基于PLS-DA的IgG介導(dǎo)的雞肉不耐受差異蛋白篩選及通路識(shí)別*

趙思淵 孫 琳 田 偉 劉美娜

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系(150081)

【提 要】 目的 篩選雞肉不耐受患者與健康人之間的差異蛋白,富集分析識(shí)別差異蛋白的相關(guān)通路,為探討雞肉不耐受發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。方法 收集雞肉不耐受患者及健康對照的血清樣本,利用DIA技術(shù)平臺(tái)對樣本進(jìn)行蛋白組學(xué)檢測;PLS-DA結(jié)合PPI分析篩選具有相互作用的蛋白質(zhì),Cytoscape獲得雞肉不耐受患者與對照組間的差異蛋白;GO和KEGG富集分析獲得差異蛋白的生物學(xué)通路與代謝通路。結(jié)果 血清樣本的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)檢測結(jié)果,共獲得2210種蛋白質(zhì)。PLS-DA分析篩選出和雞肉不耐受相關(guān)的蛋白質(zhì)786個(gè),結(jié)合蛋白互作分析獲得PPI網(wǎng)絡(luò),聚類后得到兩個(gè)主要的模塊:cluster1和cluster2;cluster1包括18個(gè)蛋白質(zhì),cluster 2包括12個(gè)蛋白質(zhì)。兩模塊蛋白質(zhì)進(jìn)行重要性排序,篩選出雞肉不耐受患者與健康對照間的差異蛋白為:ORM1、FGB、SERPINF2、HRG、A2M、ORM2和QSOX1。前五個(gè)為上調(diào)蛋白質(zhì),后兩個(gè)為下調(diào)蛋白質(zhì)。cluster1評分為10.12,GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要參與血小板脫顆粒、肽鏈內(nèi)切酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)通路,KEGG分析富集到補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路;cluster 2評分6.00,共包括12個(gè)蛋白質(zhì),GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白與急性期反應(yīng)、血小板脫顆粒、固有免疫應(yīng)答等生物學(xué)通路有關(guān),KEGG分析富集到補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、阮病毒病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病通路。結(jié)論 本研究篩選出7個(gè)與IgG介導(dǎo)的雞肉不耐受相關(guān)的差異蛋白,其參與的生物學(xué)和代謝通路與機(jī)體免疫、炎癥過程有關(guān),在免疫、炎癥發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用,將為探討雞肉不耐受發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

食物不耐受是一種以IgG介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病,人群患病率20%左右[1],其中,雞肉不耐受的發(fā)生較為常見。雞肉不耐受患者食用雞肉類食物會(huì)引起一系列胃腸道癥狀及肥胖、高血壓、偏頭痛等疾病[2],長期食用甚至累及消化、神經(jīng)、心血管等全身多個(gè)系統(tǒng),呈現(xiàn)出不同的臨床癥狀[3]。雞肉不耐受的治療以飲食干預(yù)為主,只有部分患者可從飲食干預(yù)中獲益[4]。食物不耐受的發(fā)生是由于未被吸收的蛋白質(zhì)與IgG結(jié)合的免疫復(fù)合物引起[5],從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度出發(fā),識(shí)別雞肉不耐受差異蛋白及通路,對于雞肉不耐受發(fā)生機(jī)制及其治療有重要意義。因此,本研究利用PLS-DA方法結(jié)合蛋白質(zhì)互作分析篩選雞肉不耐受患者的差異蛋白,富集分析解釋差異蛋白并獲得差異蛋白的生物學(xué)及代謝通路,為雞肉不耐受的治療奠定基礎(chǔ)。

方 法

1.研究對象

研究樣本來源于某醫(yī)院過敏反應(yīng)科患者,根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測結(jié)果,檢測值<50IU/ml為陰性。50～100IU/ml為輕度敏感,100～200IU/ml為中度敏感,超過200IU/ml 高度敏感。排除其他食物IgG抗體陽性患者,選擇雞肉不耐受的患者7例作為病例組;對照組為年齡、性別與患者匹配一致的健康人13例,IgG檢測結(jié)果見表1。收集研究對象血液樣本并離心,取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。

