UPLC-QE-MS結(jié)合UPLC表征綠萼梅不同發(fā)育時(shí)期的成分差異及抗氧化活性研究

吳 瑞,楊亞湉,錢程程,張 偉,2,歐金梅,2,3*

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥230012;3道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100700

綠萼梅為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花蕾,作為常用中藥收錄于2020年版《中國藥典》[1]中,具有疏肝和中、化痰散結(jié)的功效,常用于治療肝胃氣痛、郁悶心煩、瘰疬瘡毒等病癥。古籍記載和現(xiàn)代研究均認(rèn)為梅花以“綠萼”入藥優(yōu)良[2,3],其特點(diǎn)是花萼灰綠色、花瓣黃白色,氣味清香,臨床療效較好。作為藥食同源藥材[4],綠萼梅還可用來做茶葉、糕點(diǎn)等食品,且其凜冬開放,清新淡雅,被列為名花之首,具有很高的觀賞價(jià)值,綠萼梅的綜合應(yīng)用越來越受到關(guān)注[5]。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)梅花的化學(xué)成分和藥理作用開展大量研究[6,7]。以綠原酸為代表的苯丙素類成分及黃酮類成分為梅花藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[8,9],其抗氧化[10]、抗血小板凝集[11]、抗黑色素生成[12]及抗抑郁[8]等作用被廣泛報(bào)道。近年來,梅花中的類黃酮因具有抗氧化、抗抑郁等作用而受到越來越多的關(guān)注[13-15]。綠原酸及異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、金絲桃苷、蘆丁等黃酮類化合物已從梅花中分離鑒定[16]。然而,關(guān)于綠萼梅中的整體化學(xué)成分組成鮮有報(bào)道,阻礙了其次生代謝產(chǎn)物的深入研究與開發(fā)。

藥用植物的次生代謝產(chǎn)物具有多種生物活性,是藥材發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。研究發(fā)現(xiàn),植物的不同生長和發(fā)育階段是影響植物中次生代謝產(chǎn)物積累的重要因素[18]。尤其對(duì)于花類藥材來說,采收時(shí)期可顯著影響其次生代謝產(chǎn)物的積累[19-21]。為研究不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅花器官中化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及抗氧化活性差異,首先采用超高效液相色譜-四級(jí)桿靜電場軌道阱質(zhì)譜法(UPLC-QE-MS)進(jìn)行定性分析,明確綠萼梅的化學(xué)組成;通過紫外-可見分光光度法對(duì)3個(gè)發(fā)育時(shí)期共18批綠萼梅樣品的總黃酮和總苯丙素含量進(jìn)行測定;進(jìn)一步采用超高效液相色譜法(UPLC)對(duì)綠萼梅樣品中8個(gè)指標(biāo)性成分(新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷)進(jìn)行含量測定,比較不同發(fā)育時(shí)期中8個(gè)成分的含量差異;采用DPPH法測定抗氧化活性,將總成分及指標(biāo)性成分含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果為明確不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅化學(xué)成分及活性的差異,確定綠萼梅藥材的最佳采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Vanquish超高效液相色譜、Orbitrap Exploris 120高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);ACQUITY H-CLASS型超高效液相色譜儀(美國Waters公司);METASH UV-8000紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司);AB135-S型十萬分之一天平(梅特勒-托利多有限公司);AS20500BDT超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);Heraeus Fresco17離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司);明澈D24 UV純水儀(Merck Millipore)。

對(duì)照品新綠原酸(批號(hào)MUST-21030108)、綠原酸(批號(hào)MUST-21070910)、咖啡酸(批號(hào)MUST-18032003)、蘆丁(批號(hào)MUST-21011510)、異綠原酸B(批號(hào)MUST-21030602)、槲皮苷(批號(hào)MUST-17120503)均購自成都曼斯特生物科技有限公司;金絲桃苷(批號(hào)DST201013-023)購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司;異槲皮苷(批號(hào)CFN9875)購自武漢天植生物技術(shù)有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。抗壞血酸(批號(hào)20150617,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);DPPH試劑(批號(hào)C11753367,上海麥克林生化科技股份有限公司);甲醇和乙腈為質(zhì)譜級(jí)(CNW Technologies);甲酸為質(zhì)譜級(jí)(美國Sigma公司);水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)材料

