不同基原洪連中7種環(huán)烯醚萜苷類成分的對比分析

高必興，齊景梁，馬璐琳，茍琰，李倩，連艷，蔣桂華，蔣運(yùn)斌（.四川省藥品檢驗(yàn)研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 67；.成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 670；.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 6007；.西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 0075）

洪連又稱“兔耳草”，被《四部醫(yī)典》[1]列為藏草藥之首，藥用價值高。其中基原之一短筒兔耳草（LagotisbrevitubaMaxim）現(xiàn)收載于《中國藥典》2020年版一部，具有清熱解毒、利濕平肝、行血調(diào)經(jīng)等作用，可用于發(fā)熱煩渴、肺熱咳嗽、頭痛眩暈、濕熱黃疸、月經(jīng)不調(diào)等癥[2]。《部頒藏藥》收載了全緣兔耳草（L.integraW.W.Smith）[3]，其他地方標(biāo)準(zhǔn)[4-7]以藥材名“兔耳草”或“洪連”收載了革葉兔耳草（L.alutaceaW.W.Smith）、短穗兔耳草（L.brachystachyaMaxim.）及圓穗兔耳草（L.ramalanaBatalin）。前期調(diào)查[8]發(fā)現(xiàn)，市售及臨床使用的洪連均為兔耳草屬多種植物，除上述標(biāo)準(zhǔn)收載的基原外，還有云南兔耳草（L.yunnanensisW.W.Smith.）及紫葉兔耳草（L.praecoxW.W.Smith）等基原在臨床上也作洪連使用。

環(huán)烯醚萜苷類成分與苯丙素類成分均為玄參科兔耳草屬植物的主要活性成分，具有明顯的藥理活性，與治療熱性肝病作用相合[9]?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)針對苯丙素類成分的研究較多，而針對環(huán)烯醚萜苷類成分的研究甚少。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中僅建立了針對苯丙素類成分的含量測定方法，《中國藥典》2020年版一部中針對洪連（基原為短筒兔耳草）收載了以松果菊苷為指標(biāo)成分的含量測定方法[2]，《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》2020年版[7]針對圓穗兔耳草建立了以松果菊苷及毛蕊花糖苷為指標(biāo)成分的含量測定方法，所測成分均為苯丙素類。同時，洪連的苯丙素類成分（毛蕊花糖苷、松果菊苷、大車前苷及鞭打繡球苷B）的含量對比研究已報道[9-12]，但洪連的環(huán)烯醚萜苷類成分研究甚少。通過前期化學(xué)成分研究[9-13]發(fā)現(xiàn)，不同基原洪連含有梓醇、梔子新苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、玉葉金花苷酸、8-表馬錢子苷酸、喬木狀車前苷酸等環(huán)烯醚萜苷類成分，均為其主要的有效成分，但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)均無相關(guān)報道，也無相關(guān)的定量研究。因此，本研究擬建立市售常用不同基原洪連的7種環(huán)烯醚萜苷類成分含量測定方法，并比較不同基原之間的成分種類及含量差異，為其質(zhì)量控制及資源合理開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器及試藥

1290 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；BP211D 十萬分之一電子分析天平（德國Sartorious 公司）；XPR26 百萬分之一電子分析天平（德國METTLER TOLEDO 公司）；Milli-Q Advantage A10 純水儀（美國Millipore 公司）；HU20500D 型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；色譜柱：Waters Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Hypersil GOLD aQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

梓醇（批號：111808-202112，純度98.8%）、桃葉珊瑚苷（批號：111761-200601，使用前須使用P2O5干燥24 h，含量測定以100.0%計(jì)），中國食品藥品檢定研究院；京尼平苷酸，成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-21062003，純度98.98%；玉葉金花苷酸，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：RDD-Y26302112001，純度98.0%；8-表馬錢子苷酸，四川維克奇生物科技有限公司，批號：wkq22041208，純度98.0%；梔子新苷（純度98.63%）、喬木狀車前苷酸（純度92.81%），四川省藥品檢驗(yàn)研究院中成藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇和乙腈，美國Fisher公司，色譜純。

