共生培養(yǎng)法促進石杉堿甲增量富集的研究

李 靖,李姝漪,付俊璇,張起輝*

1重慶興泰濠制藥有限公司,重慶 400000;2中南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,長沙 410083;3重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400000

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev)為石杉科石杉屬蕨類植物,是一種治療跌打損傷、解毒、止痛以及治療精神分裂癥的珍稀中草藥[1]。蛇足石杉也是目前研究較好的用于治療阿爾茨海默病的藥物,其有效成分石杉堿甲是一種治療重癥肌無力和阿爾茨海默病的高效、低毒性、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑,它可以增強乙酰膽堿的作用,而乙酰膽堿是一種與注意力、警惕性、專注力和記憶力有關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)[2,3]。在1982年,石杉堿甲成功從蛇足石杉中分離出來,被當做“希望之星”。據(jù)調(diào)查,到2025年,發(fā)達國家65歲以上的阿爾茨海默病患者將達到710萬人,比2018年的550萬患者增加近29%,除非有醫(yī)學(xué)上的突破,否則到2050年,該病患者數(shù)量可能從550萬增加到1 380萬[4],而僅在美國,大約每10萬人中就有14～20人患有重癥肌無力,患者總?cè)藬?shù)約為36 000～60 000人,這也是一個十分驚人的數(shù)字[5]。對于阿爾茨海默病和重癥肌無力,目前市面上藥物的最大問題是藥物毒性以及耐藥性。與目前的藥物相比,石杉堿甲是天然植物提取物,安全性好、不良反應(yīng)少、可被人體快速吸收,并且抑制方式為競爭性和非競爭性的混合型抑制,治療效果顯著,有效時間長[6]。

蛇足石杉在世界各地均有分布,但其資源十分有限,其中一個限制因素是蛇足石杉生長緩慢,從孢子到成熟至少需要15年時間。且在成熟階段蛇足石杉的高度也僅有10～30 cm。同時,其生長環(huán)境難以復(fù)刻[7],在實際栽培過程中難以推廣。因此,在不久的將來,蛇足石杉將面臨滅絕的威脅。近年來,對這種珍稀植物開展了多項研究,例如對外植體和愈傷組織的體外培養(yǎng)。Kan′ichiro Ishiuchi的團隊先后從H.pinifolia的莖尖中獲得外植體,并在滅菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個周期(每個周期為7 d),最后成功地將外植體轉(zhuǎn)入愈傷組織生長培養(yǎng)基中[8],此外,研究人員對蛇足石杉培養(yǎng)方法進行了各種改進,例如培養(yǎng)基成分篩選以及莖尖培養(yǎng)技術(shù)的研究,但組培過程中外植體的消殺問題仍未得到有效的解決,限制了石杉堿甲的大規(guī)?；a(chǎn)[9,10]。由于蛇足石杉的自然資源匱乏以及以上所提及的原因,急需找到一種以較低成本就可提高石杉堿甲含量的新方法。

內(nèi)生真菌是一類生活在植物莖和葉組織內(nèi)的真菌,已有研究發(fā)現(xiàn),如果內(nèi)生真菌與植株長時間共生進化,它們就可以通過基因重組獲得宿主植物的某些基因,產(chǎn)生與宿主植物相同的次生代謝物[11-13]。同時,內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生激素促進寄主植物的生長發(fā)育。因此,在共培養(yǎng)體系中,內(nèi)生真菌被認為是激發(fā)子[13],這意味著植物細胞可以在一定濃度范圍內(nèi)與內(nèi)生真菌共培養(yǎng),在共培養(yǎng)體系中內(nèi)生真菌和植物細胞相互影響,促進植物積累產(chǎn)物。麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組成成分,屬于真菌類的特征甾醇,可作為衡量真菌生物量的代表性指標[14]。

本研究引入了一種新型的共培養(yǎng)體系(co-culture system,CCS),以一種經(jīng)濟、便捷的方式提高蛇足石杉中石杉堿甲的含量,以改善蛇足石杉因為資源短缺而無法廣泛應(yīng)用的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 材料