本研究樣品采自安徽省廬江縣金盆山梅花種植基地,由歐金梅教授鑒定為薔薇科李屬綠萼梅的花。根據(jù)梅花的不同發(fā)育時(shí)期,分別于2022年1月15日(花蕾期,HL)、2022年1月20日(半開期,BK)、2022年1月25日(全開期,QK)采集新鮮樣品。將不同批次綠萼梅樣品真空冷凍干燥,放入干燥器中保存?zhèn)溆?。來源信息見?。

表1 18批綠萼梅樣品信息

1.3 UPLC-QE-MS定性分析

1.3.1 供試品溶液的制備

將綠萼梅樣品真空冷凍干燥,用研磨儀研磨至粉末狀。稱取100 mg粉末,加入500 μL提取液(80%甲醇)溶解,渦旋30 s,45 Hz勻漿4 min,冰水浴超聲1 h,靜置后離心(12 000 r/min,4 ℃)15 min,取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,即得。每個(gè)樣本各取100 μL混合成質(zhì)控樣本(quality control,QC)。

1.3.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱,流動(dòng)相0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?～11 min,85%→25%A;11～12 min,25%→2%A;12～14 min,2%A。體積流量0.5 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜儀能夠在控制軟件(Xcalibur,Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScan-ddMS2功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下:鞘氣體流量:35 Arb,輔助氣體流量:15 Arb,離子傳輸管溫度:350 ℃,蒸發(fā)器溫度:350 ℃,全MS分辨率:60 000,MS/MS分辨率:15 000,碰撞能量:16/32/48(在NCE模式下)噴霧電壓:5.5 kV(正離子)或-4 kV(負(fù)離子)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

將采集所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1軟件,獲取匹配和對(duì)齊的峰值數(shù)據(jù),Excel軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后導(dǎo)入SIMCA-P 14.1,再進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。根據(jù)變量投影重要性指標(biāo)(variable importance in projection,VIP)≥1,P<0.05篩選潛在的差異代謝物。通過SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)將各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 總黃酮及總苯丙素的含量測定

1.4.1 供試品溶液的制備

精密稱取綠萼梅樣品粉末約0.5 g(過四號(hào)篩),置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(250 W,40 kHz)45 min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.4.2 總黃酮的含量測定

以蘆丁為對(duì)照品,采用亞硝酸鈉-三氯化鋁法[22],510 nm處測定吸光值,繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。取2 mL供試品溶液,同法顯色,由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(Y=0.011X-0.007 3,r=0.999 0)計(jì)算供試品溶液中總黃酮含量。綠萼梅樣品中總黃酮的含量按公式(1)計(jì)算。

含量=

[(c1×n×V1)/(c2×V2×103)]×100%

(1)

式中,n:稀釋倍數(shù);c1:供試品溶液中活性成分(總黃酮、總苯丙素)的濃度,μg/mL;c2:供試品溶液的濃度,mg/mL;V1:反應(yīng)體系總體積,mL;V2:測定含量時(shí)所需供試品溶液的體積,mL。

1.4.3 總苯丙素的含量測定

以綠原酸為對(duì)照品,參照文獻(xiàn)測定方法[23],330 nm處測定吸光值,繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL供試品溶液,同法顯色,由綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(Y=0.051 6X+0.000 3,r=0.999 9)計(jì)算供試品溶液中總苯丙素含量。

1.5 UPLC定量分析指標(biāo)性成分

1.5.1 色譜條件

色譜柱選用Waters-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫(0～6 min,10%→17% A;6～12 min,17% A;12～20 min,17%→40% A),流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量2 μL,柱溫30 ℃,檢測波長355 nm。