共收集7種基原77批次洪連藥材，包括短筒兔耳草19批，全緣兔耳草10批，圓穗兔耳草10批，云南兔耳草17 批，短穗兔耳草10 批，革葉兔耳草6 批及紫葉兔耳草5批，均經(jīng)四川省藥品檢驗(yàn)研究院黎躍成主任中藥師鑒定為基原準(zhǔn)確的藥材。所有采集藥材均曬干。樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Waters Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，0.2%→0.5% A；10～30 min，0.5%→2.0% A，30～60 min，2.0%→7.0%A；60～70 min，7.0%→12.0%A；70～80 min，12.0%→14.0% A）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：205 nm（0～42 min）、236 nm（42～80 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取梓醇、桃葉珊瑚苷、梔子新苷、京尼平苷酸、玉葉金花苷酸、8-表馬錢子苷酸及喬木狀車前苷酸對照品適量，精密稱定，置同一25 mL 量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）溶解并定容至刻度，即得對照品溶液。各對照品的濃度分別為0.322 9、1.016 1、0.349 2、0.369 6、0.182 9、0.267 6、0.169 3 mg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過3 號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷。再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，精密量取10 mL，濃縮至近干。殘?jiān)靡译?0.1%磷酸溶液（1∶99）溶解并定容至10 mL 量瓶中，搖勻并濾過，取續(xù)濾液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下各對照品儲備液適量分別置于7 個10 mL 量瓶中，加乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）定容至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混標(biāo)溶液。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，7 種化合物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好（r≥0.999 9）。各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)（r）見表2。

2.2.2 檢測限與定量限測定 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液逐級稀釋并測定，以色譜圖中信噪比（S/N）3∶1為檢測限，（S/N）10∶1 為定量限。結(jié)果表明，梓醇、桃葉珊瑚苷、梔子新苷、京尼平苷酸、玉葉金花苷酸、8-表馬錢子苷酸及喬木狀車前苷酸的檢測限分別為1.52、1.82、4.08、3.94、3.31、2.37、3.41 ng；定量限分別為5.07、6.07、13.61、13.14、11.03、7.92及11.36 ng。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果梓醇、桃葉珊瑚苷、梔子新苷、京尼平苷酸、玉葉金花苷酸、8-表馬錢子苷酸及喬木狀車前苷酸峰面積的RSD 分別為0.95%、0.78%、0.56%、0.34%、0.47%、0.86%及0.93%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末（YN-1）6份，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜方法測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果各份供試品溶液的梓醇、桃葉珊瑚苷、梔子新苷、京尼平苷酸、玉葉金花苷酸、8-表馬錢子苷酸及喬木狀車前苷酸峰面積的RSD 分別為0.67%、0.72%、0.64%、0.91%、0.74%、0.94%及0.33%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（YN-1），分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果梓醇、桃葉珊瑚苷、梔子新苷、京尼平苷酸、玉葉金花苷酸、8-表馬錢子苷酸及喬木狀車前苷酸峰面積的RSD 分別為0.36%、0.27%、0.39%、0.41%、0.35%、0.47%及0.59%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 耐用性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（YN-1），分別使用3種不同色譜柱[Waters Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Hypersil GOLD aQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]考察其耐用性，結(jié)果各峰分離度高，峰形好，耐用性高。色譜圖見圖2。

圖2 3 種不同色譜柱的洪連樣品色譜圖Figure 2 Chromatograms of Lagotidis Herba on three different columns

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定各對照品適量，置量瓶中，加甲醇溶解，并配制成相應(yīng)的對照品溶液。精密稱定已知含量的YN-3 樣品6 份，每份約0.125 g，分別精密加入上述對照品溶液適量，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果回收率為99.5%～101.5%，RSD為0.65%～1.94%，表明該方法加樣回收試驗(yàn)結(jié)果良好。結(jié)果見表3。

表3 洪連樣品的加樣回收率試驗(yàn)（n=6）Table 3 Recovery test of Lagotidis Herba（n=6）

2.2.8 樣品含量測定 稱取77 批次洪連樣品粉末各0.25 g，精密稱定，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜方法測定，記錄7 種成分的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

表4 不同基原洪連中7種環(huán)烯醚萜苷類成分測定結(jié)果（n=2）Table 4 Determination of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba from different origins（n=2）

2.2.9 含量范圍及平均值分析 7 種基原各成分的含量范圍及平均值如表5所示，從成分種類來看，短筒兔耳草、紫葉兔耳草及全緣兔耳草均不含京尼平苷酸；短筒兔耳草、圓穗兔耳草、革葉兔耳草及紫葉兔耳草均不含喬木狀車前苷酸；從含量范圍上來看，7種基原各成分的含量均存在著一定的交叉，差異性不明顯；從平均值上來看，云南兔耳草環(huán)烯醚萜苷類的總成分含量最高，而梓醇以紫葉兔耳草含量最高，桃葉珊瑚苷以短穗兔耳草含量為最高。

表5 不同基原洪連中7種環(huán)烯醚萜苷類成分含量范圍及平均值（n=2）Table 5 Content range and average value of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba from different origins（n=2）

2.2.10 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）采用SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件，先對數(shù)據(jù)（包括單體成分含量及總含量數(shù)據(jù)）進(jìn)行分類識別，然后進(jìn)行OPLS-DA分析。使用無監(jiān)督模式識別，觀測樣品的聚集。結(jié)果見圖3。圓穗兔耳草、短筒兔耳草、紫葉兔耳草及革葉兔耳草聚為一類；全緣兔耳草及短穗兔耳草聚為一類，云南兔耳草獨(dú)自聚為一類。

