非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠法提取和磁珠法提取的差異

王培興 謝青云 曾江 張潤(rùn)蘭 彭海英

基金項(xiàng)目：江西省贛州市衛(wèi)健委課題（2020-2-27）

作者簡(jiǎn)介：王培興，男，本科，主管技師。

【摘要】 目的 探討非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取的差異。方法 選擇2021年1月—2022年4月贛州市第五人民醫(yī)院就診的68例非結(jié)核分枝桿菌感染患者為對(duì)象，采集非結(jié)核分枝桿菌患者痰液或肺部灌洗液，分別采用玻璃珠提取法（觀察組）和磁珠法（對(duì)照組）提取核酸，在熒光定量PCR儀檢測(cè)下非結(jié)核分枝桿菌核酸為陽(yáng)性，比較2組檢出率。結(jié)果 觀察組玻璃珠法提取檢出率為77.94%略高于對(duì)照組磁珠法75.00%，但是2種提取方法檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。結(jié)論 非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取差異較小，但玻璃珠法提取檢出率略高，可為臨床診療提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 非結(jié)核分枝桿菌；玻璃珠提取法；磁珠法；熒光定量PCR儀

中圖分類號(hào)：R446.1? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1721（2023）31-0102-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.31.034

非結(jié)核分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌及麻風(fēng)分枝桿菌以外的分支桿菌，與結(jié)核分枝桿菌相比，具有其獨(dú)特的特點(diǎn)，能耐受臨床常用的抗結(jié)核藥物，但是病菌生長(zhǎng)條件較為嚴(yán)格，對(duì)于生長(zhǎng)溫度的耐受性亦不如結(jié)核分枝桿菌[1]。非結(jié)核分枝桿菌能引起結(jié)核樣病變，且抗原與結(jié)核分枝桿菌存在交叉，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。磁珠法是分子診斷實(shí)驗(yàn)中常用的提取方法，該方法能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、大批量的實(shí)驗(yàn)操作，具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、安全無毒及符合環(huán)保理念等優(yōu)點(diǎn)[2]。磁珠與核酸的特異性結(jié)合，能提高核酸的純度及濃度。該提取方法具有傳統(tǒng)DNA提取方法難以比擬的優(yōu)勢(shì)，廣泛用于血液、組織、拭子、鼻咽分泌物等樣本中[3]。而玻璃珠提取法具有高分散性、流動(dòng)性較好的特點(diǎn)，質(zhì)量較輕，具有良好的吸水性、絕緣性、化學(xué)性及導(dǎo)熱性，且硬度強(qiáng)度均較好，用于核酸檢測(cè)中精度和準(zhǔn)確度較高[4]。但是，臨床上非結(jié)核分支桿菌核酸提取過程中選擇何種方法缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究以非結(jié)核分支桿菌感染患者為對(duì)象，探討非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取的差異，報(bào)告

如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年1月—2022年4月贛州市第五人民醫(yī)院收治的68例非結(jié)核分枝桿菌感染患者，男性27例，女性41例，年齡33～82歲，平均（67.96±6.79）歲；體質(zhì)量指數(shù)（body massindex，BMI）18～29 kg/m2，平均（22.51±3.59）kg/m2；治療方式，門診治療3例，住院治療65例；科室來源，感染科門診

1例，胸外科2例，結(jié)核科門診2例，感染科23例，骨科2例，呼吸危重二區(qū)7例，結(jié)核科一單元9例，結(jié)核科二單元17例，結(jié)核科三單元5例。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合臨床關(guān)于非結(jié)核分枝桿菌感染相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6]，并最終獲得確診；均能配合完成標(biāo)本采集，標(biāo)本類型以灌洗液、傷口分泌物、痰液及支氣管刷檢為主，患者均可耐受；病情尚穩(wěn)定，能進(jìn)行溝通和交流。排除標(biāo)準(zhǔn)：認(rèn)知障礙、確診的器質(zhì)性疾病或伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者；中途放棄診療或伴有全身感染性疾病者；檢查前行抗結(jié)核方案治療或中轉(zhuǎn)上一級(jí)醫(yī)院者。

1.3 方法 采集非結(jié)核分枝桿菌患者痰液或肺部灌洗液，分別采用玻璃珠提取法（觀察組）和磁珠法（對(duì)照組）提取核酸，在熒光定量PCR儀檢測(cè)下非結(jié)核分枝桿菌核酸為陽(yáng)性，比較2組檢出率。

1.3.1 儀器設(shè)備及試劑 全自動(dòng)核酸提取儀Smart32 型，購(gòu)自于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；直徑為0.5 mm玻璃珠，購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑，購(gòu)自于Invitrogen公司；分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），購(gòu)自于成都博奧晶芯生物科技有限公司（國(guó)械注準(zhǔn)20173401341）。