1.5.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷對(duì)照品適量,加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.404、1.256、0.316、0.692、0.432、0.524、0.390、0.354 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.5.3 供試品溶液的制備

精密稱取綠萼梅樣品粉末約0.5 g(過四號(hào)篩),置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(250 W,40 kHz)45 min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.5.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.4.1 線性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品溶液用50%甲醇稀釋成一系列的梯度濃度溶液后,按“1.5.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析,以待測化合物峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸,得到各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品,按“1.5.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷的色譜峰面積并計(jì)算RSD值。

1.5.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取綠萼梅(HL-1)樣品粉末6份,每份0.5 g,按“1.5.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按“1.5.1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣測定,記錄新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷的色譜峰面積,計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD值。

1.5.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一綠萼梅供試品(HL-1)溶液,分別于配制后0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣測定,按“1.5.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷的色譜峰面積并計(jì)算RSD值。

1.5.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的綠萼梅(HL-1)樣品粉末0.05 g,平行6份,分別加入適量的新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷對(duì)照品溶液,按“1.5.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,進(jìn)樣分析,記錄各化合物的峰面積,計(jì)算各成分的含量。

1.5.5 樣品含量測定

按照“1.5.3”項(xiàng)下方法制備18批綠萼梅樣品溶液,按“1.5.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定,分別測定新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷的含量。

1.6 DPPH法測定不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅的抗氧化活性

1.6.1 DPPH·乙醇溶液的制備

精密稱取DPPH粉末3.94 mg,置于100 mL量瓶中,加95%乙醇定容至刻度,搖勻,超聲30 min,即得0.10 mmol/L DPPH·乙醇溶液。避光,備用。

1.6.2 供試品溶液的制備

按照“1.5.3”項(xiàng)下方法制備18批綠萼梅樣品母液(10 mg/mL),加入50%甲醇依次稀釋制成藥材濃度分別為5.00、2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020 mg/mL的待測溶液。

1.6.3 陽性對(duì)照溶液的制備

精密稱取抗壞血酸(Vc)粉末0.1 g,加入50%甲醇10 mL,制得Vc母液(10 mg/mL),加入50%甲醇依次稀釋制成質(zhì)量濃度分別為5.00、2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020 mg/mL的Vc 50%甲醇溶液。避光,備用。

1.6.4 測定方法

取0.10 mmol/L DPPH·乙醇溶液3 mL,置10 mL具塞試管中,分別加入不同濃度的樣品溶液0.5 mL,搖勻,充分反應(yīng)60 min,置紫外-可見分光光度計(jì)中,于517 nm波長處測定吸光度,按下列公式計(jì)算清除率。

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(2)

式中,Ai為樣品組的吸光度;Aj為空白組的吸光度(以3 mL 95%乙醇與0.5 mL 50%甲醇溶液混合物為空白組);A0為對(duì)照組的吸光度(以50%甲醇溶液代替樣品溶液)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物的統(tǒng)計(jì)分析