植株取自湖北省神農(nóng)架多年生的野生蛇足石杉植株,經(jīng)重慶大學(xué)藥學(xué)院張傳瑞研究員鑒定為石杉科石杉屬蕨類植物蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev),樣品(202005006)存于重慶大學(xué)植物園室外設(shè)施網(wǎng)室內(nèi);腐殖土取自重慶市四面山森林公園。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent有限公司);BDS200型倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海雅榮生化儀器廠)。

MS培養(yǎng)基(批號:20200406,純度:BR,杭州百思生物技術(shù)有限公司);激動素(KT)(批號:I2020156,純度≥99%,金坦生物技術(shù)分公司);2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)(批號:I1846732,純度97%,金坦生物技術(shù)分公司);青霉素(批號:B184012,純度98%,北京華邁科生物技術(shù)有限公司);鏈霉素(批號:B160603,純度90%,北京華邁科生物技術(shù)有限公司);兩性霉素B(批號:B200208,純度≥90.0%,北京華邁科生物技術(shù)有限公司);特美汀(批號:B173024,純度≥99%,北京華邁科生物技術(shù)有限公司);中性紅(批號:20200123,規(guī)格:指示劑,天津博迪化工股份有限公司);石杉堿甲(批號:100243-202003,純度≥98%,四川維克奇生物科技有限公司);麥角甾醇(批號:111845-202004,純度≥98%,四川維克奇生物科技有限公司);甲醇(批號:2020031702,純度:色譜純,天津盾特特種化工有限公司);乙酸銨(批號:2020041323,純度:色譜純,成都科隆化工有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛇足石杉的馴化

為了獲得蛇足石杉最佳培養(yǎng)條件,參考Huang等[15]對蛇足石杉適宜生長環(huán)境研究結(jié)果,對其馴化條件進行考察。將野生蛇足石杉樣本種植于重慶大學(xué)室外設(shè)施網(wǎng)室內(nèi),以蛇足石杉植株的存活率為指標,對馴化時腐殖土與河沙比例、空氣濕度、光照強度進行單因素考察,每次試驗供試植株為10株,重復(fù)3次。植株存活率計算方法為:植株存活率=植株存活數(shù)量/供試植株總數(shù)×100%。

蛇足石杉在設(shè)定的條件下開始發(fā)芽(見圖1A),即蛇足石杉成功馴化。

圖1 萌發(fā)的蛇足石杉植株( A ),植株表皮細胞( B )和海綿細胞( C )Fig.1 Germinate Huperzia serrata (A),botanical epidermal cells (B) and spongy cells (C)

1.3.2 組織培養(yǎng)基的制備

以真菌生長情況和葉肉細胞存活率為指標,對培養(yǎng)基制備過程中基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(1/2 MS,MS和B5)進行研究[16,17];以叢生芽萌發(fā)率和莖段數(shù)量為指標考察蔗糖濃度(1%、2%、3%、4%)[17];以愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織增殖率為指標考察最佳植物激素2,4-D濃度(0、2、5、7 mg/L)[18]?？刂婆囵B(yǎng)基pH為5.8,采用青霉素(30.0 mg/L)、鏈霉素(50.0 mg/L)、兩性霉素B(0.5 mg/L)、特美汀(5.0 mg/L)等抗生素控制培養(yǎng)基中其他微生物的無限增殖,通過分析未植入外植體的滅菌空白培養(yǎng)基的真菌生長情況判斷培養(yǎng)基制備過程滅菌是否徹底。愈傷組織誘導(dǎo)率和增殖率的計算方式為:愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的胚胎數(shù)/接種的胚胎數(shù)×100%;愈傷組織增殖率=(收獲的愈傷組織重量-接種的愈傷組織重量)/接種的愈傷組織重量×100%。

1.3.3 外植體的體外殺菌和繁殖

據(jù)報道,蛇足石杉葉片中石杉堿甲的產(chǎn)量最高,因此體外培養(yǎng)的靶細胞為葉肉細胞[16]。將健康葉片用普通肥皂洗凈,分別用70%酒精浸泡50 s,0.5 mg/L孔雀石綠浸泡8 min,3%H2O2浸泡10 min,再用無菌水洗滌3次。將滅菌后的外植體在含有5～10 mL液體滅菌介質(zhì)的研缽中機械粉碎。1～3 min后,將葉肉細胞懸液轉(zhuǎn)入容量瓶中稀釋,然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中,在室溫(24 ℃),光照強度(100 Lux左右),濕度(95%)下培養(yǎng)[19]。