表1 雞肉不耐受患者及對照組IgG檢測結(jié)果

2.蛋白組學(xué)檢測及數(shù)據(jù)處理

利用數(shù)據(jù)非依賴性采集(data-independent acquisition,DIA)技術(shù)平臺(tái)對血清樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測,DIA技術(shù)是目前最常用的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析質(zhì)譜掃描技術(shù),能夠?qū)C-MS/MS質(zhì)譜儀的全掃描范圍劃分成若干個(gè)窗口,并將通過窗口的全部肽段離子進(jìn)行碎裂,利用二級(jí)質(zhì)譜檢測碎片離子的信號(hào),獲得離子全部信息,有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性,適合于大樣本的復(fù)雜數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化及標(biāo)度化處理:采用總離子強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化法使得各樣本數(shù)據(jù)有可比性;通過自標(biāo)度化法,將所有蛋白質(zhì)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差都設(shè)為1,避免由于蛋白質(zhì)表達(dá)量的絕對差異造成對低濃度代謝物數(shù)據(jù)的掩蓋。

3.差異蛋白篩選及通路識(shí)別

偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)[6]是一種有監(jiān)督的判別分析方法,利用偏最小二乘回歸的思想,進(jìn)行數(shù)據(jù)降維,并建立回歸模型,綜合應(yīng)用相關(guān)分析、主成分分析(principal components analysis,PCA)和多元線性回歸等方法,建立蛋白表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型,實(shí)現(xiàn)對樣品類別的預(yù)測;繪制PLS-DA評分圖,利用PLS-DA模型中變量投影重要度(variable important for the projection,VIP)衡量各蛋白質(zhì)表達(dá)模式對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力,通過VIP值>1且P≤0.05選擇與雞肉不耐受相關(guān)的蛋白質(zhì)。利用STRING網(wǎng)站繪制蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,可觀察到蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系,篩選與雞肉不耐受相關(guān)的蛋白質(zhì)。Cytoscape軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)聚類得到重要模塊,通過重要性排序獲得差異蛋白。

利用DAVID網(wǎng)站對獲得的差異蛋白進(jìn)行GO富集分析[7]和KEGG通路富集分析[8],獲得包括生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞定位(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)在內(nèi)的差異蛋白注釋信息以及機(jī)體新陳代謝、遺傳、疾病等通路。

結(jié) 果

1.差異蛋白篩選結(jié)果

雞肉不耐受患者和健康者的血清樣本通過蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)檢測及標(biāo)準(zhǔn)化、標(biāo)度化處理,共獲得2210種蛋白質(zhì)。在事先確定樣本的類型歸屬條件下,通過對該數(shù)據(jù)進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA分析可以最大程度顯示組間差異,PLS-DA評分圖顯示雞肉不耐受組與對照組明顯分離,見圖1。

圖1 雞肉不耐受與對照組PLS-DA評分

PLS-DA模型經(jīng)過200次置換檢驗(yàn),顯示其具有較好的解釋能力(R2=0.846)和預(yù)測能力(Q2=-0.0548),見圖2。利用Bonferroni法對兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)得到的P值進(jìn)行校正,火山圖見圖3。根據(jù)P值≤0.05結(jié)合VIP值大于1篩選出786個(gè)與雞肉不耐受相關(guān)蛋白質(zhì),其中,上調(diào)蛋白質(zhì)167個(gè),下調(diào)蛋白質(zhì)619個(gè)。

圖3 雞肉不耐受組與對照組的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P值火山圖

2.蛋白質(zhì)互作分析

利用STRING網(wǎng)站對786個(gè)雞肉不耐受相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白互作分析,共得到67個(gè)具有相互作用的蛋白質(zhì)。通過Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)聚類獲得兩個(gè)評分較高的蛋白質(zhì)模塊:cluster1、cluster 2。cluster 1包括18個(gè)蛋白質(zhì),評分10.12,見圖4(a); cluster 2包括12個(gè)蛋白質(zhì),評分為6.00,見圖4(b)。進(jìn)行重要性排序后,兩模塊篩選出排名前7位的蛋白質(zhì),分別為:ORM1、FGB、SERPINF2、A2M、QSOX1、HRG、ORM2。篩選的7個(gè)蛋白質(zhì)中有5個(gè)在病例組上調(diào),分別為ORM1、FGB、SERPINF2、HRG、A2M;2個(gè)在病例組下調(diào),即ORM2和QSOX1。

圖4 兩蛋白質(zhì)模塊雞肉不耐受組與對照組的蛋白質(zhì)互作圖

3.通路識(shí)別結(jié)果

兩個(gè)蛋白質(zhì)模塊分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析。cluster 1共包括18個(gè)蛋白質(zhì),GO分析表明差異蛋白與血小板脫顆粒、肽鏈內(nèi)切酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)通路有關(guān),見圖5(a),KEGG分析富集到補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路;Cluster 2共包括12個(gè)蛋白質(zhì),GO富集分析結(jié)果為急性期反應(yīng)、血小板脫顆粒、固有免疫應(yīng)答等生物學(xué)通路,見圖5(b),KEGG分析富集到補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、阮病毒病以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病通路。

