基于HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定的半邊蓮飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究

李振雨,劉曉霞,馮涌微,位翠杰,何民友,夏天睿,陳向東,孫冬梅

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,佛山 528244

半邊蓮為桔?？浦参锇脒吷廘obeliachinensisLour.的干燥全草,具有清熱解毒,利尿消腫的功效[1]。研究顯示,半邊蓮主要含黃酮、生物堿和香豆素類(lèi)成分[2],具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[3-7]。半邊蓮為藥典常用中藥,但藥典項(xiàng)下半邊蓮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只收載性狀、鑒別、檢查和浸出物項(xiàng),質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善。目前關(guān)于半邊蓮質(zhì)量控制研究及成分分析的報(bào)道仍比較少[8]。

傳統(tǒng)中藥以湯劑為主要用藥形式,湯劑為中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),經(jīng)過(guò)千年的臨床實(shí)踐,因此,建立中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),能夠?yàn)橹兴幣浞筋w粒等現(xiàn)代中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供重要參考[9,10]。目前,關(guān)于半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。本文作者在研究半邊蓮配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)時(shí),按照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》[11](以下簡(jiǎn)稱(chēng)《技術(shù)要求》),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo):出膏率、浸出物、指標(biāo)性成分含量及轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜進(jìn)行研究,考察半邊蓮飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律,為半邊蓮配方顆粒及其相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(e2695,沃特世公司);Thermo Acclaim C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;百萬(wàn)分之一天平(XP26,梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑

分析級(jí)甲醇、磷酸二氫鉀(西隴科學(xué)股份有限公司);分析級(jí)二甲基亞砜(阿拉丁試劑有限公司);液相用乙腈(純度≥99.9%,默克股份有限公司)。

1.3 試藥

地奧司明(批號(hào):101348-201802,含量:97.3%)、蒙花苷(批號(hào):111528-201911,含量:98.5%)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;木犀草素7-二葡萄糖苷酸對(duì)照品(批號(hào):STD210928082,純度大于95.0%,成都德思特生物技術(shù)有限公司);海常黃苷對(duì)照品(批號(hào):B20210512,純度大于98.0%,四川維克奇生物科技有限公司);半邊蓮對(duì)照藥材(批號(hào):121142-201605,中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

21批半邊蓮藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為桔?？浦参锇脒吷廘obeliachinensisLour.的干燥全草。取21批半邊蓮藥材,參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)半邊蓮飲片項(xiàng)下規(guī)定制成21批半邊蓮飲片,并按照《技術(shù)要求》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[12]制備21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品。半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的產(chǎn)地信息見(jiàn)表1所示。

表1 半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑產(chǎn)地信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 半邊蓮飲片的炮制和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

2.1.1 半邊蓮飲片的炮制

參照2020年版《中國(guó)藥典》一部半邊蓮飲片項(xiàng)下炮制規(guī)定,細(xì)化炮制參數(shù),確定半邊蓮飲片的炮制方法為:取藥材,除去雜質(zhì),洗凈(1 min內(nèi)),切段(5～10 mm),置60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥5～6 h,即得半邊蓮飲片,經(jīng)檢驗(yàn)均符合2020年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。

2.1.2 半邊蓮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取半邊蓮飲片100 g,加水煎煮兩次,一煎加水12倍量,浸泡30 min,武火(500 W)加熱煮沸后文火(200 W)保持微沸30 min,趁熱過(guò)濾,濾液迅速用冷水冷卻;二煎加水10倍量,武火(500 W)加熱煮沸后文火(200 W)保持微沸25 min,趁熱過(guò)濾,濾液迅速用冷水冷卻;合并兩次濾液,減壓濃縮,冷凍干燥,得標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo Acclaim C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(B);梯度洗脫(0～24 min,10%→14%A;24～28 min,14%→22%A;28～35 min,22%A;35～41 min,22%→30%A;41～53 min,30%→33%A);流速為1.0 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取木犀草素7-二葡萄糖苷酸、海常黃苷、地奧司明和蒙花苷對(duì)照品適量,溶解于二甲基亞砜中,制成適量的混合對(duì)照品溶液。精密移取上述混合對(duì)照品溶液適量,加甲醇制成每1 mL含木犀草素7-二葡萄糖苷酸4.21 μg、海常黃苷2.23 μg、地奧司明1.75 μg和蒙花苷1.62 μg的混合溶液,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