1.3.4 單細胞計數(shù)

每2 d測定一次葉肉細胞數(shù)。樣品以4∶1的比例懸浮于含0.04%中性紅的沉積物中,孵育20 min后,用血細胞計計數(shù)染色活細胞。

在顯微鏡下,可以清晰地觀察到懸浮液中的表皮細胞和海綿狀細胞(見圖1B、1C)。海綿狀細胞中的石杉堿甲的濃度最高,其成像長約23～38 μm,寬約15～23 μm[20]。

1.3.5 提取

取5 mL培養(yǎng)基懸液,通過3次凍融提取,2次超聲提取(單次40 min,每次間隔10 min)提取石杉堿甲和麥角甾醇[21]。將懸液減壓蒸餾濃縮,提取液用甲醇溶解。將溶液轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中定容。在HPLC分析前溶液用0.22 μm濾膜過濾。

每天測定一次石杉堿甲和麥角甾醇的濃度和混合比例。

1.3.6 色譜條件

采用高效液相色譜儀和紫外檢測器對提取物進行色譜分析。色譜柱:Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),進樣量10 μL,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃。石杉堿甲和麥角甾醇的檢測波長分別為310 nm和282 nm。流動相由水和甲醇(含0.008 mol/L乙酸銨)組成,比例為75∶25[22,23]。

1.3.7 方法驗證

以5～45 μg/mL石杉堿甲和麥角甾醇標準溶液繪制標準曲線。采用相關(guān)系數(shù)法(r)測定標準曲線的線性度。

精密度試驗:在相同條件下,將標準溶液(10 μg/mL)進樣5次,測定方法精密度。重復(fù)性試驗:樣品在相同條件下操作5 次,測試方法重復(fù)性。穩(wěn)定性實驗:樣品分別于1、2、4、8、12 h測定,測試方法穩(wěn)定性[24]。以上三種試驗結(jié)果均以峰面積的相對標準偏差(RSD,%)表示。取已測定石杉堿甲和麥角甾醇含量的樣品(1 mL)加入石杉堿甲(0.5 mL,10 μg/mL)和麥角甾醇(1 mL,15 μg/mL)在“1.3.6”的色譜條件下進行加標回收試驗,重復(fù)5次,計算回收率,并根據(jù)回收率進行評價:回收率=(加標試樣測定值-樣品測定值)/加標量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化條件考察

為了研究共培養(yǎng)體系最佳培養(yǎng)條件,對蛇足石杉馴化條件進行了單因素考察,并選取各因素考察試驗中存活率較高的三組進行顯著性差異分析。如圖2A所示,土壤由腐殖土和河沙組成,在不同土壤配比下植株存活率存在顯著差異,土壤配比為2∶1時植株存活率最高,并且2∶1與1∶1之間的P值小于0.01,2∶1與4∶1之間的P值小于0.05,故選取2∶1作為最佳土壤配比。在最佳光照強度研究中,不同光照強度下植物存活率存在著顯著差異,見圖2B,100 Lux與300 Lux之間的P值小于0.01,100 Lux與80 Lux的P值小于0.05,最佳光照強度為100 Lux。由圖2C可知,空氣濕度對植物存活率也存在著顯著影響,95%與85%和95%與100%之間的P值均小于0.01,最佳空氣濕度為95%。

圖2 馴化條件對植株存活率的影響Fig.2 Effect of domestication conditions on plant survival rate 注:*P < 0.05;**P < 0.01。

