòu)由3 條多肽鏈組成，其氨基酸序列由Gly-X-Y 重復(fù)序列組成。目前，膠原蛋白主要來源于陸生動(dòng)物，由于疾病的產(chǎn)生，導(dǎo)致陸生動(dòng)物膠原蛋白存在風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。因此，從水產(chǎn)動(dòng)物中提取膠原蛋白具有低抗原性、高生物相容性及高生物降解性，可作為陸生動(dòng)物膠原蛋白的替代來源[14]。大鯢皮中膠原蛋白含量為28.86%，是提取膠原蛋白的良好原料[15]。大鯢膠原蛋白具有三股螺旋結(jié)構(gòu)及2 種不同的α 鏈（α1、α2），屬于I 型膠原蛋白[16]。楊碧仙等人[17]研究發(fā)現(xiàn)大鯢皮膠原蛋白對(duì)DPPH·和·OH 有較好的清除作用，IC50值分別為9.96，7.79 mg/mL，具有較好的抗氧化能力。將大鯢皮膠原蛋白酶解后，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白和膠原蛋白肽均具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，且同樣具備抗氧化能力[16]，三股螺旋結(jié)構(gòu)中含有肽鏈間的活性基團(tuán)形成的氫鍵，從而保證抗氧化能力的穩(wěn)定發(fā)揮[16-18]。因此，大鯢膠原蛋白及其水解肽的抗氧化性與其特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。

明膠是一種可溶性膠原蛋白化合物，其結(jié)構(gòu)與膠原蛋白相近[19]。利用熱水浸提法從大鯢皮中提取的明膠中Gly、Pro、Glu 和Ala 的含量相對(duì)較高[20]，疏水氨基酸的含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)[10]。酶解大鯢明膠后發(fā)現(xiàn)，在樣品質(zhì)量濃度為6.99 mg/mL 條件下，大鯢明膠肽對(duì)DPPH·的清除率為50%[21]。從氨基酸組成和結(jié)構(gòu)上看，膠原蛋白與明膠均含有疏水性氨基酸且為三股螺旋結(jié)構(gòu)，使其具有一定的自由基清除能力。

1.2 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸，也稱玻尿酸，是一種非硫酸化的糖胺聚糖，其雙糖單元由N- 乙酰-D- 葡萄糖胺與D-葡萄糖醛酸構(gòu)成，具有三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[22]。透明質(zhì)酸由細(xì)胞膜上的膜蛋白合成，是多種細(xì)胞組織的重要組分，透明質(zhì)酸具有抗氧化活性[23]。高瑞昌等人[24]通過酶解法制備羅非魚眼透明質(zhì)酸，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸分子量越低，其DPPH·的清除能力及還原力越強(qiáng)。于?；鄣热薣25]通過酶解法提取大鯢黏液中的透明質(zhì)酸，其分子量為4.85×106Da，可體外清除·OH、DPPH·和ABTS+·、還原Fe3+，具有一定的抗氧化能力。此前有研究表明，膠原蛋白對(duì)DPPH·的清除率為52.6%，將分子質(zhì)量為1～10×104U 的透明質(zhì)酸與膠原蛋白按2∶8 復(fù)配后，其對(duì)DPPH·清除率明顯提高，最高值為76.4%[26]。透明質(zhì)酸在與大鯢活性肽形成組合物后，大鯢活性肽對(duì)ABTS+·清除率顯著提高，但對(duì)DPPH·清除率無顯著影響，由于2 種方法使用的溶劑不同，DPPH·使用乙醇溶解，而ABTS+·使用水溶解，水溶液的環(huán)境下，大鯢活性肽可利用透明質(zhì)酸的三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而提升其抗氧化性[27]。

1.3 脂肪

大鯢脂肪中的不飽和脂肪酸不僅具有抗氧化、降血脂及預(yù)防心血管疾病等功效，還可以有效治療燙傷和燒傷[28]。人體無法合成二十碳五烯酸（Timnodonic acid，EPA） 與二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），二者均是必需脂肪酸，是ω-3 長鏈多不飽和脂肪酸和α- 亞麻酸的代謝產(chǎn)物[29]。DHA 和EPA 具有良好的降血壓和抗心腦血管疾病的作用[30]。王苗苗等人[31]利用酶解法從大鯢尾部提取的脂肪酸品質(zhì)較好，EPA 和DHA 總量較高，證明大鯢油具有預(yù)防心血管疾病的作用。王寒等人[32]證明了大鯢尾部油脂具有一定的抗氧化能力。較低的ω-6/ω-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成比可以改善高脂喂養(yǎng)大鼠脂肪代謝與抗氧化能力[33]。大鯢尾部油脂脂肪酸中ω-6/ω-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成比為2.45∶1[31]。李良玉等人[34]在對(duì)小米油抗氧化活性研究中發(fā)現(xiàn)，小米油中主要脂肪酸為棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、花生酸和亞麻酸。羅秦等人[35]對(duì)粗大鯢油精制后，利用氣相色譜法共檢測出25 種脂肪酸，其中主要的脂肪酸為油酸、亞油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、DHA、硬脂酸和α - 亞麻酸。小米油和大鯢油中不飽和脂肪酸含量較高，且不飽和脂肪酸組成相似。由此推斷，大鯢尾部油脂抗氧化性與其脂肪酸中ω-6/ω-3 多不飽和脂肪酸構(gòu)成比有關(guān)與不飽和脂肪酸含量及組成有關(guān)。