1.3.2 磁珠法 （1）加樣。取灌洗液、傷口分泌物、痰液及支氣管刷檢等標(biāo)本，連同蛋白酶K置入樣本中進(jìn)行處理，借助蛋白酶K的輔助作用，消化蛋白質(zhì)為不同的小片段，加速核酸與蛋白酶的分離。（2）上機(jī)。待樣本處理完畢后，將樣本處理板放入全自動(dòng)核酸提取儀（Smart32型）及安裝磁力套。全自動(dòng)核酸提取儀帶有磁力棒，借助磁力棒吸附磁珠，并在使用前常規(guī)安裝磁力套，避免樣本之間發(fā)生交叉污染。（3）裂解及結(jié)合。借助機(jī)械臂運(yùn)動(dòng)及加熱實(shí)現(xiàn)反應(yīng)液的充分混合均勻，促進(jìn)細(xì)胞的裂解，并釋放核酸；釋放磁珠并充分混勻后，利用磁珠在高鹽低pH值下對(duì)核酸具有較強(qiáng)的親和力特點(diǎn)，完成核酸的吸附。（4）洗滌、干燥及洗脫。機(jī)械臂移動(dòng)到洗滌液中，充分混合均勻后，去除各種雜質(zhì)；待上述操作完畢后，靜置機(jī)械臂5 min，使得磁力棒吸附的磁珠晾干。機(jī)械臂移動(dòng)到洗脫液中，充分混合均勻后，實(shí)現(xiàn)核酸和磁珠的分離，最終獲得的洗脫液即提純后的核酸[7]。

1.3.3 玻璃珠提取法 （1）樣本處理。常規(guī)加入和痰等量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液，充分振蕩混合均勻后，室溫下靜置30 min（對(duì)于較濃的痰液可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間）。取1 mL液化后的液體，放入1.5 mL的無菌離心管中，離心5 min，12 000 r/min，去除上層清液；加入洗液1 mL，充分渦旋后離心5 min，12 000 r/min，去除上層清液。加入核酸提取液50 μL，充分渦旋后加入核酸提取管中，放入核酸提取儀（Extractor36），最大轉(zhuǎn)速下振蕩5 min。95 ℃水浴鍋中放置5 min，離心1 min，5 000 r/min，備用，在（-20±5）℃下保存1個(gè)月。（2）陰性對(duì)照品準(zhǔn)備。取陰性對(duì)照品50 μL，將其放置在核酸提取管中，放入核酸提取儀，最大速度下振蕩

5 min，水浴鍋中放置5 min，離心1 min，5 000 r/min，置于-20 ℃冰箱中，備用。（3）陽(yáng)性對(duì)照品的準(zhǔn)備。精確程度陽(yáng)性對(duì)照品50 μL，將其放置在核酸提取管中，放入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速下振蕩5 min，95 ℃下水浴鍋中放置5 min，操作完畢后振蕩1 min，5 000 r/min，置于-20 ℃冰箱中，備用。（4）擴(kuò)增試劑的準(zhǔn)備。取擴(kuò)增反應(yīng)液，將其放置在冰盒上，解凍，每個(gè)樣本取2 μL，加入擴(kuò)增反應(yīng)液管中，每次檢測(cè)時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照，加入量均為2 μL。（5）PCR擴(kuò)增程度。37 ℃下300 s，循環(huán)數(shù)1；94 ℃下180 s，循環(huán)數(shù)1；94 ℃下15 s、60 ℃下30 s，循環(huán)數(shù)40；50 ℃下10 s，循環(huán)數(shù)1。選擇FAM與HEX通道，熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃ 30 s。根據(jù)分析后的圖像調(diào)整基線、閾值線?；€選擇2～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，亦可根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整[8-9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ?結(jié)果

觀察組玻璃珠法提取檢出率為77.94%，略高于對(duì)照組磁珠法的75.00%，2組檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3? ?討論