分別從正負(fù)離子模式的QC樣本中隨機(jī)選取6個(gè)特征離子,計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD),對(duì)分析方法與儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示保留時(shí)間的RSD為0.11%～0.47%,峰面積的RSD為0.96%～3.25%,表明儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好,所采集數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步分析。共檢測了328種代謝物,包括67種黃酮類化合物、50種苯丙素類化合物、104種萜類化合物、26種酚類化合物、24種生物堿、11種有機(jī)酸及其衍生物、8種氨基酸衍生物及其他38種代謝物(見圖1A)。綠原酸及某些黃酮類物質(zhì)(如金絲桃苷、異槲皮苷)是評(píng)價(jià)梅花是否達(dá)到中藥材標(biāo)準(zhǔn)最基本指標(biāo)[1],且在所鑒定的代謝物中,類黃酮含量較高,因此對(duì)檢測到的類黃酮代謝物的類型進(jìn)行歸類分析。在67種黃酮類化合物中,共有黃酮醇27種,黃酮19種,二氫黃酮12種,異黃酮4種,二氫查爾酮3種,黃烷醇1種,花色素1種(見圖1B)。為了進(jìn)一步分析不同發(fā)育時(shí)期梅花黃酮類成分與苯丙素類成分的含量變化,通過半定量方法對(duì)其進(jìn)行相對(duì)含量測定(見圖1C)。由圖可明顯看出各類成分的變化趨勢,以綠原酸為代表的苯丙素類成分及黃酮類成分的含量在3個(gè)發(fā)育時(shí)期中均呈下降趨勢。利用GraphPad Prism 8對(duì)圖1C中4種成分進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果表明4種成分在花蕾期與半開期、花蕾期與全開期兩個(gè)比較組中均具有顯著性差異,除金絲桃苷外,其余3種成分差異極其顯著(P<0.000 1)。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)(A)、黃酮類化合物分類(B)及相對(duì)含量變化(C)Fig.1 Quantitative statistics of metabolites (A),classification of flavonoids (B) and changes in relative content (C) of Mume Flos at different developmental periods注:*P<0.05;**P<0.01;****P<0.000 1。

2.2 總成分的含量測定

不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅總黃酮的含量變化情況見圖2A,總黃酮含量以花蕾期最高,隨著綠萼梅的生長,其花器官中總黃酮含量逐漸降低。由圖可知,總黃酮的含量在三個(gè)發(fā)育時(shí)期中均具有顯著性差異,其中花蕾期與半開期及全開期之間差異極其顯著(P<0.000 1)。綠萼梅樣品中總苯丙素的含量按式(1)計(jì)算,不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅中總苯丙素含量的積累情況與總黃酮相似,隨著生長而逐漸降低(見圖2B)。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅總黃酮(A)及總苯丙素(B)的含量差異分析Fig.2 Difference analysis of the total flavonoid (A) and phenylpropanoid (B) content of Mume Flos in different developmental periods注:*P<0.05;**P<0.01;****P<0.000 1。

2.3 指標(biāo)性成分的含量測定

2.3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1.1 線性關(guān)系考察

各對(duì)照品的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)見表2。r值均大于0.999 0,表明各回歸方程的線性關(guān)系良好。

表2 對(duì)照品的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3.1.2 精密度試驗(yàn)

結(jié)果顯示各成分峰面積的RSD值分別為0.88%、0.38%、1.30%、0.26%、0.15%、0.17%、0.16%、0.13%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果顯示各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.66%、1.67%、1.92%、1.14%、1.26%、1.08%、0.45%、0.85%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果顯示各成分峰面積的RSD值分別為0.95%、1.76%、1.43%、0.13%、0.07%、0.13%、0.07%、0.15%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

結(jié)果見表3,新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷的平均加樣回收率(n=6)分別為100.97%、98.07%、98.10%、100.76%、102.47%、94.68%、102.21%、95.02%,RSD分別為0.67%、2.28%、1.72%、1.51%、1.40%、2.44%、1.41%、1.44%。

表3 加樣回收率試驗(yàn)(n = 6)

2.3.2 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅指標(biāo)性成分的含量

三個(gè)發(fā)育時(shí)期共18批綠萼梅樣品的含量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,結(jié)果見表4。18批樣品的疊加色譜圖見圖3,綠萼梅樣品的對(duì)照圖譜及混合對(duì)照品色譜圖見圖4。

圖3 18批綠萼梅樣品UPLC疊加色譜圖Fig.3 UPLC overlay chromatogram of 18 batches of Mume Flos

圖4 綠萼梅樣品(A)及混合對(duì)照品(B)色譜圖Fig.4 Chromatograms of Mume Flos (A) and mixed reference solution (B)注1.新綠原酸;2.綠原酸;3.咖啡酸;4.蘆丁;5.金絲桃苷;6.異槲皮苷;7.異綠原酸B;8.槲皮苷。Note:1.Neochlorogenic acid;2.Chlorogenic acid;3.Caffic acid;4.Rutin;5.Hyperoside;6.Isoquercitrin;7.Isochlorogenic acid B;8.Quercitrin.