2.2 不同培養(yǎng)基條件研究

由表1結(jié)果所示,空白對照組在相同培育條件下未見真菌污染物,表明培養(yǎng)基制備過程中滅菌徹底,只有使用MS培養(yǎng)基時,葉肉細胞存活率為12.5%,并且伴隨著內(nèi)生真菌的生長,說明基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類對蛇足石杉內(nèi)生真菌的生長和細胞培養(yǎng)體系有顯著影響;改變培養(yǎng)體系蔗糖濃度,叢生芽萌發(fā)率和莖段數(shù)量發(fā)生明顯變化,在蔗糖濃度為(2%)20.0 g/L時,叢生芽萌發(fā)率和莖段數(shù)量最高;添加植物激素有利于蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo),在5.0 mg/L時誘導(dǎo)率最佳,但植物激素對愈傷組織增殖有著不利影響,隨著植物激素濃度增加增殖率不斷減小,綜合選擇5.0 mg/L 2,4-D作為最適濃度。因此,最佳培養(yǎng)基條件為MS液體培養(yǎng)基,蔗糖(20.0 g/L)、2,4-D(5.0 mg/L)和KT(1.0 mg/L)。

表1 培養(yǎng)條件對比結(jié)果

2.3 共培養(yǎng)體系指標性成分含量測定

我們采用機械破碎法制得蛇足石杉的葉肉細胞懸液。在CCS過程中,內(nèi)生真菌的增殖被控制在一定的范圍內(nèi),以維持葉肉細胞和內(nèi)生真菌之間的平衡,而其他類型的微生物則受到抗生素的有效抑制。通過HPLC檢測培養(yǎng)體系內(nèi)石杉堿甲和麥角甾醇含量,探究內(nèi)生真菌生長對石杉堿甲富集的影響。石杉堿甲是蛇足石杉的主要活性成分,反映了葉肉細胞的數(shù)量。而麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組成部分,是衡量生物量的代表性指標[25]。

按照上述原則,對提取物進行色譜分析。石杉堿甲和麥角甾醇的代表性色譜圖見圖3。A和B圖分別顯示了石杉堿甲和麥角甾醇在培養(yǎng)基中的相應(yīng)色譜峰和結(jié)構(gòu),在相同色譜條件下,標準品2個峰的基線分離時間分別為9.31 min和10.95 min。通過提取物與對照品進行對比,證明提取物中存在石杉堿甲和麥角甾醇。

圖3 標準品與樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standards and samples

圖4A顯示石杉堿甲和麥角甾醇濃度隨時間的變化規(guī)律。由圖分析可知,在6 d時石杉堿甲上升至最高水平,麥角甾醇下降到最低水平,在12 d時,麥角甾醇濃度達到峰值。這兩種特征化合物的峰值濃度不是同步的,石杉堿甲比麥角甾醇更早達到峰值濃度,說明當石杉堿甲與麥角甾醇的濃度比在2.2～1.5之間時,內(nèi)生真菌的生長對石杉堿甲富集具有促進作用。

圖4 分析指標隨時間的變化Fig.4 The change of analysis indicators with time注:*P < 0.05;**P < 0.01。

圖4B展示了蛇足石杉細胞數(shù)量隨培養(yǎng)周期的變化規(guī)律,植物細胞在4 d內(nèi)生長穩(wěn)定,在第4 d時每體積細胞計數(shù)中活細胞數(shù)為8個,達到最大值,隨后細胞數(shù)量開始下降,通過對第4 d與第2 d以及第6 d之間的顯著性差異分析,發(fā)現(xiàn)4 d時的活細胞數(shù)量顯著高于2 d和6 d時的數(shù)量,因此初步確定第4 d為采收和繼代的最佳時間點。

為進一步驗證采收和繼代的最佳時間,采用HPLC法測定石杉堿甲在1～6 d的含量,每天取樣1次。由圖4C可知,在蛇足石杉植物細胞與內(nèi)生真菌的共培養(yǎng)體系中,石杉堿甲含量在1～4 d內(nèi)逐漸增加,達到最大值13.68 μg/mL,4 d后石杉堿甲含量呈現(xiàn)降低趨勢,表明第4 d是石杉堿甲含量變化的拐點。通過拐點與相鄰兩天含量之間的顯著性差異分析,第4 d與第5 d的P值小于0.05,第4 d與第3 d的P值小于0.01,說明4 d時石杉堿甲含量顯著高于相鄰兩天時的含量,因此認為第4 d是石杉堿甲采收和繼代的最佳時間。經(jīng)過4 d共培養(yǎng)之后石杉堿甲含量較1 d 時的9.16 μg/mL增長了49.34%。