目前，臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)150多種非結(jié)核分枝桿菌，只有少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌對(duì)人類致病。鐘業(yè)騰等[10]研究表明，非結(jié)核分枝桿菌在自然環(huán)境中存在，如土壤、自來水管等，人類傳染主要通過接觸空氣環(huán)境中的非結(jié)核分枝桿菌引起發(fā)病；非結(jié)核分枝桿菌肺病常繼發(fā)于合并肺部基礎(chǔ)疾病，如支氣管擴(kuò)張、先天性肺囊腫、繼發(fā)結(jié)核等，在結(jié)構(gòu)性肺病基礎(chǔ)上均容易繼發(fā)肺結(jié)核分枝桿菌肺病。國(guó)外學(xué)者調(diào)查結(jié)果表明，非結(jié)核分枝桿菌在人與人之間傳染相對(duì)較少，且致病后起病相對(duì)緩慢，全身重度癥狀相對(duì)較輕。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，基因組DNA分子在科研、臨床及法醫(yī)界中使用較為廣泛，檢驗(yàn)過程中以DNA樣本作為研究對(duì)象的PCR、Southern Blot及RFLP等技術(shù)使用較多，如何選擇合適的DNA提取方法對(duì)指導(dǎo)臨床診療具有重要的意義。李崇斌等[11]研究表明，可借助抗煮沸試驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分及鑒別非結(jié)核分枝桿菌是否具備致病性。結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別，除熱觸酶試驗(yàn)外，亦可將菌苔置入含有鹽水小滴的玻片上進(jìn)行研磨，前者不容易發(fā)生乳化而后者乳化較為明顯。目前，臨床上常用的從組織中提取DNA的方法相對(duì)較多，包括蛋白酶K法、TKM法等，分別采用不同的試劑裂解細(xì)胞去除蛋白質(zhì)，然后再采用乙醇完成核酸的沉淀。但是，上述方法操作均相對(duì)繁瑣、對(duì)儀器及設(shè)備要求較高，難以在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。

磁珠法是臨床上常用的分離培養(yǎng)方法。借助納米技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)超順磁性納米顆粒表面的改良及修飾，并將其制作為超順磁性氧化硅納米磁珠。從微觀角度看，超順磁性氧化硅納米磁珠能與核酸分子特異性的結(jié)合并實(shí)現(xiàn)其識(shí)別。核酸結(jié)合到磁珠上主要依靠靜電作用、疏水作用及氫鍵作用，在鹽酸胍、異硫氰酸胍及外磁場(chǎng)的作用下，從血液樣本中分離RNA，并除去非特異性吸附的雜質(zhì)，獲得純化后的DNA。從上述分析結(jié)果看出，磁珠法核酸提取具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢(shì)，廣泛用于血液、組織等標(biāo)本檢測(cè)中。

磁珠法在實(shí)現(xiàn)DNA提取時(shí)亦存在一定的不足，主要表現(xiàn)在以下方面。（1）技術(shù)發(fā)展較為滯后。當(dāng)前磁珠法提取DNA時(shí)仍停留在chelex-100法，并未能研發(fā)出新的檢測(cè)方法。（2）價(jià)格昂貴。盡管磁珠法經(jīng)過不同廠家的改善及升級(jí)優(yōu)化，核酸提取成本得到明顯降低，但該檢測(cè)方法價(jià)格仍相對(duì)較高。

玻璃珠法核酸提取用于非結(jié)核分枝桿菌中，能獲得較為理想的PCR擴(kuò)增模板，具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、省力的優(yōu)點(diǎn)，可獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。LI Y等[12]研究表明，磁珠法核酸提取用于非結(jié)核分枝桿菌中，每個(gè)標(biāo)本只需7～8粒玻璃珠即可獲得所需的DNA。本研究中，觀察組玻璃珠法提取檢出率為77.94%略高于對(duì)照組磁珠法75.00%，但是2種提取方法結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從本研究結(jié)果看出，非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取差異較小，且不同提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。

玻璃珠提取法用于非結(jié)核分枝桿菌中具有以下優(yōu)點(diǎn)。（1）高分散性、流動(dòng)性較好。購(gòu)置玻璃珠時(shí)需了解其分散性、流動(dòng)性，盡可能選擇分散性及流動(dòng)性較好的玻璃珠。該方法具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力，能實(shí)現(xiàn)不同標(biāo)本中DNA的提取。（2）質(zhì)量相對(duì)較輕。玻璃珠的質(zhì)量相對(duì)較輕，在實(shí)際使用過程中由于質(zhì)量輕的優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步拓展其應(yīng)用場(chǎng)合，且提取過程中能獲得較為理想的PCR擴(kuò)增模板。（3）玻璃珠的吸水率較低。優(yōu)質(zhì)的玻璃珠吸水率較低，絕緣性、隔音性亦相對(duì)較低，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定。玻璃珠法提取基因組DNA的，經(jīng)濟(jì)性相對(duì)較強(qiáng)，提取操作過程中僅需要7～8粒玻璃珠即可提取所需的DNA。（4）導(dǎo)熱性較低、硬度強(qiáng)度良好。非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法能獲得更加完整的RNA，能為后續(xù)PCR檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。非結(jié)核分枝桿菌DNA提取過程中，應(yīng)根據(jù)醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)生的專業(yè)技能等，選擇合適的提取方法，以提升非結(jié)核分枝桿菌提取準(zhǔn)確性、科學(xué)性。

綜上所述，非結(jié)核分枝桿菌核酸玻璃珠提取法和磁珠法提取差異較小，但玻璃珠法提取檢出率略高，可為臨床診療提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2023-06-18）