2.2.3.1 半邊蓮飲片供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱(chēng)定重量,加熱回流30 min,取出,放冷,再稱(chēng)定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2.3.2 半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備

取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量,研細(xì),取約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱(chēng)定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2.3.3 半邊蓮對(duì)照藥材供試溶液的制備

取本品約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱(chēng)定重量,加熱回流30 min,取出,放冷,再稱(chēng)定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.4.1 精密度考察

取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):BT3)適量,研細(xì),取約0.5 g,精密稱(chēng)定,按“2.2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,以地奧司明色譜峰為參照峰S,計(jì)算其余各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.07%～0.27%,相對(duì)峰面積RSD值在1.12%～2.64%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):BT3)適量,研細(xì),取約0.5 g,精密稱(chēng)定,平行6份,按“2.2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,以地奧司明色譜峰為參照峰S,計(jì)算其余各共有指紋峰與S峰的相對(duì)峰面積RSD值在0.14%～0.36%,相對(duì)峰面積RSD值在0.60%～2.73%,均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,以地奧司明色譜峰為參照峰S,計(jì)算其余各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.10%～0.27%,相對(duì)峰面積RSD值在0.50%～2.81%,均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

采用“2.2.1”和“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定21批半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品指紋圖譜,導(dǎo)出指紋圖譜CDF格式,導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)》,分別以YP1和BT1樣品指紋圖譜為參照?qǐng)D譜,時(shí)間窗為0.2 min,進(jìn)行多點(diǎn)校正和峰匹配,并生成飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜,21批半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖1和圖3,對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖2和圖4。結(jié)果顯示,21批半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜均標(biāo)識(shí)出11個(gè)保留時(shí)間一致的共有峰,并與半邊蓮對(duì)照藥材指紋圖譜的11個(gè)色譜峰相對(duì)應(yīng),說(shuō)明從半邊蓮飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑,各共有峰均能傳遞到標(biāo)準(zhǔn)湯劑中,對(duì)照藥材指紋圖譜見(jiàn)圖5所示。 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):BT3)供試品溶液,采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,與對(duì)照品保留時(shí)間和紫外吸收光譜比對(duì),確定峰1為木犀草素-7-二葡萄糖苷酸,峰2為海常黃苷、峰10為地奧司明、峰11為蒙花苷,對(duì)照品指認(rèn)結(jié)果見(jiàn)圖6所示。

圖1 21批半邊蓮飲片指紋圖譜疊加圖Fig.1 Superimposed fingerprint of 21 batches of Lobeliae Chinensis Herba decoction pieces

圖2 半邊蓮飲片對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba decoction pieces

圖3 21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜疊加圖Fig.3 Superimposed fingerprint of 21 batches of Lobeliae Chinensis Herba standard decoction

圖4 半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜Fig.4 Reference fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba standard decoction

圖5 半邊蓮對(duì)照藥材指紋圖譜Fig.5 Reference fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba

圖6 半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰指認(rèn)Fig.6 Identification of common peaks in the fingerprint of Lobeliae Chinensis Herba standard decoction注:A:混合對(duì)照品溶液,B:供試品溶液。1:木犀草素-7-二葡萄糖苷酸;2:海常黃苷;10:地奧司明;11:蒙花苷。Note:A:Mixed reference solution;B:Sample solution.1:Luteolin-7-diglucosidic acid;2:Clerodendrin;10:Diosmin;11:Linarin.