圖5 兩個(gè)蛋白質(zhì)模塊GO富集分析結(jié)果

討 論

雞肉不耐受的發(fā)生在人群中較為常見,飲食干預(yù)并非對所有患者有效,從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度篩選雞肉不耐受患者差異蛋白,能夠?yàn)槠浒l(fā)生機(jī)制和治療提供新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)具有高維、高噪聲、小樣本的特點(diǎn),通過PLS-DA將蛋白數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為誤差盡可能小的低維空間[9];篩選后得到的特征變量不僅能很好的概括原始變量的信息,而且有很強(qiáng)的解釋能力。本研究利用PLS-DA方法,結(jié)合蛋白質(zhì)互作分析,篩選出7個(gè)雞肉不耐受患者差異蛋白,在病例組中上調(diào)蛋白質(zhì)有5個(gè),下調(diào)蛋白質(zhì)有2個(gè)。

在上調(diào)蛋白質(zhì)中,一型類黏蛋白(ORM1)在機(jī)體遭受感染和炎癥等刺激時(shí)升高,可作為炎癥出現(xiàn)和消退的標(biāo)志[10],還可以轉(zhuǎn)運(yùn)藥物、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng),保護(hù)毛細(xì)血管屏障、調(diào)節(jié)能量平衡[11],維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。α2-巨球蛋白(A2M)與細(xì)胞因子IL-6結(jié)合可參與機(jī)體急性期反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程[12]。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPINF2)作為調(diào)控物,調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡,參與機(jī)體免疫反應(yīng),對機(jī)體補(bǔ)體形成、纖溶、細(xì)胞內(nèi)蛋白水解等生化反應(yīng)和生理功能有重要作用[13]。富組氨酸糖蛋白(HRG)能夠與不同的配體結(jié)合發(fā)揮不同的功能,包括纖溶、血液凝固、免疫復(fù)合物的清除等;另外也可與IgG結(jié)合阻止免疫復(fù)合物的產(chǎn)生[14]。5個(gè)差異蛋白參與了機(jī)體免疫反應(yīng),提示雞肉不耐受的發(fā)生機(jī)制可能與免疫、炎癥有關(guān);另外,2個(gè)下調(diào)蛋白QSOX1和ORM2與免疫的關(guān)系還未明確,有待進(jìn)一步研究。

雞肉中含有豐富的牛磺酸和尼克酸,能夠增加脂質(zhì)和膽固醇的溶解性,促進(jìn)脂類在機(jī)體的吸收,而脂質(zhì)代謝對免疫系統(tǒng)和炎癥又有一定的影響[15],抑制炎癥的發(fā)生。機(jī)體也可能由于缺乏水解某種蛋白質(zhì)的酶引起一系列的變化,如激活炎癥、免疫調(diào)節(jié)、凝血等生物學(xué)過程,導(dǎo)致雞肉不耐受。通路富集結(jié)果顯示,補(bǔ)體系統(tǒng)能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和炎癥等功能;凝血酶能夠?qū)⒖扇苄訤g轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白凝塊,進(jìn)而在穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)過程中起調(diào)節(jié)作用,提示雞肉不耐受的發(fā)生與機(jī)體識(shí)別和排除“異己”的生理反應(yīng)有關(guān)。從富集分析結(jié)果中解釋了蛋白質(zhì)的部分生物學(xué)功能,還有多種表達(dá)不明顯的生物學(xué)功能,例如纖溶酶原激活的負(fù)調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)、補(bǔ)體激活、血管生成的正調(diào)節(jié)等。纖溶酶原活性的負(fù)調(diào)節(jié)與血栓的形成有關(guān),研究表明免疫平衡崩潰也可引起血栓[16];補(bǔ)體的激活可引起一系列的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[17]。雖然這些生物學(xué)作用在本研究中未明顯表達(dá),但也為探討雞肉不耐受的發(fā)生機(jī)制提供了一定的潛在依據(jù)。

綜上,本研究針對IgG介導(dǎo)的雞肉不耐受患者蛋白表達(dá)數(shù)據(jù),利用PLS-DA方法,結(jié)合蛋白互作分析以及富集分析,識(shí)別差異蛋白及其通路。篩選獲得的差異蛋白可能是雞肉不耐受發(fā)生的關(guān)鍵,生物學(xué)和代謝通路提示雞肉不耐受的發(fā)生與機(jī)體免疫、炎癥等過程有關(guān)。本研究為研究IgG介導(dǎo)的雞肉不耐受發(fā)生機(jī)制提供了依據(jù)。