1.4 活性肽

1.4.1 低聚糖肽

大鯢體表黏液是大鯢低聚糖肽的主要來源，低聚糖肽中蛋白和糖通過O- 或N- 糖肽鍵連接，含量分別為80.01%和15.15%[36]。低聚糖肽中的糖包括氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和唾液酸[37]。大鯢低聚糖肽含有多種氨基酸，其中Thr、Glx、Asx 的含量較高，Ser 含量最低，因水解過程中Trp 被破壞而未被檢出[38]。大鯢低聚糖肽具有抑制腫瘤生長、自由基清除自由基、免疫調(diào)節(jié)作用等多種生物功能[39-40]。有研究制得了分子量小于4000 Da 的大鯢低聚糖肽，其糖鏈通過N- 乙酰半乳糖胺通過O- 糖肽鍵連接到Ser 或Thr 上，具有-Galβ1-3GalNAcα-O- Ser/Thr 結(jié)構(gòu)[41]，存在O- 糖肽鍵的糖肽具有免疫活性，大鯢低聚糖肽中存在O- 糖肽鍵，這與制得的-Galβ1-3Gal NAcα-O-Ser/Thr 結(jié)構(gòu)存在關(guān)聯(lián)。

1.4.2 抗氧化肽

自由基是生物在體內(nèi)正常反應(yīng)產(chǎn)生的不穩(wěn)定、極易與其他分子發(fā)生反應(yīng)且具有強(qiáng)氧化性的物質(zhì)[42]。任何過量的自由基都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病和癌癥等疾病。疏水性氨基酸（如Met、Trp、Phe 等） 會(huì)影響肽的抗氧化活性[43]。若多肽的N- 端含有某些疏水氨基酸（Val、Leu），則抗氧化活性較強(qiáng)，若多肽序列C- 端相鄰氨基酸殘基為疏水性低的氨基酸，則多肽的抗氧化性將會(huì)增強(qiáng)[44]；一些含有堿性氨基酸殘基（His、Lys）和主要包含酸性氨基酸殘基（Glu、Asp） 的多肽同樣具有較強(qiáng)的抗氧化活性[45]。Li Y W 等人[46]研究發(fā)現(xiàn)，多肽的抗氧化活性主要與N- 端氨基酸殘基與中心氨基酸有關(guān)，若N- 端氨基酸殘基是高疏水、低電子的氨基酸（如Ala、Gly、Val、Leu），中心氨基酸是高氫鍵特性氨基酸（如堿性氨基酸），則多肽抗氧化活性較強(qiáng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，肽鏈中存在Gly 的重復(fù)序列可使多肽中形成更多的分子內(nèi)氫鍵，使其抗氧化活性增強(qiáng)[47]，與Li Y W 等人[46]的研究結(jié)果存在相似之處；此外，芳香族氨基酸（Tyr 和Phe） 可通過電子轉(zhuǎn)移使活性氧保持穩(wěn)定；His 和Met 的存在也可以增強(qiáng)多肽的抗氧化活性[48]。大鯢多肽在體外抗氧化模型中表現(xiàn)出較好的抗氧化能力[49]，李偉等人[50]從大鯢肉中酶解得到的活性肽具有顯著的抗氧化活性，檢測出氨基酸序列為HDCDLLR 和LEAQSRPFDAK 的2 條肽鏈中存在多個(gè)疏水氨基酸和堿性氨基酸，與上述研究結(jié)果中對(duì)于疏水氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸的存在可增強(qiáng)多肽的抗氧化活性有一定的關(guān)聯(lián)。胡廷等人[49]研究發(fā)現(xiàn)大鯢酶解物4 個(gè)超濾組分中ADPP-I 對(duì)·O2-和·OH 的清除效果好于大鯢活性肽，其主要氨基酸為Glu 和Asp，二者皆為酸性氨基酸，酸性氨基酸的電子可抑制自由基[10]，所以抗氧化活性較好。且有研究表明，C- 端相鄰的氨基酸殘基為疏水性較低的氨基酸（Arg、Glu、Asp 等） 的多肽抗氧化活性較強(qiáng)。此外，ADPP-I 中還檢測出大量酸性氨基酸和芳香族氨基酸[52]。由此表明，ADPP-I 抗氧化性與氨基酸組成有關(guān)。