2.4 檢測方法學(xué)研究

方法學(xué)研究結(jié)果如表2所示,經(jīng)計算,石杉堿甲和麥角甾醇濃度分析精密度RSD分別為0.81%和1.07%,重復(fù)性分別為1.36%和2.7%。說明方法精密度和重復(fù)性良好,穩(wěn)定性RSD分別為1.33%和2.45%,說明方法穩(wěn)定,兩種分析物的回收率分別為101.81%和100.01%,并且RSD小于5%,說明測試方法結(jié)果準確。

表2 方法線性度

3 討論與結(jié)論

石杉堿甲是一種用于治療老年癡呆和重癥肌無力的AChE抑制劑,其主要來源是蛇足石杉,但石杉堿甲在蛇足石杉中含量較低,并且蛇足石杉資源有限,限制了石杉堿甲在醫(yī)藥領(lǐng)域的進一步發(fā)展[3]。有研究表明,在植物體內(nèi)存在著多種內(nèi)生真菌,它們在長期的進化過程中與宿主植物形成了一種復(fù)雜的互利共生關(guān)系,一方面,內(nèi)生真菌需要從植物中吸取營養(yǎng),以滿足自身生存[26]。另一方面,內(nèi)生真菌為了抵抗宿主的防御系統(tǒng),與宿主植物產(chǎn)生了特殊的生物化學(xué)交流,可通過識別宿主的化學(xué)信號或者雇用宿主酶系來合成與宿主相似的次級代謝產(chǎn)物[27]。如Jiang等[28]在半紅樹植物黃槿中通過分離純化內(nèi)生真菌,固體發(fā)酵得到了與宿主相同的次生代謝產(chǎn)物。Tong等[29]通過對蛇足石杉內(nèi)生真菌FS4次級代謝產(chǎn)物的分離研究,發(fā)現(xiàn)其5種代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出與石杉堿甲相似的強抑制乙酰膽堿酯酶生物活性。

本研究中對野生蛇足石杉的馴化條件和組織培養(yǎng)基條件進行了試驗,確定了最佳培養(yǎng)條件為光照強度100 Lux,濕度95%,MS液體培養(yǎng)基,蔗糖20.0 g/L,2,4-D 5.0 mg/L和KT 1.0 mg/L,并以石杉堿甲和麥角甾醇這兩種化合物的相對變化趨勢來反映CCS的動態(tài)生長過程,由其拐點確定第4 d為采收和繼代的最佳時間。通過CCS培養(yǎng)4 d之后,石杉堿甲的含量提升了49.34%,達到最大值,培養(yǎng)體系內(nèi)石杉堿甲含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這是由于在生長后期內(nèi)生真菌的繁殖能力比植物細胞分化能力更強,搶奪了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和生長空間,導(dǎo)致細胞數(shù)量減少,所以采收和繼代時間的選擇是共培養(yǎng)體系實現(xiàn)石杉堿甲增量富集的關(guān)鍵,同時植物激素2,4-D濃度對體系有著較大的影響,2,4-D對植物器官的脫分化、愈傷組織的誘導(dǎo)具有促進作用,但濃度過高時對細胞的分化有抑制作用,所以在培養(yǎng)體系中,采用5 mg/L作為最適濃度[30]。本實驗成功采用共培養(yǎng)體系實現(xiàn)石杉堿甲的生物合成,此方法克服了傳統(tǒng)的固定觀念,因為植物體細胞培養(yǎng)不需要事先徹底滅菌,植物體細胞與內(nèi)生真菌可以實現(xiàn)共培養(yǎng),并且在特定比例下可以促進石杉堿甲的生成。只要準確掌握培養(yǎng)周期規(guī)律,就可以利用這種方便快捷的方法積累石杉堿甲,對保護植物資源和豐富石杉堿甲重要的生物活性物質(zhì)具有重要意義。