2.2.6 相似度評(píng)價(jià)

計(jì)算21批半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度,結(jié)果見(jiàn)表2,21批半邊蓮飲片指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.912～0.976,飲片指紋圖譜的整體相似度較高,指紋圖譜可以作為共性特征用于半邊蓮飲片的質(zhì)量控制;而21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.840～0.943,從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑,指紋圖譜的相似度變化較大,考慮半邊蓮指紋圖譜共有峰所代表的化學(xué)成分在水中的溶解度不同,從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑各成分的轉(zhuǎn)移率波動(dòng)較大,導(dǎo)致共有峰的比例發(fā)生較大變化有關(guān)。

表2 相似度計(jì)算結(jié)果

2.2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.2.7.1 主成分分析(PCA)

以峰10地奧司明色譜峰為參照峰S,計(jì)算其余各共有峰的相對(duì)峰面積,以共有峰的相對(duì)峰面積為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件進(jìn)行PCA分析,結(jié)果見(jiàn)圖7所示,PCA模型共提取出5個(gè)主成分,R2X為0.978,Q2為0.865,證明模型有效,結(jié)果顯示,21批半邊蓮飲片聚為一類(lèi),在模型中的聚集程度較高,而對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚集程度較為分散,歸為另一類(lèi),與相似度計(jì)算結(jié)果相一致,說(shuō)明從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰的比例發(fā)生較大變化,而標(biāo)準(zhǔn)湯劑不同批次之間也存在較大的差異,需要進(jìn)一步研究。

圖7 PCA得分圖Fig.7 PCA scores plot

2.2.7.2 正交偏最小二乘法-判別式分析(OPLS-DA)

以共有峰的相對(duì)峰面積為變量進(jìn)行OPLS-DA分析,研究從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰的相對(duì)峰面積變化,模型采用200次置換檢驗(yàn),R2和Q2值右邊均大于左邊,說(shuō)明模型無(wú)過(guò)度擬合現(xiàn)象,結(jié)果見(jiàn)圖8。R2X值為0.938,R2Y為0.894,Q2為0.855,均大于0.5,證實(shí)模型有效,21批飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖9所示,兩類(lèi)樣品區(qū)分較為明顯,以VIP>1.0尋找差異顯著性變量,結(jié)果見(jiàn)圖10,共找到5個(gè)差異性變量,按VIP值大小進(jìn)行排序,分別為峰9>峰7>峰5>峰4>峰1,表明上述5個(gè)峰的相對(duì)峰面積從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對(duì)峰面積變化整體較為顯著。

圖8 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)Fig.8 OPLS-DA model replacement test

圖9 OPLS-DA得分圖Fig.9 OPLS-DA score plot

圖10 VIP圖Fig.10 VIP plot

2.3 出膏率測(cè)定

出膏率以?xún)龈煞哿坑?jì),出膏率=標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉重量/飲片重量×100%,結(jié)果見(jiàn)表3。21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍在29.91%～47.94%,出膏率均值為40.93%,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為5.45%,出膏率均值的70%～130%范圍為28.65%～53.20%,出膏率數(shù)值均在均值±30%范圍內(nèi),符合《技術(shù)要求》的規(guī)定。

表3 出膏率和浸出物含量測(cè)定結(jié)果

2.4 浸出物測(cè)定

取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量,研細(xì),取約2 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入乙醇100 mL,按《中國(guó)藥典》2020年版通則2201醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3。21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑浸出物范圍在22.19%～36.36%,浸出物均值為29.55%,SD為4.24%,均值的70%～130%范圍為20.68%～38.41%,浸出物數(shù)據(jù)均在均值±30%范圍內(nèi),符合《技術(shù)要求》的規(guī)定。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液(B);梯度洗脫(0～31 min,15%→35%A);流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定地奧司明對(duì)照品2.336 mg、蒙花苷對(duì)照品2.027 mg,置25 mL量瓶中,加二甲基亞砜制成每1mL含地奧司明90.917 μg、蒙花苷79.864 μg的混合溶液,精密移取上述混合溶液0.5 mL置25 mL量瓶中,加甲醇制成每1 mL含地奧司明1.818 μg、蒙花苷1.597 μg的混合溶液,即得。