1.4.3 抗菌肽

抗菌肽廣泛存在于生物體內(nèi)，是天然存在的免疫應(yīng)答物質(zhì)，可選擇性作用于微生物并將其降解成小分子物質(zhì)?？咕呐c細(xì)菌的細(xì)胞膜之間的相互作用可破壞細(xì)菌的脂質(zhì)雙分子層，使細(xì)胞膜解體從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[53]。任婷等人[54]對(duì)大鯢血源抗菌肽Andricin B 的氨基酸組成進(jìn)行分析，其中帶有Lys 和Arg，二者皆為正電荷氨基酸殘基，并且不含負(fù)電荷氨基酸，表明該抗菌肽為正電荷型抗菌肽。這些研究結(jié)果表明陽離子型氨基酸可以影響抗菌肽的活性。此外抗菌肽的疏水性也有助于其插入細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜相互作用，疏水性增強(qiáng)可提高抗菌活性，可幫助抗菌肽進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞影響其正常代謝，最終殺死細(xì)菌[55]。大鯢血源抗菌肽Andricin B 與大鯢皮膚抗菌肽Andricin 01 均為疏水性多肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)皆為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[54-56]。李偉等人[41]提取的大鯢低聚糖肽抗菌效果顯著，經(jīng)高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）檢出該抗菌肽含有17 種氨基酸，其中Asx、Thr、Glx、Pro、Leu 含量較高，富含疏水氨基酸（如Pro、Leu 等）。由此可見，陽離子型、疏水性和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)與抗菌效果存在聯(lián)系。

目前，對(duì)于多肽生物活性構(gòu)效關(guān)系的研究主要集中于氨基酸組成和多肽序列方面，對(duì)于肽鏈的結(jié)構(gòu)、肽鏈長短對(duì)多肽的生物活性的影響程度并未進(jìn)行更深入的探討，若能充分掌握大鯢活性肽的影響因素，未來在活性肽制備方面不僅可以采用化學(xué)水解和酶水解等常用的方法，還可以通過化學(xué)合成法精準(zhǔn)制備出所需要的活性肽。

1.5 色素

楊慧等人[57]采用堿溶- 酸提取法提取大鯢皮膚黑色素，發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚黑色素由真黑色素和脫黑色素2 種色素組成。真黑色素是由5,6- 二羥基吲哚-2-羧酸（DHICA） 黑色素和5,6- 二羥基吲哚(DHI)黑色素聚合而成，脫黑色素是由2-S- 半胱氨酸和5-S-半胱氨酸聚合脫羧形成[57]。進(jìn)一步研究其功能性，發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚色素對(duì)·O2-的清除效果較強(qiáng)，底物濃度相同時(shí)，清除強(qiáng)度明顯高于維C（Vitamin C，VC），但對(duì)·OH 的清除率卻明顯低于維C[58]。有研究證明，羧酸和酚類的O-H 伸縮振動(dòng)與其清除自由基和金屬螯合能力有關(guān)，進(jìn)而有助于減緩脂質(zhì)氧化過程[59]。由此推測，大鯢皮膚黑色素的抗氧化性與其結(jié)構(gòu)中的羧酸和酚類有關(guān)。

2 結(jié)語

近年來，大鯢活性物質(zhì)的制備、組成、結(jié)構(gòu)及生物活性的研究已取得了一定進(jìn)展?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大鯢活性物質(zhì)具有抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種作用。大鯢活性物質(zhì)的生物活性主要受分子量大小和分子結(jié)構(gòu)的影響。組成及結(jié)構(gòu)研究是探究生物活性的前提，但目前對(duì)大鯢抗腫瘤、抗疲勞和降血糖等其他生物活性的構(gòu)效關(guān)系尚不明確，不利于大鯢活性物質(zhì)精加工的發(fā)展。目前，大鯢活性物質(zhì)的體內(nèi)研究較少，在投入市場前，應(yīng)明確所研究物質(zhì)的生物活性在生物體內(nèi)是否有所改變。對(duì)于其他活性構(gòu)效關(guān)系的仍為空白，應(yīng)更加深入研究大鯢其他活性的構(gòu)效關(guān)系，可以從已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的其他來源活性物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系的研究角度進(jìn)行研究。明確活性物質(zhì)的各種生物活性的組成及結(jié)構(gòu)后，便可為發(fā)現(xiàn)新的生物活性、合成目標(biāo)產(chǎn)物及工作機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。影響活性物質(zhì)功能性的因素有分子質(zhì)量、組成及結(jié)構(gòu)特征等，活性物質(zhì)的提取方法與所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能息息相關(guān)。