圖3 不同基原洪連中7種環(huán)烯醚萜苷類成分OPLS-DA 得分圖Figure 3 OPLS-DA score diagram of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba form different origins

變量重要性投影（VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP值越高，對組間差異的影響越大，以變量VIP 值＞1.0 為影響顯著[14]。結(jié)果顯示，喬木狀車前苷酸及梓醇為顯著影響，其他化合物對區(qū)分樣品影響較小。VIP值由大到小進(jìn)行排序，分別為喬木狀車前苷酸＞梓醇＞桃葉珊瑚苷＞京尼平苷酸＞玉葉金花苷酸＞8-表馬錢子苷酸＞總含量＞梔子新苷。結(jié)果見圖4。

圖4 不同基原洪連中7種環(huán)烯醚萜苷類成分的變量重要性投影（VIP）值Figure 4 Variable importance projection（VIP）values of seven iridoid glycosides of Lagotidis Herba from different origins

3 討論

本研究對不同基原洪連中7種環(huán)烯醚萜苷類成分的色譜條件與系統(tǒng)適用性、供試品溶液制備進(jìn)行了優(yōu)化。檢測波長在190～700 nm 處進(jìn)行紫外-可見光全波長掃描，發(fā)現(xiàn)梓醇及桃葉珊瑚苷最大吸收波長低于200 nm，故選擇穩(wěn)定性相對較高的205 nm 作為此2 種成分的檢測波長；梔子新苷、京尼平苷酸、8-表馬錢子苷酸、玉葉金花苷酸及喬木狀車前苷酸最大吸收波長為236～238 nm，故選擇其測定波長為237 nm。因梓醇、桃葉珊瑚苷與其余5 種化合物的最大吸收波長不一致，故選擇變換波長的方法進(jìn)行含量測定。針對流動相系統(tǒng)及比例，考察了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.2%磷酸溶液，并考察了柱溫及梯度洗脫條件，最終顯示以“2.1.3”項(xiàng)下所述的方法為佳。供試品溶液的制備針對了樣品的提取溶劑、提取方式、提取時間及料液比進(jìn)行了考察，最終確定“2.1.1”項(xiàng)下所述的方法。

據(jù)相關(guān)報道[8-12]及調(diào)研發(fā)現(xiàn)，洪連常分為“雌洪連”及“雄洪連”，圓穗兔耳草、短筒兔耳草及紫葉兔耳草同屬于“雄洪連”，云南兔耳草、全緣兔耳草及革葉兔耳草常屬于“雌洪連”，“雄洪連”的臨床療效優(yōu)于“雌洪連”[15]。而短穗兔耳草常作藏藥“直打瓦曾”使用，在藏區(qū)主要用于治療“黃水病”[16]，與2020年版《中國藥典》一部記載“洪連”的功效差異較大。本研究的指標(biāo)成分為環(huán)烯醚萜苷類成分，為洪連治療熱性肝病的有效成分。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各基原環(huán)烯醚萜苷成分存在著共性及差異性，單體在種類上存在著一定的差異，同一單體在部分基原含量上存在著一定的交叉，成分總含量上不具規(guī)律性。通過OPLS-DA 得分圖可知，圓穗兔耳草、短筒兔耳草及紫葉兔耳草聚為一類，從環(huán)烯醚萜苷類成分驗(yàn)證了三者為“雄洪連”的依據(jù)；全緣兔耳草及短穗兔耳草聚為一類，云南兔耳草獨(dú)自聚為一類，說明從“雄洪連”“雌洪連”“直打瓦曾”的角度來看，“雄洪連”與“雌洪連”成分差異較大。與相關(guān)報道[12]“雄洪連”與“雌洪連”在苯丙素苷類的種類及含量上存在著較明顯的差異性的說法相似。同屬“雌洪連”3個基原成分差異大，部分基原又與“直打瓦曾”相似。故“雄洪連”的臨床療效優(yōu)于雌洪連，以及“直打瓦曾”是否能替代“洪連”使用仍需深入的藥效學(xué)研究。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，云南兔耳草在各藏區(qū)使用頻率高，本研究結(jié)果表明云南兔耳草各單體的總含量最高，但在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)[2-7]中，該基原并未被收載。同時紫葉兔耳草也未被收載。

本研究針對洪連的特征有效成分環(huán)烯醚萜苷類進(jìn)行定量研究，比較了不同基原洪連的共性及差異性，彌補(bǔ)了不同基原洪連中環(huán)烯醚萜苷類成分含量對比研究的空白，滿足了藏藥復(fù)雜成分體系的質(zhì)量控制要求，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和提高打下基礎(chǔ)。