表4 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅藥材中8個(gè)指標(biāo)性成分含量

2.3.3 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅指標(biāo)性成分的比較分析

為進(jìn)一步比較不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅化學(xué)成分的差異,采用主成分分析方法,以所測定的8種指標(biāo)性成分的含量作為變量,對(duì)3個(gè)發(fā)育時(shí)期共18批綠萼梅樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示KMO值為0.669,代表各變量相關(guān)性較好,以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn),可提取出兩個(gè)主成分,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)96.712%,能基本反映出樣本的主要信息。主成分分析得分圖見圖5,由得分圖可知,不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅樣品分別集中于相應(yīng)區(qū)域,提示不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅樣品在化學(xué)成分的量上存在一些差異性。在主成分分析提取到的兩個(gè)主成分的基礎(chǔ)上,建立監(jiān)督模式偏最小二乘判別分析模型,進(jìn)一步尋找不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅的差異標(biāo)志物。正交偏最小二乘判別分析得分圖見圖6,18批綠萼梅樣品被分為3組,與主成分分析結(jié)果一致,說明不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅化學(xué)成分的含量存在一定差異。變量重要性投影值(VIP)圖見圖7,篩選出貢獻(xiàn)率較大的1個(gè)變量(VIP>1)為綠原酸,說明不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅的化學(xué)成分差異是由該成分引起的,綠原酸可以作為不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅之間的差異標(biāo)志物。

圖5 18批綠萼梅樣品主成分分析得分圖Fig.5 The PCA score plot of 18 batches of Mume Flos

圖6 18批綠萼梅樣品OPLS-DA得分分布圖Fig.6 The OPLS-DA score plot of 18 batches of Mume Flos

圖7 18批綠萼梅樣品OPLS-DA的VIP圖Fig.7 VIP value from OPLS-DA load diagram of 18 batches of Mume Flos

進(jìn)一步分析與比較不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅樣品中黃酮類和苯丙素類成分含量變化及差異性,利用GraphPad Prism 8對(duì)8種指標(biāo)性成分進(jìn)行單因素方差分析,見圖8?；ɡ倨诤腿_期中8種成分均具有顯著性差異,值得注意的是,除金絲桃苷和異綠原酸B之外,其余6種成分差異極顯著(P<0.001)。對(duì)于花蕾期與半開期,除金絲桃苷和異綠原酸B之外,其余6種成分均具有顯著性差異?？Х人岷徒鸾z桃苷在半開期與全開期之間無差異性,其余成分均具有顯著性差異,其中蘆丁差異極顯著。可以看出,花蕾期與全開期之間具有顯著的差異性,成分含量差異較大,與總黃酮和總苯丙素的含量變化趨勢一致,提示綠萼梅藥材應(yīng)該在開花以前采收。

圖8 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅黃酮類和苯丙素類成分的含量差異分析Fig.8 Difference analysis of the content of flavonoids and phenylpropanoids in different developmental periods of Mume Flos注:A.新綠原酸;B.綠原酸;C.咖啡酸;D.蘆丁;E.金絲桃苷;F.異槲皮苷;G.異綠原酸B;H.槲皮苷;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1。Note:A.Neochlorogenic acid;B.Chlorogenic acid;C.Caffic acid;D.Rutin;E.Hyperoside;F.Isoquercitrin;G.Isochlorogenic acid B;H.Quercitrin;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1.