2.5.3 供試品溶液的制備

2.5.3.1 半邊蓮飲片供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.2 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入二甲基亞砜25 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)45min,取出,放冷,再稱(chēng)定重量,用二甲基亞砜補(bǔ)足減失的重量,離心(轉(zhuǎn)速為4 000 r/min)5 min,精密移取上清液10 mL置25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.5.3.2 半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備

取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量,研細(xì),取約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30min,取出,放冷,再稱(chēng)定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.5.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.4.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑溶液,按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算地奧司明和蒙花苷峰面積RSD值分別為0.58%和0.55%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.5.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):BT14)適量,研細(xì),約0.5 g,精密稱(chēng)定,平行6份,按“2.5.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定地奧司明和蒙花苷的含量分別為0.207 mg/g和0.084 mg/g,RSD值為0.83%和0.99%,均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4.3 線(xiàn)性考察

取地奧司明和蒙花苷對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含地奧司明94.323 μg、蒙花苷48.817 μg的混合對(duì)照品母液。精密量取上述混合對(duì)照品母液1.0mL,分別置2、5、10、25、50、100 mL量瓶中,加甲醇制成每1mL含地奧司明47.162、18.865、9.432、3.773、1.886、0.943 μg,蒙花苷24.408、9.763、4.882、1.953、0.976、0.488 μg的混合對(duì)照品應(yīng)用液,分別精密吸取上述混合對(duì)照品母液和應(yīng)用液,按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣10μL,記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制線(xiàn)性回歸方程,地奧司明的線(xiàn)性回歸方程為Y=21 468X+4 797.3,蒙花苷的線(xiàn)性回歸方程為Y=22 207X+2 443.5,相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 5,表明各成分在規(guī)定的對(duì)照品濃度范圍內(nèi),峰面積與對(duì)照品濃度線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.4.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取地奧司明對(duì)照品9.694 mg,置20 mL量瓶中,加二甲基亞砜制成每1 mL含地奧司明471.613 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液①;精密稱(chēng)取蒙花苷對(duì)照品2.478 mg,置10 mL量瓶中,加二甲基亞砜制成每1 mL含蒙花苷244.083 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液②。精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液①2.8 mL、對(duì)照品儲(chǔ)備液②2.2 mL,置25 mL量瓶中,加70%甲醇制成每1 mL含地奧司明52.821 μg、蒙花苷21.479 μg的混合對(duì)照品加樣母液。取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):BT14)適量,研細(xì),約0.25 g,精密稱(chēng)定,置9個(gè)25 mL量瓶中,平行3組,每組3份,采用加樣回收法,按對(duì)照品加入量與供試品待測(cè)成分的含量之比控制在0.5∶1、1∶1、1.5∶1的比例分別加入上述對(duì)照品加樣母液0.5、1.0、1.5 mL,再加70%甲醇定容至刻度,按“2.5.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液9份。按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算地奧司明的平均加樣回收率為98.57%、蒙花苷的平均加樣回收率為96.58%,RSD值分別為1.22%和1.46%,均小于3.0%,表明該方法準(zhǔn)確性良好,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.5.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):BT14)供試品溶液,按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12和24 h進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算地奧司明和蒙花苷的色譜峰面積RSD值分別為0.38%和0.27%,均小于3.0%,表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5.5 樣品測(cè)定和轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

采用“2.5”項(xiàng)下含量測(cè)定方法對(duì)21批半邊蓮飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑地奧司明和蒙花苷的含量進(jìn)行測(cè)定,含量以干燥品計(jì),并計(jì)算轉(zhuǎn)移率,轉(zhuǎn)移率=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中有效成分的總量/飲片有效成分總量×100%,結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,21批半邊蓮飲片地奧司明的含量范圍在1.97 ～6.55 mg/g,蒙花苷的含量范圍在0.28～0.96 mg/g,21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑地奧司明的含量范圍在0.15 ～0.54 mg/g,均值為0.27 mg/g;地奧司明的轉(zhuǎn)移率范圍在1.53%～4.99%,均值為2.77%;蒙花苷的含量范圍在0.06 ～0.15 mg/g,均值為0.10 mg/g;轉(zhuǎn)移率范圍在4.27%～8.98%,均值為6.66%。

表5 地奧司明和蒙花苷的含量和轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

半邊蓮質(zhì)地較輕,在飲片煎煮過(guò)程中,大量成分溢出,增加了指紋圖譜的建立難度,在指紋圖譜的建立過(guò)程中,綜合考慮圖譜信息量、色譜峰響應(yīng)和分離效果,考察了甲醇-0.1%磷酸溶液,乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液3種流動(dòng)相系統(tǒng),最終選擇乙腈-0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液。采用全波長(zhǎng)掃描模式,確定了指紋圖譜最佳吸收波長(zhǎng),以“指紋圖譜共有峰的總峰面積/稱(chēng)樣量”為指標(biāo),優(yōu)選出最佳的供試品溶液制備方法,所建立的指紋圖譜方法經(jīng)系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證,均符合要求。2020年版《中國(guó)藥典》一部“半邊蓮”項(xiàng)下無(wú)含量測(cè)定指標(biāo),參考《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、Zeng等[13]研究結(jié)果,建立有效成分地奧司明和蒙花苷的含量測(cè)定方法,從而指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞研究。產(chǎn)地調(diào)研顯示,半邊蓮主產(chǎn)于貴州、安徽、江西、湖南、湖北、河南等地,以野生資源為主,為保證樣品的代表性,我司工作人員深入到半邊蓮主產(chǎn)地進(jìn)行樣品的搜集,以滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究的需要。從標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率、浸出物和含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看,21批半邊蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、浸出物、地奧司明和蒙花苷的含量均存在一定的差異,出膏率和浸出物最大值是最小值的1.6倍左右,地奧司明和蒙花苷含量最大值是最小值的2～4倍。這種差異可能與藥材的產(chǎn)地、采收時(shí)間和產(chǎn)地加工方式的不同有關(guān)。

2020年版《中國(guó)藥典》半邊蓮藥材項(xiàng)下并無(wú)含量測(cè)定指標(biāo), 黃酮類(lèi)化合物是半邊蓮中非常重要的一類(lèi)化合物,是抗癌的主要活性成分,其中地奧司明為黃酮苷化合物,具有改善靜脈通透性,改善微循環(huán)的作用[14],蒙花苷與地奧司明結(jié)構(gòu)非常相似,且在半邊蓮中含量較高,因此,藥材和飲片采用地奧司明和蒙花苷為含量測(cè)定指標(biāo),具有一定的專(zhuān)屬性和實(shí)際意義。但從轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果來(lái)看,地奧司明和蒙花苷從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率均小于10%,說(shuō)明其水溶性并不理想,從指紋圖譜各共有峰的比例就能明顯看出,地奧司明和蒙花苷色譜峰從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑,其在指紋圖譜總峰面積中的占比明顯下降?？紤]到目前從半邊蓮指紋圖譜指認(rèn)出的其他成分缺乏已知含量的法定對(duì)照品,對(duì)水溶性較大成分的轉(zhuǎn)移情況分析有待于進(jìn)一步研究。根據(jù)PCA結(jié)果可知,從半邊蓮飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑,共有峰的相對(duì)峰面積產(chǎn)生明顯變化,OPLS-DA共找到5個(gè)相對(duì)峰面積變化較為顯著的色譜峰,分別為峰9、峰7、峰5、峰4和峰1,考慮與各共有峰所代表的化學(xué)成分的轉(zhuǎn)移率差異有關(guān)。

本次研究,以標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率、浸出物、指紋圖譜、有效成分的含量及轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo),分析半邊蓮飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞過(guò)程,為半邊蓮配方顆粒及其相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。