2.4 不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅的抗氧化活性

不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅樣品的DPPH清除率見圖9,各發(fā)育時(shí)期的抗氧化活性呈濃度依賴性,隨著濃度的增大,綠萼梅各時(shí)期樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力隨之增強(qiáng)。將計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0計(jì)算自由基清除率的半最大效應(yīng)濃度(EC50),結(jié)果表明抗壞血酸的EC50為0.020 mg/mL,與文獻(xiàn)報(bào)道EC50值接近[24]。各樣品抗氧化活性EC50見表5。將各發(fā)育時(shí)期EC50進(jìn)行單因素方差分析,比較各時(shí)期抗氧化差異,結(jié)果表明不同發(fā)育時(shí)期中全開期的抗氧化活性最低,與總成分及指標(biāo)性成分含量測定結(jié)果一致。三個(gè)發(fā)育時(shí)期之間的抗氧化活性具有顯著性差異,其中花蕾期與全開期的抗氧化活性差異極顯著(P<0.001)。

圖9 不同質(zhì)量濃度樣品與抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging of DPPH free radicals by samples of different mass concentrations and vitamin C

表5 綠萼梅不同發(fā)育時(shí)期DPPH自由基清除能力的

將18批樣品抗氧化活性EC50值、總黃酮、總苯丙素及8個(gè)指標(biāo)性成分的含量導(dǎo)入TBtools軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果見圖10。由圖可知,DPPH自由基清除率EC50值與總黃酮、總苯丙素及8個(gè)指標(biāo)性成分存在明顯的負(fù)相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)分別為-0.69、-0.81、-0.66、0.80、-0.62、-0.82、-0.75、-0.88、-0.56、-0.77。結(jié)果表明,綠萼梅中總黃酮、總苯丙素及8個(gè)指標(biāo)性成分可作為評(píng)價(jià)其抗氧化活性的指標(biāo)。

圖10 綠萼梅主要成分與抗氧化活性相關(guān)性Fig.10 Correlation between the main components and antioxidant activity of Mume Flos注:A.總黃酮;B.總苯丙素;C.新綠原酸;D.綠原酸;E.咖啡酸;F.蘆丁;G.金絲桃苷;H.異槲皮苷;I.異綠原酸B;J.槲皮苷;K.DPPH EC50。Note:A.Total flavonoids;B.Total phenylpropanoids;C.Neochlorogenic acid;D.Chlorogenic acid;E.Caffic acid;F.Rutin;G.Hyperoside;H.Isoquercitrin;I.Isochlorogenic acid B;J.Quercitrin;K.DPPH EC50.

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-QE-MS法共檢測出綠萼梅中的328種次生代謝產(chǎn)物,以黃酮類和苯丙素類成分占比較高,分別有67、50種化合物,其中黃酮類化合物中以黃酮醇類占比最高,作為梅花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的金絲桃苷、異槲皮苷等成分均屬于該類物質(zhì),且有研究發(fā)現(xiàn)黃酮醇在花器官發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用[25,26];花色素類僅檢測出一種成分,可能與綠萼梅花色白有關(guān)[27]。

進(jìn)一步比較不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅的成分變化,結(jié)果顯示總黃酮、總苯丙素成分在花蕾期含量最高,并隨著花的開放程度呈逐漸下降趨勢。8個(gè)指標(biāo)性成分(新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異綠原酸B、槲皮苷)的含量測定結(jié)果表明,花蕾期與全開期之間成分具有顯著差異性,以新綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷差異極其顯著(P<0.000 1);化學(xué)計(jì)量學(xué)分析表明3個(gè)時(shí)期綠萼梅的化學(xué)成分含量具有一定差異性,綠原酸可作為其差異質(zhì)量標(biāo)志物。綜合來看,花蕾期的綠萼梅在化學(xué)成分含量與抗氧化活性方面均占優(yōu)勢,與半開期和全開期差異顯著,藥材的采收時(shí)期應(yīng)盡量控制在花蕾期。

綜上,本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-QE-MS結(jié)合UPLC法對(duì)不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅進(jìn)行定性定量分析,表征不同發(fā)育時(shí)期綠萼梅的化學(xué)成分組成及差異,并通過DPPH法比較其抗氧化活性差異,為綠萼梅化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及藥材最佳采收時(shí)期提供科學(xué)依據(jù)。